CC BY
12
ния могут усугубляться с усилением воздействия [избыточного давления и(или) числа волн) и в связи с важной ролью этих ферментных систем в метаболизме липофиль-ных веществ приводить к глубоким функционально-метаболическим нарушениям в печени и организме в целом. Это заставляет по-новому оценить потенциальную опасность множественных СВВ для человека.
Литература
1. Верешанин В. Д. Интегрирующая функция экологии в современной науке.— Киев, 1987.— С. 83—97.
2. Гублер £ В., Генкин А. А. При Ml'rt'étí йё' Herí а р a Met ри чЪ ских критериев статистики в медико-биологических исследованиях,— Л., 1973.— С. 83—92.
3. Кудрин И. Д., Сулимо-Самуйлло 3. К., Филатов А. И. Механические ударные нагрузки и перегрузки как фактор экологии.— Л., 1980
4. Романов С. Н. Биологическое действие механических колебаний.— Л., 1983.
5. Rhodes 1. S., Hall S. Т., Houston J. В. // Xenobiotica.— 1984,— Vol. 14, N 10,— P. 677—686.
6. Vessel E. S. // Clin. Pharmacol. Tlier.— 1971,— Vol. 26, N 13,- P. 275-286.
Поступила 30.03.90
© А. Г. БОЙЦОВ, 1991 УДК 579.63
А. Г. Бойцов
ЗНАЧЕНИЕ СУБЛЕТАЛЬНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ МИКРООРГАНИЗМА (ОБЗОР)
Ленинградский санитарно-гигиенический медицинский институт
Гибели микроорганизмов под действием неблагоприятных факторов может предшествовать возникновение у бактерий особого состояния поврежденности, характеризующееся временным снижением жизнеспособности. При описании указанного явления в современной литературе используются два термина: «стресс» и (или) «сублетальные повреждения» (в англоязычной литературе «stress», «injury»). Некоторые авторы, например A. Hurst [26], предлагают использовать эти термины в качестве синонимов. Хотя общепринятые определения указанных понятий в настоящее время в литературе отсутствуют, на наш взгляд, правильнее считать стресс более широким понятием, чем сублетальные повреждения, рассматривая последние как частный случай стресса. И. Л. Работнова и И. Н. Позмогова [11[ понимают под стрессом быструю перестройку обмена веществ у бактерий, направленную на сохранение жизнеспособности при воздействии любого неблагоприятного фактора, не ведущего к моментальной гибели микроорганизма. В этом случае сублетальные повреждения могут рассматриваться как одно из проявлений стресса, характеризующееся временной утратой поврежденными клетками способности к росту и размножению.
Общепринятым для выявления сублетально поврежденных клеток в популяции, подверженной действию стрессора, считается метод, разработанный G. Iandolo и Z. Ordal [27] при изучении теплового иока у стафилококков. Он основан на повышенной чувствительности сублетально поврежденных клеток к ряду селективных агентов, в частности к высоким концентрациям хлористого натрия. Для оценки доли сублетально поврежденных клеток одновременно проводится определение количества жизнеспособных клеток в популяции, подверженной воздействию стрессора, путем высева за элективную и оптимальную питательные среды. Утрата частью микроорганизмов способности к росту на элективной среде при сохранении способности к росту на оптимальной среде расценивается как доказательство наличия сублетальных повреждений.
Перечень стрессоров, воздействие которых ведет к возникновению сублетальных повреждений у бактерий, чрезвычайно широк и включает разнообразные физические, химические и биологические факторы. Однако наиболее полно в настоящее время изучены сублетальные повреждения, возникающие при тепловом шоке. Это связано со значительными трудностями методического порядка, имеющими место при изучении стресса, обусловленного химическими факторами [19]. Механизмы повреждений, возникающих у бактерий вследствие теплового шока, обсуждаются в ряде обзоров, в том числе отечественных [3, 4, 9], поэтому в настоящей работе основное внимание будет уделено значению сублеталь-
ных повреждении для решения практических задач санитарнои микробиологии.
Сублетальные повреждения могут возникнуть у санн-тарно-значимых микроорганизмов как вследствие воздействия дезинфектантов и температурного фактора, так и в результате длительного пребывания во внешней среде. Показано, например [16], что в морской воде уже через 24 ч до 90% клеток кишечных палочек характеризуются повышенной чувствительностью к поверхностно-активным веществам (ПАВ), желчным кислотам, повышенной температуре инкубации. У сальмонелл сублетальные повреждения были зарегистрированы через 7 дней пребывания в воде поверхностного водоема [37]. Вследствие сублетальных повреждений возрастает чувствительность микроорганизмов к веществам, обычно используемым в составе элективных питательных сред, что может стать причиной ошибки при оценке уровня микробной контаминации. В то же время при попадании в благоприятные условия сублетально поврежденные бактерии могут полностью восстановить исходные биологические Свойства, и в том числе вирулентность.
