CC BY
47
7. Методические указания № 2.3.7.1064-01 от 24.07.2001. Контроль программы профилактики йоддефицитных заболеваний путем всеобщего йодирования соли. М.; 2001.
8. Доценко В.А., Мосийчук Л.В. История основания и развития кафедры гигиены питания и диетологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии имени И.И. Мечникова. Профилактическая и клиническая медицина. 2011; (1): 180-8.
References
1. Gorbachev V.V., Gorbacheva V.N. Vitamins, Micro and Macro Elements: Handbook [Vitaminy, mikro i makroelementy: Sprav-ochnik]. Minsk: Knizhnyy dom «Interpreservis»; 2002.
2. Dotsenko V.A. Theoretical and practical problems of nutrition of healthy and sick person. Voprosy pitaniya. 2004; (6): 36-9. (in Russian)
3. Borovikov V.P. STATISTICA: the Art of Data Analysis on the Computer Professionals [STATISTICA: iskusstvo analiza dan-
Hygiene & Sanitation (Russian Journal). 2016; 95(5)
_DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-5-483-490
OriglnaTartiCie
nykh na komp'yutere dlyaprofessionalov]. St. Petersburg: Piter; 2001. (in Russian)
4. Dotsenko V.A., Kononenko I.A. Hygienic and dietary assessment of the new types of bread. Profilakticheskaya i kliniches-kaya meditsina. 2012; (1): 106-10. (in Russian)
5. Tutel'yan V A., Samsonov M.A., eds. Handbook of Nutrition [Spra-vochnikpo dietologii]. Moscow: Meditsina; 2002. (in Russian)
6. Tutel'yan V.A. Clinical Nutrition: Modern Approaches to Standardization of Diet Therapy [Lechebnoe pitanie: sovremennye podkhody k standartizatsii dietoterapii]. Moscow: Meditsina; 2007. (in Russian)
7. Guidelines № 2.3.7.1064-01 on 07.24.2001. The control of iodine deficiency disorders prevention programs through universal salt iodization. Moscow; 2001. (in Russian)
8. Dotsenko V.A., Mosiychuk L.V. History of foundation and development of the department of hygiene nutrition and dietology St. Petersburg State Medical Academy named after I.I. Mechnikov. Profilakticheskaya i klinicheskaya meditsina. 2011; (1): 180-8. (in Russian)
Поступила 02.02.15 Принята к печати 04.06.15
Методы гигиенических исследований
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 614.777:579.842.14.083.12
Рахманин Ю.А, Журавлев П.В., Алешня В.В., Панасовец О.В.
ПРИМЕНЕНИЕ НОВОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ САЛЬМОНЕЛЛ ИЗ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭПИДЕМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ВОДОПОЛЬЗОВАНИЯ
1ФГБУ «НИИ экологии и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» Минздрава России, 119992, Москва; 2ФГУН «РостовНИИМП» Роспотребнадзора, 344000, Ростов-на-Дону
Разработана жидкая среда накопления для выделения бактерий рода Salmonella из водных объектов (среда РНС), обеспечивающая накопление сальмонелл разных серологических групп, подавляющая рост сопутствующей микрофлоры, позволяющая получать объективную информацию о степени бактериологического загрязнения водных объектов. Среда представляет собой раствор для микробиологических целей, который получают путем смешивания компонентов с последующей фильтрацией и стерилизацией. Экспериментальным путем подобраны оптимальные соотношения ингредиентов питательной среды: экстракт кормовых дрожжей в количестве 4,5-5,0 г/л, едкого натра 1,3—1,4 г/л, калия фосфорно-кислого 8,6-8,8 г/л. Питательная среда представляет собой стерильную, прозрачную жидкость зеленого цвета, рН среды от 6,4 до 6,8, аминный азот — от 0,05 до 0,1%. Сконструированная среда накопления чувствительна — обеспечивает рост тест-штаммов сальмонелл при посеве единичных клеток, чем выгодно отличается от аналогичных сред, применяемых в практике здравоохранения в настоящее время. Наименьшее время для накопления биомассы сальмонелл составляет 6 ч, оптимальное время — 24 ч. Инкубация посевов производится при температуре 37°С. Культуры сальмонелл при посеве в разработанную среду сохраняют свои биологические свойства. Разработанная среда по чувствительности превосходит среды магниевую и селенитовую.
Ключевые слова: сальмонеллы, среда накопления, некультивируемые формы.
Для цитирования: Рахманин Ю.А, Журавлев П.В., Алешня В.В., Панасовец О.В. Применение новой питательной среды для выделения сальмонелл из водных объектов для оценки эпидемической безопасности водопользования. Гигиена и санитария. 2016; 95 (5): 483-490. DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-5-483-490
Rakhmanin Yu.A1, Zhuravlev P. V2, Aleshnya V.V.2, Panasovets O.V.2
APPLICATION OF THE NEW CULTURE MEDIUM FOR THE ISOLATION OF SALMONELLA FROM WATER BODIES TO ASSESS THE EPIDEMIC SAFETY OF WATER USE
'A.N.Sysin Research Institute of Human Ecology and Environmental Health, Moscow, 119992, Russia Federation; 2Rostov Research Institute of Microbiology and Parasitology, Rostov-on-Don, 344000, Russian Federation
There was developed a liquid storage medium for the isolation of bacteria of genus Salmonella from water bodies (The culture medium for the accumulation of Salmonella, ready to use, "RNS"), providing the accumulation of Salmonella from different serogroups, inhibiting the growth of accompanying microflora, allowing to obtain objective information
дигиена и санитария. 2016; 95(5)
DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-5-483-490_
Оригинальная статья
about the extent of bacterial contamination of water bodies. Medium is by nature of a solution for microbiological purposes which is produced by mixing the components with consequentfiltration and sterilization. In an experimental way there were chosen optimal ratios of the nutrient medium ingredients: extract offodder yeast in an amount of 4.55.0 g/l, sodium hydroxide - to 1.3-1.4 g/l, potassium phosphate - 8.6-8.8 g/l. The medium is a sterile, clear liquid, green in color, medium pH is 6.4 to 6.8, amine nitrogen - from 0.05 to 0.1%. Designed medium for accumulation is sensitivity, it ensures the growth of the test strains of salmonella at seeding of single cells in that favorably differs from similar media used in public health practice at the present time. The smallest time for the accumulation of biomass of Salmonella accounts of 6 hours, the optimal time is 24 hours. Incubation of crops is produced at 37 °C. Cultures of Salmonella at seeding in the developed medium retain their biological properties. Developed medium in terms of sensitivity is superior to magnesian and selenite media.
