CC BY
6
3. Nashine S. et al. Aging (Albany NY). - 2019. - Т. 11. - № . 4. -С. 1177.
4. De Gaetano, G. (2001). Lancet (London, England), 357(9250), 89-95.
БИОТРАНСПЛАНТАТ КУЛЬТИВИРОВАННЫХ КЛЕТОК ЭПИТЕЛИЯ ГУБЫ ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ ЭПИТЕЛИЯ РОГОВИЦЫ
М.Ю. Герасимов, Д.С. Островский, Б.Э. Малюгин, С.А. Борзенок
Лаборатория трансплантологии и клеточной биологии ФГАУ НМИЦ МНТКМикрохирургия глаза им. акад. С.Н. Федорова Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: gerasimovmy@mntk.ru
Ключевые слова: фибриновый гель, роговица, эпителий, биотрансплантат
В докладе будет представлен оригинальный подход к созданию биотрансплантата из культивированных клеток эпителия губы на основе фибринового геля.
Целью создания биотрансплантат является его применение в офтальмологии для установления нового эпителиального покрова на роговице у пациентов с тяжелыми заболеваниями, затрагивающих оба глаза.
Будет представлена полная технологическая цепочка его получения: 1) оценка иммунофенотипа места биопсии; 2) влияние культуральных систем на клетки; 3) морфология, иммунофенотип и проточная цитофлюори-метрия культивированных клеток; 4) технология сборки биотрансплантата; 5) жизнеспособность клеток в биотрансплантате; 6) моделирование выхода клеток.
ПОЛУЧЕНИЕ СЕКРЕТОМА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПРОИЗВОДНЫХ НЕРВНОГО ГРЕБНЯ, КУЛЬТИВИРОВАННЫХ В БЕЗСЫВОРОТОЧНОЙ СРЕДЕ
Т.Е. Гетманова, Ю.Р. Джумалиева, В.Р. Тагланов
ФГБОУ ВО Ставропольский государственный медицинский университет Минздрава России, Ставрополь, Россия
e-mail: tgetmanova734@gmail.com
Ключевые слова: стволовые клетки производные нервного гребня, секретом NCSCs, экзосомы, безсывороточная среда.
Благодаря своей легкодоступности и высокой пластичности, аутологичные стволовые клетки производные нервного гребня (neural crest-derived stem cells, NCSCs) взрослого организма представляют собой идеальный вид клеток для использования в регенеративной медицине при восстановлении костно-хрящевых дефектов [1]. Применение бесклеточных технологий, в которых используются только внеклеточные продукты их жизнедеятельности, сопоставимо по эффективности с трансплантацией клеток и наряду с культивированием NCSCs в среде свободной от сыворотки представляется более биологически безопасным [2, 3].
Первичные культуры стволовых клеток производных нервного гребня (neural crest related stem cells, NCSCs) мыши культивировались в свободной от сыворотки среде DMEM при 37°С и 10% СО2 (опыт) и в аналогичных условиях с добавлением 10% FBS (контроль). Для получения
секретома NCSCs клетки помещались в стерильный раствор PBS на 24 ч при комнатной температуре, после чего отбирали супернатант с последующей фильтрацией и центрифугированием. Анализ содержания нуклеиновых кислот и белка проводили методом фотометрии. Фракция экзосом выделялась с использованием метода магнитной сепарации и анализировалась при помощи проточной цитометрии.
В опытной группе наблюдалось более низкое, по сравнению с контролем, содержание нуклеиновых кислот и белка в полученном секретоме (на 12,37% и 9,84%) и уменьшение фракции экзосом (на 14,81%), при этом статистически значимых различий обнаружено не было.
Таким образом, наши предварительные данные свидетельствуют в пользу возможности применения безсы-вороточной среды для культивирования NCSCs в целях получения их секретома.
Литература:
1. Grimm W.D., Didenko N., Fritsch T et al. Biomedical Journal of Scientific and Technical Research. 2019. V. 17. № 2. P. 12732.
2. Zeuner, M.-T., Didenko, N.N., Humphries, D. et al. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2018. V. Apr 11. № 6. P. 39.
3. Диденко Н.Н., Серенко Т.В., Диденко М.О. Неделя науки — 2021. Материалы международного молодёжного форума: Сб. науч. трудов. Ставрополь: СтГМУ, 2021. С. 356.
ИЗУЧЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ В ОПУХОЛЕВЫХ СФЕРОИДАХ АДЕНОКАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ДОБАВЛЕНИИ ИНДУЦИРОВАННЫХ ЦИТОХАЛАЗИНОМ В МЕМБРАННЫХ ВЕЗИКУЛ
З.Е. Гилазиева, А.С. Пономарев, В.В. Соловьева, А.А. Ризванов
ФГАОУ ВО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
e-mail: zegilazieva@gmail.com
Ключевые слова: микроокружение опухоли, клетки глиобла-стомы, аденокарцинома молочной железы, мезенхимные стволовые клетки, мембранные везикулы, цитохалазин В
Опухолевые клетки и их микроокружение постоянно взаимодействуют и влияют друг на друга через внеклеточные везикулы, к которым относятся мембранные везикулы или микровезикулы (МВ). Изучение влияние МВ на опухолевые сфероиды может предоставить новые данные, которые будут играть роль в развитии биологии опухоли. Целью работы является установить изменения, которые происходит в опухолевых сфероидах под действием индуцированных цитохалазином B мембранных везикул мезенхимных стволовых клеток жировой ткани человека (иМВ МСК) и клеток глиобластомы человека (иМВ SNB-19).
В этом исследовании клетки аденокарциномы молочной железы (MCF-7) использовались для создания опухолевых сфероидов в суспензии. Клетки глиобласто-мы (SNB-19) и мезенхимные стволовые клетки (МСК), полученные из жировой ткани, были использованы для выделения иМВ с помощью 10 мкг/мл цитохалазина B. Добавление иМВ SNB-19 и иМВ МСК к сфероидам проводили в концентрациях 5 мкг, 10 мкг и 20 мкг. Влияние иМВ анализировали с помощью конфокальной микроскопии, проточной цитометрии и ПЦР в реальном времени. Кроме того, для анализа влияния ци-тохалазина В на везикулы было проведено их сравнение
с везикулами естественного происхождения (ЕВ) (без добавления цитохалазина В). ЕВ получали с помощью ультрацентрифугирования.
Для определения морфологии и размеров иМВ и ЕВ, выделенных из МСК и SNB-19 использовалась сканирующая электронная микроскопии, которая показала, что везикулы имеют округлую морфологию и размер иМВ МСК в среднем составляет 150 нм, а иМВ SNB-19 около 248 нм. Размер ЕВ, выделенных с помощью ультрацентрифугирования в среднем, составляет 148 нм для ЕВ МСК и 233 нм для ЕВ SNB-19. Полученные данные демонстрируют, что иМВ и ЕВ не отличаются размерами друг от друга. Было показано, что иМВ, как и ЕВ могут взаимодействовать с опухолевыми клетками MCF7 в монослойной культуре. Добавление иМВ МСК к данным сфероидам в концентрациях 5 мкг, 10 мкг, 20 мкг увеличивало их количество. Окрашивание сфероидов Annexin V показало, что концентрация 20 мкг иМВ МСК снижала жизнеспособность опухолевых клеток в сфероидах. Добавление иМВ SNB-19 к опухолевым сфероидам MCF7 также увеличивало их количество, однако, концентрация 20 мкг иМВ SNB-19 увеличивала жизнеспособность опухолевых клеток в сфероиде по сравнению с иМВ МСК. Добавление иМВ МСК влияло на экспрессию генов OCT4 и NANOG в сфероидах. При добавлении иМВ SNB-19 увеличивается экспрессия генов OCT4 и SOX2. Также статистически достоверная разница в экспрессии гена SLUG по сравнению с контролем наблюдалась при добавлении иМВ SNB-19.
Таким образом, был проведен сравнительный анализ влияния иМВ МСК и иМВ SNB-19 на формирование и качество сфероидов. Работа выполнена при поддержке Программы стратегического академического лидерства Казанского (Приволжского) федерального университета (ПРИ0РИТЕТ-2030), за счет средств Российского научного фонда (грант № 21-74-10021).
ПРИМЕНЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ПЛАЗМЫ, ОБОГАЩЕННОЙ ТРОМБОЦИТАМИ, У ПАЦИЕНТОВ ХИРУРГИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ
И.В. Гилевич1, 2, Е.А. Коломийцева1, Э.Н. Шубров1, 2, С.Н. Лепетунов1, Г.А. Забунян1, Р.В. Чучварев1
1 ГБУЗ НИИ Краевая клиническая больница № 1 им. профессора С.В. Очаповского МЗ КК, Краснодар, Россия
2 ФГБОУ ВО Кубанский государственный медицинский университет Минздрава России, Краснодар, Россия
e-mail: giliv@list.ru
Ключевые слова: плазма, обогащенная тромбоцитами, лизат тромбоцитов, тромбогель, клиническое применение, хирургия
Плазма, обогащенная тромбоцитами (ОбТП) — фракция, выделенная из периферической крови, содержание тромбоцитов в которой превышает физиологический уровень. Считается, что концентрация тромбоцитов в ОбТП должна составлять не менее 1000000/мкл, больше или меньше не будет оказывать регенеративный эффект. По мнению Marx R.E. ОбТП может называться только тот продукт, в котором в небольшом количестве плазмы содержится увеличенное количество тромбоцитов. Перед введением тромбоциты дополнительно активируются (Ca2+, тромбин, температурный режим).
В нашем исследовании одной из задач стояло получение конечного продукта объемом 20-30 мл, соблюдая
необходимые требования. При этом важно было определить наиболее подходящий способ активации, что, прежде всего, было обусловлено точкой приложения, особенностями хирургического вмешательства. Разработанный нами протокол выделения ОбТП и ее активации обеспечивал следующие характеристики конечного продукта: объем конечного продукта составлял 20-50 мл, стерильный. Клеточный состав готового продукта: содержание тромбоцитов составляло, в среднем, 1098 ± 58,68х 109/л, по сравнению с исходным уровнем - 312,3 ± 16,62х109/л, p<0,0001, при этом отсутствовало содержание лейкоцитов и эритроцитов. Для получения ОбТП был отработан протокол двойного центрифугирования: сначала на мягком режиме, чтобы получить наибольшую концентрацию тромбоцитов в плазме, далее жесткий режим, для уменьшения объема ОбТП. С целью активации был использован режим глубокой заморозки при -80С, с последующим размораживанием и хранением при -20С. Другой способ был основан на введении CaCl2 для активации аутологичного тромбина и далее смешивание тромбина с ОбТП для получения тромбогеля.
За период с 2017г. по 2021г. всего в исследовании приняло участие 166 человек с разной нозологией. В зависимости от заболевания пациенты были разделены на группы: стриктура уретры - 29 человек, интерстици-альный цистит — 36 человек, трофическая язва — 46 чел, хронический остеомиелит нижних конечностей - 8 чел., 47 пациентов с дефектами лицевого скелета. Для заполнения костных полостей был использован тромбогель. Для лечения трофических язв тромбогель и лизат тромбоцитов, в урологии применяли лизат тромбоцитов, курсами. При анализе полученных данных побочные эффекты выявлены не были, у пациентов с интерстициальным циститом и трофическими язвами наблюдалась длительная ремиссия. При применении производных плазмы, обогащенной тромбоцитами, во время оперативных вмешательств сокращался восстановительный послеоперационный период, не было отмечено развития гнойных осложнений.
Таким образом, продукты из плазмы, обогащенной тромбоцитами, могут служить дополнительным способом стимуляции восстановления ткани и лечения тяжелых рецидивирующих заболеваний с нарушением процессов регенерации.
ВЫБОР ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ
СОХРАНЕНИЯ СУСПЕНЗИИ КЛЕТОК,
ПРЕДНАЗНАЧЕННОЙ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
И.В. Гилевич1, 2, Е.А. Коломийцева1, В.Р. Потапова2
1 ГБУЗ НИИ Краевая клиническая больница
№ 1 им. профессора С.В. Очаповского МЗ КК, Краснодар, Россия
2 ФГБОУ ВО Кубанский государственный медицинский университет Минздрава России, Краснодар, Россия
e-mail: giliv@list.ru
Ключевые слова: дермальные фибробласты,
культивирование
В нашей работе мы анализировали влияние температурного режима и длительности хранения на функциональную активность клеток, подготовленных для использования (для экспериментального или клинического применения).
Для исследования были использованы дермальные фибробласты четвертого пассажа, культивированные при стандартных условиях в полной питательной среде,