Поврежденные стрессором грамположительные микрборга-низ.мы характеризуются повышенной чувствительностью к кристаллическому фиолетовому азиду натрия, желчи, теллуриту калия, а грамотрицательные — к кристаллическому фиолетовому, бриллиантовому зеленому, метнленовому голубому, эозину, желчным солям, ПАВ, селениту натрия [33]. Токсичность агара Эндо для клеток, поврежденных хлором, служит причиной расхождений между результатами колиметрии с использованием метода мембранных фильтров и титрационного метода [30, 38]. С наличием сублетально поврежденных клеток могут быть связаны и различия в результатах колиметрии сточных вод с использованием различных питательных сред [1]. В то же время не было выявлено повышения чувствительности у подвергнутых тепловому стрессу кампн-лобактеров к действию смесей антибиотиков, обычно используемых в составе элективных питательных сред для выделения этих микроорганизмов [22, 35].
Присутствие в природных популяциях сублетально поврежденных клеток заставляет предусматривать меры для: репарации их при совершенствовании методов санитарно-бакте-риологического исследования объектов природной среды. Это может быть достигнуто за счет применения процедуры пред-обогащения, использования более «мягких» элективных питательных сред или путем введения в состав таких сред особых ингредиентов, усиливающих процессы репарации.
Процедура предобо!ащения предусматривает посев исследуемого материала в неэлективную питательную среду с последующим высевом в жидкую элективную среду. В случае необходимости применения плотных питательных сред исполь-
зуются мембранные фильтры, на которых микроорганизмы переносят с плотной восстановительной среды на элективную среду (8).
Эффективность предобогащения определяется целым рядом факторов: типом питательной среды, применяемой для предобогащения; временем и температурой инкубации; типом элективной питательной среды, используемой для высева со среды предобогащения; соотношением высеваемого объема среды предобогащения и взятого объема элективной среды.
Вопрос о потребности в питательных веществах для репарационных процессов наиболее полно изучен на примере теплового шока. Установлено, что, вероятно, восстановительные процессы в клетке протекают за счет эндогенных ресурсов. При этом избыток питательных веществ в среде может снижать полноту репарации. В частности, снижение числа жизнеспособных клеток при высеве прогретой при 50 °С культуры S. typhimurium на триптозно-соевый дрожжевой агар по сравнению с таковым при высеве на минимальную авизированную среду М-9 продемонстрировали R. Gomez и соавт. [20]. Этот вывод нашел свое подтверждение в работах других авторов, а явление получило название «minimal medium recovery». В то же время имеются многочисленные данные об активации процессов репарации в богатых питательных средах. D. Mossel и Р. Van Netten [33] полагают, что имеющиеся в литературе противоречия обусловлены многообразием факторов, определяющих влияние состава восстановительной среды. По их мнению, эффект состава среды может зависеть от вида и интенсивности воздействия стрессора, фазы роста культуры в момент стресса, типа среды предшествующего культивирования, цитотоксического влияния отдельных компонентов сложной полноценной среды, а также от особенностей отдельных штаммов микроорганизмов. Таким образом, к сожалению, на сегодняшний день выбор состава среды предобогащения в каждом конкретном случае не может быть сделан целиком на основе теоретических соображений и должен проводиться эмпирическим путем.
Перечень питательных сред, использованных различными авторами для выделения сублетально поврежденных микроорганизмов, весьма обширен. Он включает пептонную воду, мясопептонный бульон, жидкие питательные среды с различными сахарами (лактоза, маннит, инозит, дульцит). Подробный перечень предобогатительных сред для выделения сальмонелл можно найти в монографии Г. П. Калины [5], а для шигелл — в обзоре Н. С. Прямухиной и соавт. [10]. Необходимо отметить, что использование лактозного бульона для предобогащения при выделении сальмонелл из кормов для птиц оказалось менее эффективным по сравнению с прямым посевом на селенитцистеиновую и тетратионатную среды [14]. В то же время в литературе [39] имеются указания на большую эффективность предобогащения в бульоне с 1 % лактозы и в бульоне без декстрозы по сравнению с таковой в забуференной пептонной воде и при прямом посеве на элективную среду Bierbrauer при выделении сальмонелл. Наиболее широко в зарубежной практике в качестве среды предобогащения в настоящее время используется забуферен-ная пептонная вода.