Keywords: Salmonella; storage medium; uncultivated forms.
For citation: Rakhmanin Yu.A, Zhuravlev P.V., Aleshnya V.V., Panasovets O.V. Application of the new culture medium for the isolation of Salmonella from water bodies to assess the epidemic safety of water use. Gigiena i Sanitaria (Hygiene and Sanitation, Russian journal) 2016; 95(5): 483-490. (In Russ.). DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-5-483-490
For correspondence: Piotr V. Zhuravlev, MD, PhD., DSci., Head of the Laboratory of sanitary, microbiological and virological research methods and environmental impact assessment. E-mail: [email protected]
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Funding. The study had no sponsorship. Received 16 October 2015 Accepted 17 November 2015
Введение
Основной целью санитарно-микробиологических исследований объектов водной среды является их гигиеническая оценка с точки зрения инфекционной опасности для человека. Непосредственное обнаружение возбудителей заболеваний достоверно свидетельствует о наличии эпидемической ситуации.
До настоящего времени в действующих нормативных документах общие колиформные бактерии (ОКБ) и термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) определяются в воде водоисточников, питьевой воде и сточных водах как критерии эпидемиологической безопасности в отношении возбудителей ОКИ, передаваемых водным путем. Однако накопленный к настоящему времени опыт расшифровки вспышек водно-обусловленных кишечных инфекций показывает, что одного только определения данных индикаторных микроорганизмов недостаточно [1-7]. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что информативность общепринятых индикаторных показателей в отношении загрязнения водной среды патогенными эн-теробактериями, в частности сальмонеллами, как наиболее устойчивыми из патогенных представителей этого семейства, вызывает сомнение [8-10]. В связи с изложенным, по мнению ряда санитарных бактериологов [11-13], необходимо прямое определение патогенных микроорганизмов, наиболее полно информирующих о степени инфицированности воды и, возможно, связанным с этим обострением эпидемиологической ситуации.
Среди многочисленных возбудителей кишечных заболеваний, связанных с водным фактором передачи, следует отметить микроорганизмы рода Salmonella. По данным ряда авторов [14-16], сальмонеллы обладают большей устойчивостью во внешней среде по сравнению с кишечными палочками. Не всегда
Для корреспонденции: Журавлев Петр Васильевич, зав. лаб. санитарно-микробиологических методов исследования ФГУН «РостовНИИМП» Роспотребнадзора, 344000, Ростов-на-Дону, E-mail: [email protected].
полностью уничтожаются дозами дезинфицирующих средств, используемых для обеззараживания питьевой воды централизованного водоснабжения и сточных вод, а могут переходить в Я-форму. В хлорируемых сточных водах Я-формы сальмонелл составляют до 31% от общего их количества [17, 18]. Сальмонеллы в Я-форме были зарегистрированы А.Г. Бойцовым и О.Н. Ластовка [17] через 7 дней пребывания в воде поверхностных водоемов. В этой форме сальмонеллы утрачивают способность давать рост на питательных средах, обычно используемых для обнаружения сальмонелл в водной среде, но сохраняют свои вирулентные и патогенные свойства [19, 20]. Отсутствие роста может явиться причиной ошибочного вывода об отсутствии сальмонелл в водной среде.
Отмеченные выше обстоятельства указывают на то, что степень эпидемического риска заражения сальмонеллами через воду и осуществление надзора за их циркуляцией в водной среде напрямую связаны с эффективностью методов выделения и идентификации указанных бактерий.
Несомненно, что установление степени эпидемического риска инфицирования сальмонеллами через воду, как и проведение в целом надзора за их циркуляцией в водной среде, напрямую связано с эффективностью соответствующих методов выделения этих возбудителей и их идентификации.
Под воздействием неблагоприятных факторов водной среды и донных отложений (биологических, химических, физических) гибели патогенных энте-робактерий - сальмонелл - может предшествовать сублетальное повреждение микробных клеток [17], проявляющееся во временной утрате их способности к росту на питательных средах, обычно используемых для их обнаружения в водной среде (магниевая, селенитовая, тетратионатная). Вышеперечисленные среды оказывают высокое ингибиторное воздействие на целый ряд сероваров сальмонелл, т.к. составляющие их ингредиенты являются токсичными для сальмонелл, находящихся в сублетальном состоянии [21, 22]. Это является одной из основных
причин низкого уровня их обнаружения в водных объектах практическими лабораториями [23].
Условия пребывания сальмонелл в объектах окружающей среды различны, что определяет специфику методических приемов их обнаружения. При количественном учете сальмонелл прямые посевы исследуемой воды на плотные питательные среды для непосредственного подсчета числа выросших колоний неприемлемы. Это связанно с незначительным уровнем содержания сальмонелл в водных объектах, а также с неблагоприятным воздействием на них водной среды. Поэтому учет возможен только при использовании жидких сред накопления [21]. Селективные свойства таких сред определяются не только условиями, создающимися в них для развития патогенных микроорганизмов, но и степенью подавляющего воздействия на сопутствующую микрофлору.
