CC BY
188
УДК 579.61:576.8.083.3:616.6
СОВРЕМЕННЫЕ ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ХШ-АГАР И Ш-БУЛЬОН ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ САЛЬМОНЕЛЛ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЯХ
А.П. ШЕПЕЛИН Л.П. ШОЛОХОВА О.В. ПОЛОСЕНКО ИИ. МАРЧИХИНА
Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Московская область
e-mail: shepelin.rabota@rambler.ru
В ФБУН ГНЦ ПМБ разработаны, зарегистрированы в порядке государственной регистрации и внедрены в промышленное производство питательный бульон для накопления сальмонелл по Раппапорту-Вассилиадису (КУЗ-бульон) и питательная среда для выделения и дифференциации патогенных энтеробактерий (ХЬБ-агар).КУ8-бульон обеспечивает 2-5 кратное накопление сальмонелл через 3-6 ч инкубации по сравнению с контрольными импортными средами, ХЬБ-агар предназначен для выделения и дифференциации патогенных энтеробактерий, в частности, сальмонелл и шигелл по признакам ферментации сахаров, образованию сероводорода и лизиндекарбоксилазы. Введение в состав ХЬБ-агара желчи снизило стоимость среды, но самое главное, отпала необходимость её быстрого охлаждения в процессе приготовления.
Ключевые слова: питательная среда, накопление сальмонелл, выделение энтеробактерий.
Во всем мире наблюдается устойчивая тенденция к росту заболеваемости, вызванной кишечными патогенами. Современной особенностью эпидемиологии кишечных инфекций является резкое увеличение частоты импорта (заноса) инфекций с территорий эндемичных по заболеваемости стран ближнего и дальнего зарубежья, а также заражение жителей России при выезде в эти страны и в процессе миграции внутри страны. Широкому повсеместному распространению сальмонеллезов способствуют многие факторы, в том числе обилие источников возбудителей: домашние и дикие животные и птицы [1]. Идентификация энтеробактерий является сложной и дорогостоящей процедурой и основана на определении большого количества биохимических признаков [2]. Упрощение этой процедуры является актуальной проблемой микробиологии. Её решение снижает трудоёмкость и стоимость микробиологических исследований, увеличивает производительность бактериологических лабораторий. Наиболее широко известным и распространенным способом решения данной проблемы является применение питательных сред первичной дифференциации.
В соответствии с национальным стандартом РФ ГОСТ Р52814 -2007 (ИСО 6579-2002) на Продукты пищевые (Метод выявления бактерий рода Salmonella) перечень дифференциальнодиагностических питательных сред включает Ксилозолизиновый агар с дезоксихолатом натрия (XLD-агар) и среду Раппапорта-Вассилиадиса (RVS бульон). Результаты семинаров, конференций, встреч с врачами-бактериологами подтвердили необходимость создания данных питательных сред, включенных в новый стандарт.
Цель исследования — разработать и внедрить в практику бактериологических исследований отечественные питательные среды XLD-агар и RVS бульон, не уступающих по качеству коммерческим аналогам.
Материалы и методы. RVS-бульон и XLD-агар адаптированы к сырьевой базе, имеющейся на производстве питательных сред ФБУН ГНЦ ПМБ. Проведена оптимизация по основным компонентам, определяющим назначение разрабатываемых питательных сред, т. Е. по выбору белковой основы, содержанию хлористого магния, малахитового зелёного для RVS-бульона а также решена задача частичной замены дезоксихолата натрия на желчь очищенную для XLD-агара. Проведена сравнительная оценка качества по основным биологическим показателям: чувствительности, стабильности основных биологических свойств микроорганизмов, дифференцирующим, ингибирующим свойствам питательных сред. Для контроля питательных сред использовали тест-штаммы, полученные из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов «ГКПМ-Оболенск». При проведении исследований использовали стандартную взвесь культуры каждого тест-штамма, содержащую 10 единиц по ОСО 42-28-85, доведённую до требуемой концентрации микробных клеток методом 10-кратных разведений. В качестве питательных сред сравнения использованы ксилозолизиновыйагар с дезоксихолатом (XLD-agar) VM014787 838, годен до 2013/09/08 фирмы Merck и накопительный бульон для сальмонелл по Раппап0рту-ВассилиадисуVM033200 850 годен до 2013/11/24 фирмы Merck.
