CC BY
7
с везикулами естественного происхождения (ЕВ) (без добавления цитохалазина В). ЕВ получали с помощью ультрацентрифугирования.
Для определения морфологии и размеров иМВ и ЕВ, выделенных из МСК и SNB-19 использовалась сканирующая электронная микроскопии, которая показала, что везикулы имеют округлую морфологию и размер иМВ МСК в среднем составляет 150 нм, а иМВ SNB-19 около 248 нм. Размер ЕВ, выделенных с помощью ультрацентрифугирования в среднем, составляет 148 нм для ЕВ МСК и 233 нм для ЕВ SNB-19. Полученные данные демонстрируют, что иМВ и ЕВ не отличаются размерами друг от друга. Было показано, что иМВ, как и ЕВ могут взаимодействовать с опухолевыми клетками MCF7 в монослойной культуре. Добавление иМВ МСК к данным сфероидам в концентрациях 5 мкг, 10 мкг, 20 мкг увеличивало их количество. Окрашивание сфероидов Annexin V показало, что концентрация 20 мкг иМВ МСК снижала жизнеспособность опухолевых клеток в сфероидах. Добавление иМВ SNB-19 к опухолевым сфероидам MCF7 также увеличивало их количество, однако, концентрация 20 мкг иМВ SNB-19 увеличивала жизнеспособность опухолевых клеток в сфероиде по сравнению с иМВ МСК. Добавление иМВ МСК влияло на экспрессию генов OCT4 и NANOG в сфероидах. При добавлении иМВ SNB-19 увеличивается экспрессия генов OCT4 и SOX2. Также статистически достоверная разница в экспрессии гена SLUG по сравнению с контролем наблюдалась при добавлении иМВ SNB-19.
Таким образом, был проведен сравнительный анализ влияния иМВ МСК и иМВ SNB-19 на формирование и качество сфероидов. Работа выполнена при поддержке Программы стратегического академического лидерства Казанского (Приволжского) федерального университета (ПРИ0РИТЕТ-2030), за счет средств Российского научного фонда (грант № 21-74-10021).
ПРИМЕНЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ПЛАЗМЫ, ОБОГАЩЕННОЙ ТРОМБОЦИТАМИ, У ПАЦИЕНТОВ ХИРУРГИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ
И.В. Гилевич1, 2, Е.А. Коломийцева1, Э.Н. Шубров1, 2, С.Н. Лепетунов1, Г.А. Забунян1, Р.В. Чучварев1
1 ГБУЗ НИИ Краевая клиническая больница № 1 им. профессора С.В. Очаповского МЗ КК, Краснодар, Россия
2 ФГБОУ ВО Кубанский государственный медицинский университет Минздрава России, Краснодар, Россия
e-mail: giliv@list.ru
Ключевые слова: плазма, обогащенная тромбоцитами, лизат тромбоцитов, тромбогель, клиническое применение, хирургия
Плазма, обогащенная тромбоцитами (ОбТП) — фракция, выделенная из периферической крови, содержание тромбоцитов в которой превышает физиологический уровень. Считается, что концентрация тромбоцитов в ОбТП должна составлять не менее 1000000/мкл, больше или меньше не будет оказывать регенеративный эффект. По мнению Marx R.E. ОбТП может называться только тот продукт, в котором в небольшом количестве плазмы содержится увеличенное количество тромбоцитов. Перед введением тромбоциты дополнительно активируются (Ca2+, тромбин, температурный режим).
В нашем исследовании одной из задач стояло получение конечного продукта объемом 20-30 мл, соблюдая
необходимые требования. При этом важно было определить наиболее подходящий способ активации, что, прежде всего, было обусловлено точкой приложения, особенностями хирургического вмешательства. Разработанный нами протокол выделения ОбТП и ее активации обеспечивал следующие характеристики конечного продукта: объем конечного продукта составлял 20-50 мл, стерильный. Клеточный состав готового продукта: содержание тромбоцитов составляло, в среднем, 1098 ± 58,68х 109/л, по сравнению с исходным уровнем - 312,3 ± 16,62х109/л, p<0,0001, при этом отсутствовало содержание лейкоцитов и эритроцитов. Для получения ОбТП был отработан протокол двойного центрифугирования: сначала на мягком режиме, чтобы получить наибольшую концентрацию тромбоцитов в плазме, далее жесткий режим, для уменьшения объема ОбТП. С целью активации был использован режим глубокой заморозки при -80С, с последующим размораживанием и хранением при -20С. Другой способ был основан на введении CaCl2 для активации аутологичного тромбина и далее смешивание тромбина с ОбТП для получения тромбогеля.