На сегодняшний день не существует официальной унифицированной методики для выделения сальмонелл из водной среды [23, 24]. В настоящее время при выделении сальмонелл из водных объектов используют следующие среды накопления: тетратионатную среду Мюллера, селенитовую среду Лейфсона и магниевую среду. С целью повышения эффективности их обнаружения рекомендовано одновременно использовать несколько сред накопления с разными селективными и ингибиторными свойствами с последующим пересевом на твердые селективные питательные среды, что не позволяет получить сопоставимые результаты анализов.
Недостатком этих сред является высокое ингиби-торное воздействие к целому ряду сероваров сальмонелл, а также токсичность действия хлористого магния, натрия кислого селенистокислого и тетра-тионата натрия на сальмонеллы, находящиеся в сублетальном состоянии. Например, в тетратионат-ной среде плохо растут S. pullorum, S. suipestifer, S. anatum [21], селенитовая среда является токсичной для сероводородоотрицательных сальмонелл [21]. Магниевая среда, по мнению ряда авторов, считается эффективнее других, но и она является токсичной для ряда сероваров сальмонелл: S. typhi, S. pullorum, S. dublin [21, 25, 26].
Перечисленные недостатки существующих сред обогащения являются одной из основных причин низкого уровня обнаружения сальмонелл в водных объектах практическими лабораториями, что препятствует объективной санитарно-эпидемической оценке водоисточника. Кроме того, данные среды имеют сложный состав, в который входят дорогостоящие компоненты, что влечет за собой повышение стоимости анализов, требует увеличения количества лабораторной посуды, затрат времени и труда персонала.
Учитывая вышесказанное, очевидно, что одной из наиболее актуальных задач современной санитарной бактериологии является создание и разработка эффективной, экономичной и легко воспроизводимой в условиях практических лабораторий питательной среды, включающей компоненты отечественного производства, стабильной при хранении, не требу-
Hygiene & Sanitation (Russian Journal). 2016; 95(5)
_DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-5-483-490
Original article
ющей корректировки рН, добавления ex tempore дополнительных ингредиентов, простой в изготовлении.
Материал и методы
Изучали бактериальный состав воды открытых водоемов Ростовской области и сточных вод городских канализаций.
При изучении бактериального состава воды открытых водоемов учитывались точки отбора (зоны рекреации, места водозаборов, районы выпусков канализаций). Бактериальный состав сточных вод канализационных систем определялся на этапах очистки и перед выпуском в водоем.
В натурных условиях исследовано 1800 проб воды, в экспериментальных условиях - 1200 проб. Всего проведено 25 000 определений.
Для выделения и количественного учета сальмонелл использовали разработанную нами «Питательную среду для накопления сальмонелл, готовую к применению» (ТУ 9385-001-01898776-2008, РУ № ФСР 2009/05759 от 29.09.2009), магниевую и селенитовые среды, с дальнейшим пересевом на плотные дифференциально-элективные среды, используемые на втором и третьем этапах исследования, согласно Методическим рекомендациям «Использование готовой к применению питательной среды для выделения сальмонелл из водных объектов», Ростов-на-Дону, 2012 [27].
Результаты
Среда должна обеспечивать накопление сальмонелл разных серологических групп и подавлять рост сопутствующей микрофлоры, что позволяет получать объективную информацию о степени бактериологического загрязнения водных объектов.
Вновь разработанная жидкая среда накопления для выделения бактерий рода Salmonella из водных объектов (среда РНС) представляет собой стерильную, прозрачную жидкость зеленого цвета, рН среды от 6,4 до 6,8, аминный азот - от 0,05 до 0,1%.
В процессе работы экспериментальным путем были подобраны оптимальные соотношения ее основных ингредиентов. При определении влияния экстракта кормовых дрожжей (ЭКД), едкого натра и калия фосфорнокислого однозамещенного на рост тест-штамма S. typhimurium № 9640, S. enteritidis и S. derby установлено, что оптимальным соотношением является содержание в среде ЭКД в количестве 4,5-5,0 г/л, едкого натра 1,3-1,4 г/л, калия фосфор-но-кислого 8,6-8,8 г/л.
Сконструированная профильтрованная и стерилизованная среда накопления чувствительна - обеспечивает рост тест-штаммов сальмонелл при посеве единичных клеток, чем выгодно отличается от аналогичных сред, применяемых в практике здравоохранения в настоящее время.
Наименьшее время, которое требуется для накопления биомассы сальмонелл, составляет 6 ч, оптимальное время - 24 ч инкубации при температуре 37°С. Культуры сальмонелл при посеве в разрабо-
дигиена и санитария. 2016; 95(5)
DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-5-483-490
Оригинальная статья
Таблица 1
Сравнительная чувствительность различных сред накопления для сальмонелл
Тест-штамм Среда РНС Магниевая среда Селенитовая среда
разведения
10-6 10-7 10-8 10-6 10-7 10-8 10-6 10-7 10-8
S. typhi № 1196 +
S. paratyphi B № 8006 + + + + + - + + -
S. typhimurium № 9640 + + + + + + + - -
S. typhimurium spp. + + + + + + + + -
S. derby spp. + + + + + + + + -
S. enteritidis spp. + + - - - - + + -
Примечание: + сплошной рост, - рост отсутствует.
танную среду сохраняли свои биологические свойства.
В ходе экспериментальных исследований установлено, что разработанная среда по чувствительности превосходит среды сравнения - магниевую и селенитовую (табл. 1).