Результаты и обсуждение. ХЬБ-агар предназначен для выделения и дифференциации патогенных энтеробактерий, в частности, сальмонелл и шигелл при проведении бактериологических исследований в клинической и санитарной микробиологии.
Питательная среда обладает селективным действием и позволяет дифференцировать колонии микроорганизмов по ферментации сахаров, образованию сероводорода и лизиндекар-боксилазы. Дифференцирующие свойства среды основаны на изменении рН в кислую сторону при росте бактерий, гидролизующих углеводы, входящие в состав среды, с образованием жёлтых или беловато - жёлтых колоний, окруженных жёлтой зоной, с преципитатом или без него. Бактерии, в частности рода Ба1топе11азрр., продуцирующие сероводород, в присутствии тиосульфата натрия и соли железа (III), обнаруживаются по образованию чёрного пигмента колоний. Некоторые представители рода СЬтоЪаЛетзрр., способные продуцировать сероводород, но не декарбоксилирующие лизин, в результате закисления среды продуктами сбраживания углеводов, образуют на ХЬБ-агаре жёлтые колонии, иногда с чёрным центром. Бактерии декарбоксилирующие лизин, могут быть обнаружены по пурпурному окрашиванию среды вокруг колоний вследствие повышения рН. Реакции, протекающие в ХЬБ-агаре могут проходить одновременно или последовательно, что вызывает появление различных оттенков цвета индикатора рН, или изменяет его цвет от жёлтого до красного при длительном культивировании.
Многолетний опыт по изучению сырьевой базы, используемой при производстве питательных сред в ФБУН ГНЦ ПМБ, определил возможность разработки и производства данных питательных сред с использованием импортного и отечественного сырья. Сравнительная оценка качества вышеуказанных сред по биологическим показателям представлена в табл. 1 и 2 и рис. 2 для ЯУБ-бульона.
Таблица 1
Сравнительная характеристика качества ХЬБ-агара
№ п/п Тест-штаммы XLD-агар с. 3 годен до 06.2013 ФБУН ГНЦ ПМБ XLD-agar VM014787 838, годендо 2013/09/08 Merck Контроль роста тест-штаммов на ГРМ агаре с.65 годен до 06.2018
Количество, диаметр мм, морфология
1 S.flexneril a85l6 78 0,8-1,0 круглые, прозрачные, цвета среды 81 0,6-0,8 круглые, прозрачные, цвета среды 94 1,5-2,0 круглые, прозрачные, бесцветные
2 S. typhimurium79 89 1,2-1,4 круглые, прозрачные, бесцветные с чёрным центром 92 0,6-1,0 круглые, прозрачные, бесцветные с чёрным центром 97 1,8-2,0 круглые, прозрачные, бесцветные
3 S. enteritidis 11272 92 1,2-1,8 круглые, прозрачные, бесцветные с чёрным центром 87 0,6-1,4 круглые, прозрачные, бесцветные с чёрным центром 106 1,2-1,8 круглые, прозрачные, бесцветные
4 E. coli 3912/41 (О55:К59) 53 1,2-1,8 круглые, непрозрачные, жёлтые, с жёлтой зоной вокруг 28 1,2-1,6 круглые, непрозрачные, кремовые, без жёлтой зоной вокруг 78 1,8-2,0 круглые, прозрачные, бесцветные
5 P. mirabilis 3177 76 1,0-1,8 круглые, прозрачные, жёлтого цвета с чёрным центром 73 1,0-1,6 круглые, прозрачные, жёлтого цвета с чёрным центром Сплошное роение
6 S. typhimurium 79 и E. coli 3912/41 (055:K59) 1:1 Чёткая дифференциация Чёткая дифференциация Нет дифференциации
7 S. aureus Wood-46 Разведение 10-4 Нет роста Нет роста Сплошной рост