Особое внимание необходимо уделить выбору времени и температуры инкубации среды предобогащения. Как справедливо отмечает Г. П. Калина [6], при одновременном культивировании смеси микроорганизмов на неэлективной питательной среде неизбежно реализуется закон Вольтерра — Гаузе, что может привести при чрезмерной продолжительности инкубации к конкурентному вытеснению интересующего исследователя вида микроорганизмов [6]. В то же время продолжительность инкубации должна быть достаточной для максимально полной репарации повреждений и технологической с точки зрения режима работы лаборатории. Время, необходимое для полной репарации повреждений, зависит от типа и степени повреждений [31]. Показано, например, увеличение продолжительности лаг-фазы у сальмонелл в пептонной воде с увеличением сроков их предварительного инкубирования в осадках сточных вод [36]. А. К. Маслов и соавт. [7] рекомендуют пролонгировать время инкубации посевов водопроводной воды на лактозопептонной среде до 48 ч для более полного учета сублетально поврежденных хлором бак-
терий группы кище^цых палочек. В больщднстве случаев время предобогащения не превышает 18—20 ч.
При индикации патогенных энтеробактернй можно в некоторой степени ослабить конкурентное давление со стороны сопутствующей микрофлоры за счет применения повышенных температур инкубации (42—43 °С). Однако при этом необходимо учитывать, что высокие температуры инкубации в ряде случаев могут явиться дополнительным стрессором. В то же время в некоторых случаях может оказаться целесообразной пониженная против оптимума температура инкубации. Так, например, при выделении шигелл предобогащение рекомендуют проводить при температуре 30—35 °С [10]. Предобогащение при комнатной температуре было рекомендовано для определения колиформных бактерий в пищевых продуктах [17]. Инкубация предобогатительной среды при 35 °С с успехом использована при выделении сальмонелл из мясных продуктов [18].
Среда, применяемая для высева со сред предобогащения, должна обладать достаточно высокой элективностью, так как в среде предобогащения соотношение искомый микроорганизм / сопутствующая микрофлора может сместиться.в неблагоприятную сторону. Так, например, при использовании предобогащения для выделения сальмонелл большинство авторов [23, 28, 32, 40, 42] подчеркивают преимущество использования для высева после предобогащения среды Раппопорт — Василиади по сравнению с другими элективными средами для этих микроорганизмов. Наиболее близким отечественным аналогом указанной среды является магниевая среда (среда Раппопорт в модификации Г. П. Калины и В. Л. Шигановой) [12]. Показано также преимущество при выделении сальмонелл с использованием предобогащения в сочетании с высевом на тетратиопатный бульон по сравнению с высевом на селенитцистеиновую среду [18].
Эффективность предобогащения может в значительной степени изменяться в зависимости от объема предобогатительной среды, высеваемой в среду обогащения. Соотношения высеваемого объема предобогатительной среды (ПР) и объема обогатительной среды (ОБ) ПР/ОБ, используемые разными авторами, колеблются в широких пределах — от 0,005/10 мл [24] до 10/35 мл [43] в зависимости от объекта исследования и типа обогатительной среды. Оптимальные значения соотношения ПР/ОБ должны, по-видимому, подбираться эмпирическим путем в каждом конкретном случае.
В целом эффективность процедуры предобогащения при исследовании объектов внешней среды и пищевых продуктов на наличие патогенных микроорганизмов признается большинством авторов. Применение этого метода при исследовании пищевых продуктов рекомендовано экспертами ВОЗ [8], и он широко используется во многих европейских странах при исследовании самых разнообразных объектов [23].
В то же время в литературе имеется ряд сообщений об отсутствии положительного эффекта при использовании этого методического приема. Так, Е. Alcaide и соавт. [13] показали большую эффективность прямого посева в среду NRI0 по сравнению с предобсгащением в пептонной воде при исследовании сточных вод и воды поверхностных водоемов на наличие сальмонелл. Отдельные неудачи при использовании этого метода могут быть связаны с несовершенством технических приемов предобогащения.
Необходимо отметить, что методу предобогащения присущ ряд очевидных недостатков, таких как увеличение продолжительности, трудоемкости и себестоимости исследования. Особенно значимы указанные недостатки в случае применения предобогащения при количественном определении в объекте санитарно-показательных микроорганизмов титрационным методом. В связи с этим несомненный интерес представляет возможность снижения токсичности элективных питательных сред для сублетально поврежденных микроорганизмов за счет специальных ингредиентов, способствующих процессам репарации.