Данные об эффективности накопления тест-штаммов сальмонелл с помощью разработанной среды и сред сравнения (магниевой и селенитовой) представлены в табл. 2. Из приведенных в ней данных следует, что накопление биомассы сальмонелл на среде РНС превысило посевную дозу в 107-108 раз. Магниевая среда уступает по эффективности накопления некоторых сероваров сальмонелл в 1,5-5 раз.
Показатель эффективности с использованием селенитовой среды незначительный и не превысил посевную дозу более чем в 35,5 раз. При этом накопление биомассы было больше с применением предлагаемой среды накопления для S. paratyphi B 506 в 8 • 104 раза, S. typhimurium 301 - в 2 • 106 раз. Рост S. typhimurium 9640, S. typhimurium spp, S. anatum spp и S. paratyphi B 8006 в этих же условиях инкубации при использовании селенитовой среды отмечен не был, в то время как при использовании среды РНС согласно ТУ 9385-00101898776-2008 отмечено накопление данных штаммов сальмонелл.
Ингибирующие свойства среды РНС в отношении сопутствующей микрофлоры определяли с применением тест-штамма E. coli № 3912/41 (О55:К59). Разработанная среда по ингибирующим свойствам соответствует требованиям ТУ 9385-001-018987762008: должна подавлять рост тест-штамма E. coli № 3912/41 (О55:К59) не менее чем в 100 раз через 22 ± 2 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С.
Кроме того, при изучении ингибирующих свойств среды на чистых культурах как музейных, так и выделенных из воды, получены следующие данные: предлагаемая среда полностью подавляла рост всех тест-штаммов: E. coli № 3912/41, E. coli, K. pneumoniae, Sh. flexnery 2 a № 170, E. faecalis, S. aureus № 6538-pATCC при дозах инфицирования 1000 КОЕ/мл.
В натурных условиях исследовано 109 проб речной воды. При этом с применением среды РНС сальмонеллы были обнаружены в 93,6%, тогда как при использовании магниевой среды - в 70,6%, селенитовой - в 25,7% со средними индексами 501,8 ± 78,8, 21,1 ± 6,2 и 9,4 ± 2 КОЕ/л соответственно (см. рисунок). Различия количественного содержания сальмонелл в 1 л при использовании РНС и магниевой, РНС и селенитовой сред были существенными и статистически достоверными (t = 4,9, p < 0,001; t = 5,2, p < 0,001 соответственно).
Пейзаж выделенных сероваров сальмонелл был разнообразнее с использованием среды РНС: в целом по водоему выделено 57 сероваров, что составляет 53,7% от общего количества сероваров, 34 - при посеве в магниевую среду накопления (32,1%) и 15 - в селенитовую среду (14,2%) (см. рисунок). На изучаемом участке водоема при использовании среды РНС выделено 342 культуры, магниевой среды - 141 и селенитовой 37. Чаще других из речной воды выделяли следующие серовары: S. derby, S. typhimurium, S. essen, S. kimuenza, S. brandenburg с применением разработанной среды, S. derby, S. heidelberg, S. brandenburg - с использованием магниевой и селенитовой сред.
Аналогичные данные получены при исследовании воды водохранилища (45 проб). При использовании магниевой среды сальмонеллы выделены в 32% проб со средним индексом 5,6 ± 1,4 КОЕ/л. Сальмо-
Таблица 2
Эффективность накопления сальмонелл на различных питательных средах (посевная доза 10 КОЕ/мл)
Среда РНС Магниевая среда Селенитовая среда РНС и магниевая среды РНС и селенитовая среды
Тест-штамм Количество сальмонелл (КОЕ/л)
M1 ± m1 M2 ± m2 М3 ± т3 n t p n t p
S. paratyphi B № 506 3 • 107± 5 106 1 • 105 ± 1 • 104 355,6 ± 22,4 9 2,5 < 0,02 9 5,1 < 0,001
S. paratyphi B № 8006 6 • 108± 3 107 1 • 105 ± 1 • 104 рост отсутствует 9 17,9 < 0,001 - - -
S.typhimurium № 301 3 • 108± 2 107 1 • 107± 1 • 106 185,6 ± 5,7 9 4,1 < 0,001 9 10,2 < 0,001
S. typhimurium № 9640 3 • 107± 4 106 9 • 106 ± 4 • 105 рост отсутствует 9 4,3 < 0,001 - - -
S. typhimu-rium spp. 1 • 107± 3 106 3 • 106 ± 5 • 105 рост отсутствует 9 2,5 < 0,001 - - -
S. anatum spp. 2 • 109± 4 108 4 • 108± 3 • 107 рост отсутствует 9 3,6 < 0,001 - - -
S. derby spp. 7 • 107± 8 106 1 • 106 ± 2 • 105 рост отсутствует 9 8,0 < 0,001 - - -
Hygiene & Sanitation (Russian Journal). 2016; 95(5)
_DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-5-483-490
Original article
Частота выделения сальмонелл
93,6%
Количество сальмонелл в 1 л воды
501,8
70,6%
25,7% 1
ш ш 9,4 21,1
Частота выделения сероваров сальмонелл
32,1%
14,2%
| | Предлагаемая среда Магниева среда Щ Селенитовая среда
Сравнение различных сред накопления при выделении сальмонелл из воды речной воды.
неллезный пейзаж представлен лишь 9-ю серовара-ми (наиболее часто регистрировались S. enteritidis -30,7%, S. typhimurium - 25,6%, S. derby - 12,8%, S. virchow - 10,2%, S. infantis - 5,1%). В то же время с применением разработанной среды РНС сальмонеллы выделены в среднем по водоему в 50,7% проб 25-ти сероваров со средним индексом 69,7 ± 3,3 КОЕ/л. Чаще других выделялись S. typhimurium -28%, S. enteritidis - 25,5%, S. derby - 19%, S. essen - 11%, S. london - 10%, S. infantis - 5,5%.