За период с 2017г. по 2021г. всего в исследовании приняло участие 166 человек с разной нозологией. В зависимости от заболевания пациенты были разделены на группы: стриктура уретры - 29 человек, интерстици-альный цистит — 36 человек, трофическая язва — 46 чел, хронический остеомиелит нижних конечностей - 8 чел., 47 пациентов с дефектами лицевого скелета. Для заполнения костных полостей был использован тромбогель. Для лечения трофических язв тромбогель и лизат тромбоцитов, в урологии применяли лизат тромбоцитов, курсами. При анализе полученных данных побочные эффекты выявлены не были, у пациентов с интерстициальным циститом и трофическими язвами наблюдалась длительная ремиссия. При применении производных плазмы, обогащенной тромбоцитами, во время оперативных вмешательств сокращался восстановительный послеоперационный период, не было отмечено развития гнойных осложнений.
Таким образом, продукты из плазмы, обогащенной тромбоцитами, могут служить дополнительным способом стимуляции восстановления ткани и лечения тяжелых рецидивирующих заболеваний с нарушением процессов регенерации.
ВЫБОР ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ
СОХРАНЕНИЯ СУСПЕНЗИИ КЛЕТОК,
ПРЕДНАЗНАЧЕННОЙ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
И.В. Гилевич1, 2, Е.А. Коломийцева1, В.Р. Потапова2
1 ГБУЗ НИИ Краевая клиническая больница
№ 1 им. профессора С.В. Очаповского МЗ КК, Краснодар, Россия
2 ФГБОУ ВО Кубанский государственный медицинский университет Минздрава России, Краснодар, Россия
e-mail: giliv@list.ru
Ключевые слова: дермальные фибробласты,
культивирование
В нашей работе мы анализировали влияние температурного режима и длительности хранения на функциональную активность клеток, подготовленных для использования (для экспериментального или клинического применения).
Для исследования были использованы дермальные фибробласты четвертого пассажа, культивированные при стандартных условиях в полной питательной среде,
состоящей из ДМЕМ [Э1Ьсо) и 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС). При достижении конфлюэнтности 8090% флаконы с клетками обрабатывали трипсином-ЕДТА, ресуспендировали до гомогенной взвеси. В зависимости от ресуспендирующего раствора клетки были разделены на 3 группы: 1 группа: контрольная, клетки, ресуспенди-рованные в растворе ДМЕМ и 10% ФБС; 2 группа: клетки, ресуспендированные в физиологическом растворе 1\аС1 0,9% и 10% альбумине; 3 группа: фибробласты, ресуспендированные в физиологическом растворе 1\аС1 0,9%. Каждая группа была подразделена на 3 подгруппы в зависимости от температурного режима хранения и длительности хранения: хранение при +4°С в течение 3 часов и 24 часов; хранение при +24°С в течение 3 часов и 24 часов; хранение при +37°С в течение 3 часов и 24 часов.
Нами установлено, что при температурном режиме +4°С количество клеток наиболее стабильно вне зависимости от ресуспендирующего раствора. Однако, при выборе наиболее оптимальных условий подготовки клеток необходимо учитывать и жизнеспособность клеток для чего был использован витальный краситель (трипановый синий). Помимо этого, при микроскопической оценке образцов учитывалось наличие агрегатов. При оценке этих двух параметров [жизнеспособность и агрегаты) наиболее удобоваримым оказались образцы, хранившиеся в растворах № 1 и № 2 при температуре +4°С, в течение 3-24 часов. При температурном режиме +20°С при длительном хранении появлялось значительное количество агрегатов, такие образцы не пригодны для использования. Вне зависимости от ресуспендирующего раствора при температуре хранения +37°С образцы демонстрировали снижение жизнеспособности клеток на 30-50%, и при хранении 24 часа были выявлены во всех образцах сплошь агрегаты. Показано, что нахождение клеток в физиологическом растворе через 24 часа приводит к потере их жизнеспособности более, чем на 50%. Поскольку перед нами была поставлена задача определить наиболее приемлемые условия хранения суспензии фибробластов, в том числе и с целью клинической реализации, то считаем самым подходящим ресуспендиру-ющий раствор № 2 [физиологический раствор 0,9% 1\аС1+ альбумин 10%), так как в растворе № 1 содержится ксено-генный продукт [фетальная бычья сыворотка).