Сравнительная характеристика ростовых свойств КУв-бульона на расширенном наборе музейных тест-штаммов
Тест-пггаммы кУ8 бульон с.1 годен до Об. 2013ФБУН ГНЦ ПМБ Контр. Высев после культивирования в кУ8 бульоне с.1 на Агар Эндо-ГРМ кУ8 бульон УМоззгоо 850 годен до 2013/11/24 Мегск Контр. Высев после культивирования в кУ8 бульоне (Мегск) на Агар Эндо-ГРМ
S. paratyphi А-225 Слабое помутнение Сплошной рост Слабое помутнение Сплошной рост
S. paratyphi В-8006 Дифф. помутнение Сплошной рост Дифф. помутнение Сплошной рост
S. typhimurium 79 Дифф. помутнение Сплошной рост Дифф. помутнение Сплошной рост
S. enteritidis 11272 Дифф. помутнение Сплошной рост Дифф. помутнение Сплошной рост
S. typhi«bismuth» 869 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
S. gallinarum 665 Слабое помутнение Сплошной рост Слабое помутнение Сплошной рост
S. 206neumo 3496 Дифф. помутнение Сплошной рост Дифф. помутнение Сплошной рост
S. 206neumon-suis Дифф. помутнение Сплошной рост Дифф. помутнение Сплошной рост
s. typhiH-901 гдр/гиск Помутнение отсутствует 6 колоний d 1,0-1,5 Бесцветные, круглые, прозрачные Помутнение отсутствует 3 КОЛОНИИ d 1,0-1,5 Бесцветные, круглые, прозрачные
E. coli ATCC 25922 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
E. coli 4 (Oi57:H7) Нет роста Нет роста Нет роста 2; малиновые
S.flexneri 1 a 8516 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
S. sonnei«S-form» Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
Candida albicans ATCC 60193 Нет роста Нет роста Нет роста 1 колония d< 0,8 мм Слабо-розовые
S. aureus Wood-46 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
B. cereus 8035 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
K. 206neumonia 418 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
P. aeruginosa 27/99 Визуальное отсутствие роста 4 колонии d 4,0-6,0 мм гладкие, блестящие, слабый зелёный пигмент Слабая опалесценция Сливной рост с13>0_4>° мм гладкие, блестящие, слабый зелёный пигмент
P. aeruginosa 453 Нет роста Нет роста Слабая опалесценция Сливной рост d 10,0 мм гладкие, расплывчатые, с зелёным пигментом
P. vulgaris HX19222 Нет роста 15 колоний Очаговое роение Слабая опалесценция Сливной рост без роения розового цвета
1 Посевная доза 100 м.к. в 1 мл RVS бульона
В ноябре 2013 года ХЬБ-агар ФБУН ГНЦ ПМБ хорошо зарекомендовал себя при микробиологических исследованиях клинического материала от больных в МБУЗ «Пятигорская городская инфекционная больница» — выявлена чёткая визуальная дифференциация сальмонелл от эшерихий (рис. 1).
Рис. 1. Рост колоний 8а1топе11азрр.ИЕ8сКетсЫасо1тнаХЬБ-&г&ре
Ведущими зарубежными фирмами выпускается ряд питательных сред для селективного накопления сальмонелл. В России производство данных сред сталкивается с определёнными трудностями, так например, селенитовый бульон содержит гидроселенит натрия, вызывающий раздражение кожного покрова человека, поражение слизистой оболочки и дыхательных путей (ПДК 0,1 мг/м3). Питательная среда Мюллера готовится только в лабораторных условиях, так как содержит мел и раствор Люголя. Производство ЯУБ-бульона сухого, являющего аналогом магниевой среды, возможно только при наличии безводного хлористого магния.