Исследовано также 56 проб хозяйственно-бытовых сточных вод городов N и M на разных этапах очистки. При исследовании воды горканализации города N в целом положительными на сальмонеллы, оказались 100% проб - разработанная среда, 84,4% -магниевая и 18,8% - селенитовая. При этом средний индекс сальмонелл составил 6016 ± 3310 КОЕ/л при использовании среды РНС, 202 ± 64 КОЕ/л - магниевой и лишь 3,4 ± 1,2 КОЕ/л - селенитовой (различия между количественным содержанием сальмонелл в 1 дм3 исследуемой воды существенны и статистически достоверны: t = 1,9, p < 0,05; t = 1,8, p < 0,05 соответственно).
При исследовании воды горканализации города М сальмонеллы в среднем выделены в 83,3% проб с использованием среды РНС в 66,6% и 33,3% - магниевой и селенитовой соответственно. При этом средний индекс сальмонелл составил 1381 ± 460 КОЕ/л при использовании среды РНС, 65 ± 22 КОЕ/л - магниевой и лишь 6 ± 2,1 КОЕ/л -селенитовой (различия между количественным содержанием сальмонелл в 1 дм3 исследуемой воды существенны и статистически достоверны: t = 2,7, p < 0,001; t = 2,6,p < 0,001 соответственно).
В сточных водах, отобранных до очистки, сальмонеллы были обнаружены в 100% проб с использованием РНС и магниевой сред, тогда как с использованием селенитовой - лишь в 43,8%. Выделено 36 сероваров при использовании среды РНС, 18 - магниевой и 8 - селенитовой средах. Индекс сальмонелл при посеве воды в среду РНС составил 5998 ± 2222 КОЕ/л, в магниевую - 151 ± 50 КОЕ/л, селенитовую -7,2 ± 2,9 КОЕ/л. Различия между количественным содержанием сальмонелл в 1 л исследуемой воды существенны и статистически достоверны: t = 2,6,
p < 0,01; t = 2,7, p < 01, соответственно. При этом со среды РНС выделено 24 серовара сальмонелл, магниевой - 13 сероваров и селенитовой среды - 5.
В сточных водах, прошедших механическую, биологическую очистку и обеззараживание, в 66,7% исследуемых проб с помощью среды РНС были обнаружены сальмонеллы 17 сероваров в количестве 684 ± 297 КОЕ/л. При использовании магниевой среды в 53,3% проб выделены 11 сероваров сальмонелл в количестве 18,5 ± 7 КОЕ/л. С использованием селенитовой среды сальмонеллы обнаружены в 6,7% проб (1 серовар) в количестве 0,4 ± 0,2 КОЕ/л. Различия между количественным содержанием сальмонелл в 1 л исследуемой воды существенны и статистически достоверны: t = 2,2, p < 0,05; t = 2,3, p < 0,05 соответственно.
Всего на разных этапах очистки сточной воды выделено 437 культур бактерий рода Salmonella 47 сероваров. Из них 280 культур при помощи среды РНС, 127 - магниевой и лишь 30 - селенитовой.
Известно, что под воздействием повышенной температуры (56°С) и сочетания воздействия пониженной температуры (6°С) и отсутствия питательных веществ возможен переход бактерий рода Salmonella в некультивируемую форму.
Была изучена возможность реверсии клеток, находящихся в некультивируемой форме, с помощью сред накопления. Полученные результаты показали, что разработанная среда позволяла не только восстанавливать жизнеспособность данных клеток, но и накапливать биомассу. Магниевая и селенитовая среды таким действием не обладали.
Данные по сравнению с восстанавливающей способностью трех сред накопления после воздействия повышенной температуры (56°С), представленные в табл. 3, свидетельствуют о том, что рост тест-штаммов сальмонелл с использованием разработанной среды наблюдался после 4 мин (концентрация 102 КОЕ/мл) прогревания с накоплением биомассы до 106 раз и после 14 мин (концентрация 107 КОЕ/мл) - до 108 раз при отсутствии роста в контроле. Селенитовая и магниевая среды обеспечивали незначительное накопление биомассы лишь в случае присутствия в среде клеток в вегетативном состоянии. Селенитовая среда по-
гиена и санитария. 2016; 95(5)
DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-5-483-490_
Оригинальная статья
Таблица 3
Восстанавливающая способность разных сред накопления при воздействии на культуры тест-штаммов высоких температур (+56 °С) (У. paratyphi B № 8006)
Время прогревания, Количество микроорганизмов (КОЕ/мл) в средах накопления
мин предлагаемой магниевой селенитовой
2 Сплошной рост Сплошной рост 255,6 ± 47,0
3 Сплошной рост 3 • 103 ± 4 • 102 -
4 5 2 • 106 ± 3 • 105 - -
сле 3-х минутного прогревания суспензии клеток (концентрация 102 КОЕ/мл), даже при наличии сальмонелл в вегетативном состоянии, не позволяла их обнаружить. При полном переходе сальмонелл в R-форму их накопление не отмечено ни в магниевой, ни в селенитовой средах.