Таким образом, результаты проведенного исследования позволили сделать нам вывод об условиях сохранения готовой суспензии дермальных фибробластов: ресу-спендирующий раствор [физиологический раствор 0,9% 1\аС1 + альбумин 10%), температура хранения +4°С, время хранения: от 0 до 24 часов.
ПРИМАТЫ КАК ЛАБОРАТОРНОЕ ЖИВОТНОЕ ДЛЯ СОЗДАНИЯ МОДЕЛИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ
И.В. Гилевич1, 2, И.С. Поляков1, 2, А.Л. Коваленко1, Д.Д. Карал-оглы3, С.В. Орлов3, В.А. Порханов1, 2
1 ГБУЗ НИИ Краевая клиническая больница
№ 1 им. профессора С.В. Очаповского МЗ КК, Краснодар, Россия
2 ФГБОУ ВО Кубанский государственный медицинский университет Минздрава России, Краснодар, Россия
3 ФГБНУ НИИ медицинской приматологии, Сочи, Россия
e-mail: giliv@list.ru
Ключевые слова: дыхательная система, нечеловекообразные приматы, торакальная хирургия, регенерация
Анатомические параметры и максимальное соответствие функциональным параметрам является важным критерием при выборе вида животного для создания модели повреждения дыхательной системы. Выбор модели примата был основан на анатомическом сходстве дыхательной системы с человеческой, что позволит максимально точно воспроизвести все аспекты оперативного вмешательства на легких: выделение дыхательных путей и легких, технику наложения швов, перевязку сосудов. Для создания экспериментальной модели были выбраны нечеловекообразные приматы вида Рарю апиЫэ [павианы анубисы). Исследование было выполнено в условиях ФГБНУ «НИИ медицинской приматологии». Данная работа была представлена 2 сериями экспериментов. Первым этапом моделировали повреждение трахеи с последующим ушиванием дефекта. Во второй серии экспериментов животным была выполнена левая пневмо-нэктомия под общей анестезией с вентиляцией одного легкого. Пневмонэктомию завершали формированием культи левого бронха. В зону дефекта трахеи и культю бронха вводили исследуемые продукты.
Эксперимент был выполнен на 11 половозрелых особях мужского пола, возрастом от 7 до 14 лет, весом — 22,4 ± 4,5 кг. 6 павианам была выполнена трахеотомия, 4 — пневмонэктомия. Весь период эксперимента животных содержали в индивидуальных клетках.
Животные были разделены на 2 группы: опытная и контрольная. Опытной группе вводили исследуемый клеточный продукт, контрольной группе — физиологический раствор 1\1аС1 0,9%. В послеоперационном периоде проводили ежедневный мониторинг витальных функций. Согласно протоколу исследования животных выводили из эксперимента на 3-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки. Для оценки регенеративного потенциала ткани в области введения исследуемого продукта проводили забор образцов трахеи и бронхов с последующим гистологическим исследованием. Для оценки общеклинического состояния животного проводили забор периферической крови. В течение всего периода наблюдения приматы чувствовали себя удовлетворительно, сохраняли двигательную активность, осложнений зафиксировано не было.
Таким образом, использование приматов в качестве крупных лабораторных животных представляет интерес для проведения трансляционных исследований повреждений дыхательной системы и открывает новые возможности для доклинических исследований в области регенеративной медицины.
РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРСОНИФИЦИРОВАННЫХ ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ В ВИДЕ ПЛАСТОВ ИЗ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
В.С. Глазьева1, П.И. Макаревич1, Н.А. Александрушкина1
1 Институт регенеративной медицины, МНОЦ МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: n.alexandrushkina@gmail.com
Ключевые слова: мезенхимные стволовые клетки, клеточные пласты,регенеративная медицина
Наиболее изученными и перспективными объектами для эффективного восстановления поврежденных