Рис. 2. Визуальная оценка качества КУЗ бульонов пр-ва МЕИСК и ГНЦ ПМБ по биологическим показателям
Заключение. ЯУБ-бульон обеспечивает 2-5 кратное накопление сальмонелл через 3-6 ч инкубации по сравнению с контрольными импортными средами, определяемое в соответствии с МУК 4.2.2316-08. Среда обеспечивает высокие ингибирующие свойства в отношении эшерихий и стафилококков. Особенностью ХЬБ-агара является необходимость быстрого охлаждения после нагрева, так как перегрев или медленное охлаждение ведёт к образованию кристаллического преципитата солей, и среда становится непригодной к использованию. Введение в состав ХЬБ-агара производства ФБУН ГНЦ ПМБ желчи снизило стоимость среды, но самое главное, отпала необходимость её быстрого охлаждения в процессе приготовления. За 18-20 час инкубации посевов на ХЬБ-агаре ФБУН ГНЦ ПМБ формируются более крупные колонии, что облегчает визуальную интерпретацию результатов. ЯУБ-бульон ФБУН ГНЦ ПМБ обладает выраженным ингибирующим эффектом в отношении сопутствующей микрофлоры и превосходит ком-
мерческий аналог по степени накопления сальмонелл. Получены Регистрационные удостоверения на набор реагентов для бактериологических исследований РУ № ФСР 2010/09163 от 13 ноября 2013 года на ЯУБ-бульон и РУ № ФСР 2010/09165 от 13 ноября 2013 года на ХЬБ-агар.
Многолетний опыт производства и многостадийная система контроля качества гарантирует потребителям соответствие питательных сред по физико-химическим и биологическим требованиям, заложенным в технических условиях и производственных регламентах.
1. Милютина Л. Н., Гурьева О. В., Рожнова С. Ш., Головинова М. А. Эволюция лекарственной резистентности Sal. Entritidis, выделенных от детей // Эпидемиол. и инфекц. болезни. - 2008. - № 2. -С. 44-47.
2. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др. т. 1. - М.: Мир, 1997. - С. 430.
3. Продукты пищевые «Методы выявления бактерий рода Salmonella». ГОСТ Р52814 -2007 (ИСО 6579-2002). - С. 19.
4. Методы контроля бактериологических питательных сред: Метод. Указ МУК 4.2.2316-08 - М.: Роспотребнадзор, 2008. - С. 68.
5. Микробиология: Каталог 2004/2005 (MERCK)., - М.: ООО ВИТЕК-ФАРМ, 2005. - С. 162, 200.
Литература
ADVANCED DOMESTIC DOMESTIC CULTURE MEDIA XLD-AGAR AND RVS-BROTH FOR THE ISOLATION OF SALMONELLA AND THEIR USE IN CLINICAL LABORATORIES
Federal budget institution of science “State research center for applied microbiology and biotechnology”
e-mail:
shepelin.rabota@rambler.ru
A.I. SHEPELIN L.P. SHOLOKHOVA O.V. POLOSENKO I.I. MARCHIKHINA
In institution developed, registered in the order of state registration and first commercialized nutrient broth for Salmonella accumulation by Rappaport - Vassiliadisu (RVS- broth) and a growing medium for the isolation and differentiation of pathogenic enterobacteria (XLD-agar). RVS-broth provides 2-5 fold accumulation of Salmonella within 3-6 hours of incubation as compared to control media imported, XLD-agar is used for isolation and differentiation of pathogenic enterobacte-ria, in particular Salmonella and Shigella featured by fermentation of sugars and production of hydrogen sulphide decarboxylase. Introduction of the XLD- agar bile reduced cost environment , but most importantly, it eliminated the need for rapid cooling of the preparing process.
Keywords: culture media, accumulation of Salmonella, isolation of enterobacteria.