Аналогичная ситуация наблюдалась и при реверсии клеток сальмонелл, подвергшихся воздействию пониженной температуры и состоянию «голода». После полного перехода сальмонелл в некультивиру-емую форму восстановление свойств было выявлено лишь в разработанной среде (табл. 4). Так, накопление биомассы в 103 раз на предлагаемой среде выявлено уже после того, как в контроле сальмонеллы не регистрировались, на 38-е сутки для S. typhimurium 9640 и на 35-е сутки для S. paratyphi B 8006 (начальная доза заражения 102 КОЕ/мл). Увеличение начальной концентрации клеток сальмонелл до 107 КОЕ/мл приводило к увеличению сроков пребывания их в вегетативном состоянии. В контроле полный переход клеток S. paratyphi B 8006 в Л-форму отмечен на 95-е сутки, а S. typhimurium 9640 - на 108-е сутки. И в этом случае магниевая и селенитовая среды не позволяли обнаружить сальмонеллы, находящиеся в не-культивируемой форме, тогда как предлагаемая среда позволила не только восстановить их свойства, но и накопить до 108 раз. С помощью ПЦР положительный ответ на присутствие сальмонелл в испытуемой взвеси был получен по истечении 6 мес при выдерживании в темноте и при температуре +6°С.
Важно отметить, что культуры сальмонелл, выращенные на предлагаемой среде, после воздействия неблагоприятных факторов имели типичные культу-рально-морфологические, биохимические и серологические свойства исходных культур.
Проведена также серия экспериментов по изучению возможности сохранения Л-формами сальмонелл своих вирулентных свойств. Тест-штаммы (S. paratyphi B № 8006, S. typhimurium № 9640, S. typhimurium), прогретые при температуре 56 оС в течение 14 мин в количестве 107 КОЕ/мл, вводили белым мышам-самцам внутрибрюшинно по 1 мл. Через 24 ч данные тест-штаммы выделены из печени и селезенки животных, что свидетельствует о сохранении НФ сальмонелл своих биологических свойств. В контрольной группе выделение вышеуказанных штаммов не отмечено.
Таблица 4
Восстанавливающая способность разных сред накопления при воздействии на культуры тест-штаммов пониженной температуры (6°С) и недостатка питательных веществ (S. paratyphi B № 8006)
Время, сут Количество микроорганизмов (КОЕ/мл) в средах накопления
предлагаемой магниевой селенитовой
30 Сплошной рост 188,9 ± 17,5 41,1 ± 4,5
33 Сплошной рост - -
35 2 • 103 ± 4 • 102 - -
38 - - -
Обсуждение
Анализируя полученные данные, можно заключить, что факторы, способные приводить бактериальную клетку в некультивируемую форму, разнообразны. При этом клетка сохраняет весь свой биологический потенциал. Многими исследователями доказана возможность существования данных форм микроорганизмов, в частности сальмонелл, в окружающей среде. Используемые в настоящее время среды накопления не способны к выявлению этой группы бактерий, что искажает оценку эпидемической опасности водоисточника. В то же время предлагаемая среда обладает возможностью восстанавливать клетки, находящиеся в некультивируемой форме, повышая тем самым объективность проведения санитарно-эпидемиологического мониторинга за водными объектами.
На среду получен патент № 2312136 от 10.12.2007 г. Среда прошла испытания в ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» и ФГБУ «НИИ ЭЧ и ГОС им. АН. Сы-сина» МЗ РФ по физико-химическим и биологическим показателям. На базе ряда бактериологических лабораторий ФГУЗ Ростовской области проведена апробация питательной среды и методики ее применения для выделения сальмонелл из воды различной степени бактериального загрязнения.
На среду разработана научно-техническая документация (Технические условия, пояснительная записка с таблицами стабильности, Инструкция по применению, Пусковой регламент - ПУР № 1898776-05-2008), согласованная в ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича». Получен сертификат производства «Питательной среды для накопления сальмонелл, готовой к применению» СП № 002778. Получено регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05759 от 29.09.2009. Приказом Росздрава от 29.09.2009 № 7606-Пр/09 «Питательная среда для накопления сальмонелл, готовая к применению» разрешена к производству, продаже и применению на территории Российской Федерации. Разработаны и утверждены МР «Использование готовой к применению питательной среды для выделения сальмонелл из водных объектов», Ростов-на-Дону, 2012 [27]. В настоящее время разработанная среда широко применяется на практике в лабораториях ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области» Ро-спотребнадзора.
Заключение
По сравнению со средами накопления для выделения сальмонелл из воды, которые используются в повседневной практике бактериологических лабораторий, «Питательная среда для накопления сальмонелл, готовая к применению» рекомендуется к широкому применению и обладает следующими преимуществами:
- в среднем в два раза повышает процент выделения сальмонелл и более чем в десять раз - их индекс;
- выявляет более разнообразный пейзаж серова-ров выделенных сальмонелл;
- способствует реверсии клеток, находящихся в R-форме, что позволяет учитывать все формы сальмонелл;
- не требует дополнительных манипуляций при подготовке к посевам;
- состоит из ингредиентов отечественного производства, и ее стоимость не превышает таковую у аналогичных сред.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литература (п.п. 3-7, 13, 16, 18 см. References)
1. Журавлев П.В., Алешня В.В., Панасовец О.П. Оценка микробного риска возникновения бактериальных кишечных инфекций, передаваемых водным путем (на примере городов Ростовской области). Инфекция и иммунитет. 2012; 2 (1-2): 44.
2. Рахманин Ю.А., Недачин А.Е., Талаева Ю.Г., Артемова Т.З., Иванова Л.В., Чугунихина Н.В. и др. Научное обоснование бактериологических критериев оценки качества воды поверхностных источников централизованного питьевого водоснабжения. В кн.: Рахманин Ю.А., ред. Итоги и перспективы научных исследований по проблеме экологии человека и гигиены окружающей среды. М.; 2002: 140-61.
8. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Доскина Т.В. и др. Обоснование микробиологических показателей и критериев оценки качества воды источников питьевого водоснабжения. В кн.: Тезисы 5-го международного конгресса ЭКВАТЕК. М.; 2002: 701-2.
9. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Дмитриева Р.А., Доскина Т.В., Талаева Ю.Г., Иванова Л.В. и др. Проблемы эпидемической безопасности питьевого водопользования населения России. Гигиена и санитария. 2005; (6): 14-8.
10. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Талаева Ю.Г., Иванова Л.В., Загайнова А.В., Колбасникова И.А. и др. Сравнительное значение индикаторных бактерий в оценке потенциальной опасности возникновения кишечных инфекций при питьевом водопользовании. В кн.: Итоги и перспективы научных исследований по проблеме экологии человека и гигиены окружающей среды. М.; 2005: 48-63.
11. Журавлев П.В., Алешня В.В., Панасовец О.П., Морозова А.А., Артемова Т.З., Талаева Ю.Г. и др. Значение глюкозо-положительных колиформных бактерий и потенциально патогенных бактерий как показателей эпидемической безопасности водопроводной воды. Гигиена и санитария. 2013; (1): 56-8.
12. Рахманин Ю.А., Недачин А.Е., Артемова Т.З. и др. Совершенствование микробиологических показателей водоснабжения. В кн.: Материалы IXВсероссийского съезда гигиенистов и санитарных врачей. М.; 2001; том 1: 576-80.
14. Алешня В.В., Журавлев П.В., Головина С.В. и др. Особенности индикаторного значения бактериологических показа-
Hygiene & Sanitation (Russian Journal). 2016; 95(5)
_DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-5-483-490
Original article
телей при оценке качества воды в отношении эпидемической безопасности в условиях зарегулированного водоема. В кн.: Вода: Экология и технология. Сборник материалов 5-го международного конгресса «Экватек- 2002». М.; 2002: 705.
15. Соседова Л.М., Рукавишников В.С. Оценка риска сочетанно-го воздействия биологических и химических факторов окружающей среды на организм человека. Гигиена и санитария. 2010; (5): 75-9.
17. Бойцов А.Г., Ластовка О.Н. Выделение сублетально поврежденных штаммов сальмонелл из воды поверхностных водоемов. Гигиена и санитария. 2003; (3): 76-7.
19. Романова Ю.М., Алексеева Н.В., Гинцбург А.Л. Некультиви-руемое состояние у патогенных бактерий на модели Salmonella typhimurium: феномен и генетический контроль. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997; (4): 35-41.
20. Соколенко А.В. Некультивируемые формы бактерий: распространение в природе, индукторы некультивируемого состояния и реверсии. Современные наукоемкие технологии. 2006; (2): 11-5.
21. Калина Г.П. Сальмонеллы в окружающей среде. М.: Медици-на;1978.
22. Калина Г.П. Методы обнаружения индикаторной, патогенной и потенциально патогенной микрофлоры в объектах окружающей среды в связи с влиянием антропогенных факторов. М.; 1987: 29-38.
23. Захарова Н.Е., Суханова С.М., Беляева Г.А. Сравнительная характеристика отечественных селективных питательных сред для накопления сальмонелл. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2004; (5): 101-3.
24. Бойцов А.Г., Ластовка О.Н., Кашкарова Г.П. Оценка качества воды по биологическим показателям: пути совершенствования (2-е сообщение). Гигиена окружающей и производственной среды. 2004; (1): 86-8.
25. Алешня В.В. Влияние ряда факторов окружающей среды на самоочищение водоема от сальмонелл: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. Ростов-на-Дону; 1979.
26. Панасовец О.П., Алешня В.В., Журавлев П.В., Айдинов Г.В., Швагер М.М. Новая накопительная питательная среда и методика ее применения. Здоровье населения и среда обитания. 2012; (4): 31-3.
27. Методические рекомендации МР. Использование готовой к применению питательной среды для выделения сальмонелл из водных объектов. Ростов-на-Дону; 2012.
References
1. Zhuravlev P.V., Aleshnya V.V., Panasovets O.P. Microbial risk assessment of bacterial intestinal infections transmitted by water (on the example of the cities of Rostov region). Infektsiya i im-munitet. 2012; 2 (1-2): 44. (in Russian)
2. Rakhmanin Yu.A., Nedachin A.E., Talaeva Yu.G., Artemova T.Z., Ivanova L.V., Chugunikhina N.V. et al. Scientific confirmation of bacteriological criteria for assessing the quality of water from surface sources of centralized drinking water supplies. In: Rakhmanin Yu.A., ed. Results and Prospects of Research on the Problem of Human Ecology and Environmental Hygiene [Itogi i perspektivy nauchnykh issledovaniy po probleme ekologii che-loveka i gigieny okruzhayushchey sredy]. Moscow; 2002: 14061. (in Russian)
3. Ainsworth R. Safe, piped water: Managing microbial water quality in piped distribution systems. Geneva: IWA Publishing, London, for the World Health Organization; 2004.
4. Dechesne M., Soyeux E. Assessment of source water pathogen contamination. J. Water Health. 2007; 5(Suppl. 1): S39-50.
5. van Lieverloo J.H., Blokker E.J., Medema G. Quantitative mi-crobal risk assessment of distributed drinking water using faecal indicator incidence and concentrations. J. Water Health. 2007; 5(Suppl. 1): S131-49.
гиена и санитария. 2016; 95(5)
DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-5-483-490_
Оригинальная статья
6. Joyce S.K. Undetected stressed or subletally injured colifoim leaving the treatment plant. J. Am. Water Works Assoc. 1985; 99 (2): 216-21.