Стимулирующее действие по отношению к сублетально поврежденным бактериям в случае теплового шока было выявлено у каталазы, пирувата натрия и некоторых других веществ. Подробные сведения по этому вопросу можно найти в монографии В. Я. Мунблит и соавт. [9]. Установлено, что добавление 150 ед/мл каталазы к плотной питательной среде
повышает эффективность яыя'вйеиия 'г[Шйтрицательнык':6ак-терий, сублетай^но повреждейных молбчНёй кислотой при дё-контаминации поверхности сырого мяса [41). Пируват натрия рекомендуют добавлять к питательным средам для выделения сублетально поврежденных стафилококков [25]. В то же время использование каталазы в составе триптозно-соевого агара при прямом посеве оказалось неэффективным при обнаружении колиформных бактерий, поврежденных действием низкой температуры [21]. Не увенчалась успехом и попытка повысить эффективность обнаружения сальмонелл в кормах для птиц путем добавления 1 % пирувата натрия к селенитцистеиновой и тетратионатной средам [15]. Таким образом, данное направление совершенствования методов выявления сублетально поврежденных бактерий, несмотря на свою привлекательность, еще мало разработано.
Интересный методический прием был использован для выделения поврежденных бифидобактерий. Первичный посев материала осуществляли в неэлективную среду с последующим наслаиванием на нее элективной среды [34].
Учитывая, что процедура предобогащения мало приемлема из-за своей громоздкости при количественном определении микроорганизмов, в этом случае наиболее целесообразным следует считать применение специальных низкоингиби-торных питательных сред. Так, например, при колиметрии методом мембранных фильтров среду Эндо предлагается заменить на специальную щадящую среду т-Т7 [29]. Более подробную информацию об особенностях использования метода мембранных фильтров при выделении сублетально поврежденных микроорганизмов можно найти в монографии Т. Брок [2].
Таким образом, наличие в объектах внешней среды и пищевых продуктах сублетально поврежденных микроорганизмов может существенно сказываться на результатах санитарно-бактериологических исследований. Поэтому совершенствование методов санитарной микробиологии должно предусматривать комплекс специальных мер, направленных на наиболее полный учет сублетально поврежденных клеток. Это особенно важно при совершенствовании методов выявления патогенных микроорганизмов.
Литература
1. Бойцов А. Г., Евельсон Е. А., Иванов В. П. и др. // Способы очистки и очистные сооружения для промышленных сточных вод.— Л., 1987.— С. 9—17.
2. Брок Т. Мембранная фильтрация: Пер. с англ.— М., 1987.
3. Ждан-Пушкина С. М. Основы роста культур микроорганизмов.—Л., 1983.—С. 154—171.
4. Ждан-Пушкина С. М., Вербицкая Н. Б. // Успехи микро-биол,—1989,—Вып. 23.—С. 137—159.
5. Калина Г. П. Сальмонеллы в окружающей среде.— М., 1978,—С. 128—129.
6. Калина Г. П. // Методы обнаружения индикаторной, патогенной и потенциально патогенной микрофлоры в объектах окружающей среды в связи с влиянием антропогенных факторов.— М., 1987.— С. 29—38.
7. Маслов А. К., Зенков В. А., Нестеров С. В. и до. // Гиг. и сан,— 1986,—N9 2,— С. 61—63.
8. Микробиологические аспекты гигиены пищевых продуктов (Доклад комитета экспертов ВОЗ с участием ФАО).— М„ 1978,- С. 57.
9. Мунблит В. Я., Тальрозе В. Л., Трофимов В. И. Термоинактивация микроорганизмов.— М., 1985.— С. 159—194.
10. Прямухина Н. С., Колобова Л. Ф., Боброва Т. Г1. Сохранение и индикация шигелл в окружающей среде.— М„ 1983.
11. Работнова И. Л., Позмогова И. Н. Хемостатическое культивирование и ингибирование роста микроорганизмов,— М„ 1979.
12.' 3iiTö{jö8aKTepiiH:: Pv'ko^&cfBo' ''Jiflfl' aftifi&ft'.^ M„ 1985.