7. Payment P. Tap water and public health - the risk factor. Wa-ter-21. 2000; (8): 9.
8. Nedachin A.E., Artemova T.Z., Doskina T.V. et al. Confirmation of microbiological parameters and criteria for quality assessment of water sources of drinking water. In: Abstracts of the 5th International Congress ECWATECH [Tezisy 5-go mezhdunarodnogo kongressa EKVATEK]. Moscow; 2002: 701-2. (in Russian)
9. Nedachin A.E., Artemova T.Z., Dmitrieva R.A., Doskina T.V., Talaeva Yu.G., Ivanova L.V. et al. The problems of epidemic safety of drinking water use of the population of Russia. Gigiena i sanitariya. 2005; (6): 14-8. (in Russian)
10. Nedachin A.E., Artemova T.Z., Talaeva Yu.G., Ivanova L.V., Zagaynova A.V., Kolbasnikova I.A. et al. Comparative value of indicator bacteria to assess the potential risk of intestinal infections in drinking water use. In: Results and Prospects of Research on the Problem of Human Ecology and Environmental Hygiene [Itogi i perspektivy nauchnykh issledovaniy po probleme ekolo-gii cheloveka i gigieny okruzhayushchey sredy]. Moscow; 2005: 48-63. (in Russian)
11. Zhuravlev P.V., Aleshnya V.V., Panasovets O.P., Morozova A. A., Artemova T.Z., Talaeva Yu.G. et al. The importance of glucose-positive coliform bacteria and potentially pathogenic bacteria as indicators of epidemic safety of tap water. Gigiena i sanitariya. 2013; (1): 56-8. (in Russian)
12. Rakhmanin Yu.A., Nedachin A.E., Artemova T.Z. et al. The development of microbiological indicators of water supply. In: Materials of the IX All-Russia Congress of Hygienists and Sanitary Inspectors [Materialy IX Vserossiyskogo s»ezda gigienistov i sanitarnykh vrachey]. Moscow; 2001; Vol. 1.: 576-80. (in Russian)
13. WHO Guidelines for Drinking-Water Quality. Vol. 1: Recommendations. 2nd ed. Geneva: World Health Organizations; 1993.
14. Aleshnya V.V., Zhuravlev P.V., Golovina S.V. et al. The peculiarities of the indicator values of bacteriological indicators in the assessment of water quality in relation to the epidemiologi-cal safety in the regulated reservoir. In: Water: Ecology and Technology. The Collection of Materials of the 5 th International Congress «Ecwatech - 2002» [Voda: Ekologiya i tekhnologiya. Sbornik materialov 5-go mezhdunarodnogo kongressa «Ekvatek - 2002»]. Moscow; 2002: 705. (in Russian)
15. Sosedova L.M., Rukavishnikov V.S. Risk assessment of combined exposure to biological and chemical factors of the environment on the human organism. Gigiena i sanitariya. 2010; (5): 75-9. (in Russian)
16. Korber D.R., Choi A., Wolfaardt G.M., Ingham S.C., Caldwell D.E. Substratum topography influences susceptibility of Salmonella enteritids biofilms to trisdium phosphate. Appl. Environ. Microbiol. 1997; 63 (9): 3352-8.
17. Boytsov A.G., Lastovka O.N. Isolation of the sublethal damaged strains of Salmonella from the water of the surface reservoirs. Gigiena i sanitariya. 2003; (3): 76-7. (in Russian)
18 Oliver J.D., Dagher M., Linden K. Induction of Escherichia coli and Salmonella typhimurium into the viable but nonculturable state following chlorination of wastewater. J. Water Health. 2005; 3 (3): 249-57.
19. Romanova Yu.M., Alekseeva N.V., Gintsburg A.L. Uncultivated state of the pathogenic bacteria on the model of Salmonella ty-phimurium: the phenomenon and genetic control. Zhurnal mik-robiologii, epidemiologii i immunobiologii. 1997; (4): 35-41. (in Russian)
20. Sokolenko A.V. Uncultivable forms of bacteria: occurrence in nature, inductors of uncultivated state and reversion. Sovremen-nye naukoemkie tekhnologii. 2006; (2): 11-5. (in Russian)
21. Kalina G.P. Salmonella in the Environment [Sal'monelly v okruzhayushchey srede]. Moscow: Meditsina; 1978. (in Russian)
22. Kalina G.P. Methods of Detection of Indicator, Pathogenic and Potentially Pathogenic Microorganisms in the Environmental Objects Due to the Influence of Anthropogenic Factors [Metody obnaruzheniya indikatornoy, patogennoy i potentsial'no pato-gennoy mikroflory v ob»ektakh okruzhayushchey sredy v svyazi s vliyaniem antropogennykh faktorov]. Moscow; 1987: 29-38. (in Russian)
23. Zakharova N.E., Sukhanova S.M., Belyaeva G.A. Comparative characteristics of domestic selective culture media for the accumulation of Salmonella. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2004; (5): 101-3. (in Russian)
24. Boytsov A.G., Lastovka O.N., Kashkarova G.P. Water quality assessment on biological indicators: ways to improve (2nd message). Gigiena okruzhayushchey iproizvodstvennoy sredy. 2004; (1): 86-8. (in Russian)
25. Aleshnya V. V. The Impact of a Number of Environmental Factors on the Self-Cleaning of the Reservoirfrom Salmonella: Diss. Rostov-na-Donu; 1979. (in Russian)
26. Panasovets O.P., Aleshnya V.V., Zhuravlev P.V., Aydinov G.V., Shvager M.M. New cumulative culture medium and the method of its application. Zdorov'e naseleniya i sreda obitaniya. 2012; (4): 31-3. (in Russian)
27. Methodical recommendations of MR. Using the ready-to-use culture medium for the isolation of Salmonella from water bodies. Rostov-na-Donu; 2012. (in Russian)
Поступила 16.10.15 Принята к печати 17.11.15