13. Alcaide E„ AittaFR:, 'PÜjaiäte M:.] /.',' Garay E. 7/ Zbl. Bakt.— 1987.— Bd 84, N 1,— S. 34—41.
14. Cox N. A., Wailey J. S., Thompson J. E. // Poultrv Sei — 1982.—Vol. 61, N 7.— P. 1314-1321.
15. Cox N. A., Wailey J. S„ Thompson J. E. // Ibid.- 1983.— Vol. 62, N 6,— P. 947—951.
16. Delattre J. M. // Oceanis.— 1988,— Vol. 14, N 1,— P. 89—95. ■
17. Determination of Coliform Bacteria in Foods Using Preincubation // Z. Lebensm.— Untersuch. Forsch.—
1984,— Bd 179, N 6.— S. 458—459.
18. Escartin F. E., Lozario S. ]., Mirles H. C. 11 Rev. lat.-amer. Microbiol.— 1983.— Vol. 25. N 4,— P. 263—269.
19. Gilbert P. II The Revival of Injured Microbes / Ed. M. Andrew, A. Russel.— London, 1984 — P. 175—197.
20. Gomez R. F., Sinskey A. J., Davies R., Labuza T. P. // J. gen. Microbiol.— 1973.- Vol. 74, N 2.— P. 267—274.
21. Gram L., Pedersen P., Sogaard H. // Int. J. Food Microbiol.— 1984,—Vol. 1, N 3.—P. 155—162.
22. Hannien M. L. 11 Acta vet. scand.— 1982,— Vol. 23, N 3.— P. 416—424.
23. Harvey R. W. S., Price T. H. // Isol. and Identificat. Methods Food Poison. Organisms.— London, 1982.— P. 51-72.
24. Harvey R. W. S„ Price T. H. // J. Hyg.— 1987,— Vol. 87, N 2,— P. 219-224.
25. Havelaar A. H., During M. // Canad. J. Microbiol.—
1985,- Vol. 131, N 4,- P. 331-334.
26. Hurst A. II The Revival of Injured Microbes / Ed. M. Andrew, A. Russel.— London, 1985,— P. 77—102.
27. landolo G„ Ordalz. // J. Bact.—1966.—Vol. 91,— P. 134—142.
28. Kalapothaki V., Xirouchaki E., Mavrommati Ch. el al. // Arch. Inst. Pasteur Hellen.— 1980,—Vol. 26.—P. 41—44.
29. LeChevallier AL W . Cameron S. C., McFeters G. A. // Appl. environ. Microbiol.— 1983,— Vol. 45, N 2,— P. 484— 492.
30. LeChevallier M. W . McFeters G. A. 11 J. Amer. Water Works Ass.— 1985,—Vol. 77, N 6.— P. 81—87.
31. Maskey B: M., Derrick C. M. // J. appl. Bact.— 1983.— Vol. 55, N 3.— P. 943.
32. Mavrommati Ch., Kalapothaki V., Trichopoulos D. et al. // Int. J. Food Microbiol.—1984,—Vol. 1, N 1,—P. 5—11.
33. Mossel D. A. A., Van Netten P. 11 The Revival of Injured Microbes / Ed. M. Andrew, A. Russel.— London, 1984.— P. 329—369.
34. Munoa F. J., Pares R. // Appl. environ. Microbiol.— 1988,—Vol. 54, N 7,—P. 1715—1718.
35. Palumbo S. A. // Ibid.— 1984.— Vol. 48, N 3.— P. 477—480.
36. Rhodes P. // The Revival of Injured Microbes / Ed. M. Andrew, A. Russel.— London, 1984,— P. 378.
37. Rhodes M. W.. Kaior H. // Appl. environ. Microbiol.— 1988.—Vol. 54, N 12,—P. 2902—2907.
38. Schubert R.. Helm F. 11 Zbl. Bakt. I. Abt.— 1985,— Bd. 181, N 1—2,— S. 87—92.
39. Tarnay I. 11 Magy. Allatorv. Lapja.— 1985.— Vol. 40, N 4,— P. 201—203/
40. Tongpim S., Weumer R. R., Tamminga S. K., Kample-macher E. H. // Int. J. Food Microbiol.— 1984,—Vol. 1, N 1,- P. 33-42.
41. Van Netten P., Van Der Zee H., Mossel D. A. A. 11 J. appl. Bact.— 1984,—Vol. 57, N 1,- P. 169—173.
42. Vassiliadis P., Trichopoulos D., Kalapothaki V.. Serie Ch. // J. Hyg.— 1981,— Vol. 87, N 1.— P. 35—41.
43. Watson D. C., Walker A. P. // J. appl. Bact.— 1978.— Vol. 45, N 1.— P. 195—204.
riocTynHjic. 27.08.90
