CC BY
15
состоящей из ДМЕМ [Э1Ьсо) и 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС). При достижении конфлюэнтности 8090% флаконы с клетками обрабатывали трипсином-ЕДТА, ресуспендировали до гомогенной взвеси. В зависимости от ресуспендирующего раствора клетки были разделены на 3 группы: 1 группа: контрольная, клетки, ресуспенди-рованные в растворе ДМЕМ и 10% ФБС; 2 группа: клетки, ресуспендированные в физиологическом растворе 1\аС1 0,9% и 10% альбумине; 3 группа: фибробласты, ресуспендированные в физиологическом растворе 1\аС1 0,9%. Каждая группа была подразделена на 3 подгруппы в зависимости от температурного режима хранения и длительности хранения: хранение при +4°С в течение 3 часов и 24 часов; хранение при +24°С в течение 3 часов и 24 часов; хранение при +37°С в течение 3 часов и 24 часов.
Нами установлено, что при температурном режиме +4°С количество клеток наиболее стабильно вне зависимости от ресуспендирующего раствора. Однако, при выборе наиболее оптимальных условий подготовки клеток необходимо учитывать и жизнеспособность клеток для чего был использован витальный краситель (трипановый синий). Помимо этого, при микроскопической оценке образцов учитывалось наличие агрегатов. При оценке этих двух параметров [жизнеспособность и агрегаты) наиболее удобоваримым оказались образцы, хранившиеся в растворах № 1 и № 2 при температуре +4°С, в течение 3-24 часов. При температурном режиме +20°С при длительном хранении появлялось значительное количество агрегатов, такие образцы не пригодны для использования. Вне зависимости от ресуспендирующего раствора при температуре хранения +37°С образцы демонстрировали снижение жизнеспособности клеток на 30-50%, и при хранении 24 часа были выявлены во всех образцах сплошь агрегаты. Показано, что нахождение клеток в физиологическом растворе через 24 часа приводит к потере их жизнеспособности более, чем на 50%. Поскольку перед нами была поставлена задача определить наиболее приемлемые условия хранения суспензии фибробластов, в том числе и с целью клинической реализации, то считаем самым подходящим ресуспендиру-ющий раствор № 2 [физиологический раствор 0,9% 1\аС1+ альбумин 10%), так как в растворе № 1 содержится ксено-генный продукт [фетальная бычья сыворотка).
Таким образом, результаты проведенного исследования позволили сделать нам вывод об условиях сохранения готовой суспензии дермальных фибробластов: ресу-спендирующий раствор [физиологический раствор 0,9% 1\аС1 + альбумин 10%), температура хранения +4°С, время хранения: от 0 до 24 часов.
ПРИМАТЫ КАК ЛАБОРАТОРНОЕ ЖИВОТНОЕ ДЛЯ СОЗДАНИЯ МОДЕЛИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ
И.В. Гилевич1, 2, И.С. Поляков1, 2, А.Л. Коваленко1, Д.Д. Карал-оглы3, С.В. Орлов3, В.А. Порханов1, 2
1 ГБУЗ НИИ Краевая клиническая больница
№ 1 им. профессора С.В. Очаповского МЗ КК, Краснодар, Россия
2 ФГБОУ ВО Кубанский государственный медицинский университет Минздрава России, Краснодар, Россия
3 ФГБНУ НИИ медицинской приматологии, Сочи, Россия
e-mail: giliv@list.ru
Ключевые слова: дыхательная система, нечеловекообразные приматы, торакальная хирургия, регенерация
Анатомические параметры и максимальное соответствие функциональным параметрам является важным критерием при выборе вида животного для создания модели повреждения дыхательной системы. Выбор модели примата был основан на анатомическом сходстве дыхательной системы с человеческой, что позволит максимально точно воспроизвести все аспекты оперативного вмешательства на легких: выделение дыхательных путей и легких, технику наложения швов, перевязку сосудов. Для создания экспериментальной модели были выбраны нечеловекообразные приматы вида Рарю апиЫэ [павианы анубисы). Исследование было выполнено в условиях ФГБНУ «НИИ медицинской приматологии». Данная работа была представлена 2 сериями экспериментов. Первым этапом моделировали повреждение трахеи с последующим ушиванием дефекта. Во второй серии экспериментов животным была выполнена левая пневмо-нэктомия под общей анестезией с вентиляцией одного легкого. Пневмонэктомию завершали формированием культи левого бронха. В зону дефекта трахеи и культю бронха вводили исследуемые продукты.
Эксперимент был выполнен на 11 половозрелых особях мужского пола, возрастом от 7 до 14 лет, весом — 22,4 ± 4,5 кг. 6 павианам была выполнена трахеотомия, 4 — пневмонэктомия. Весь период эксперимента животных содержали в индивидуальных клетках.
Животные были разделены на 2 группы: опытная и контрольная. Опытной группе вводили исследуемый клеточный продукт, контрольной группе — физиологический раствор 1\1аС1 0,9%. В послеоперационном периоде проводили ежедневный мониторинг витальных функций. Согласно протоколу исследования животных выводили из эксперимента на 3-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки. Для оценки регенеративного потенциала ткани в области введения исследуемого продукта проводили забор образцов трахеи и бронхов с последующим гистологическим исследованием. Для оценки общеклинического состояния животного проводили забор периферической крови. В течение всего периода наблюдения приматы чувствовали себя удовлетворительно, сохраняли двигательную активность, осложнений зафиксировано не было.
Таким образом, использование приматов в качестве крупных лабораторных животных представляет интерес для проведения трансляционных исследований повреждений дыхательной системы и открывает новые возможности для доклинических исследований в области регенеративной медицины.
РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРСОНИФИЦИРОВАННЫХ ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ В ВИДЕ ПЛАСТОВ ИЗ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
В.С. Глазьева1, П.И. Макаревич1, Н.А. Александрушкина1
1 Институт регенеративной медицины, МНОЦ МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: n.alexandrushkina@gmail.com
Ключевые слова: мезенхимные стволовые клетки, клеточные пласты,регенеративная медицина
Наиболее изученными и перспективными объектами для эффективного восстановления поврежденных
тканей в области регенеративной медицины в настоящее время считаются мезенхимные стволовые клетки (МСК). Одним из революционных подходов, объединяющих в себе методологии тканевой инженерии и клеточной терапии, стало применение клеточных пластов (КП) — многослойных конструкций из клеток и наработанного ими внеклеточного матрикса (ВКМ). МСК в составе КП характеризуются высокой жизнеспособностью, а наличие белков ВКМ и заякоренных в нем растворимых факторов способствует большей эффективности при использовании таких конструкций в терапии заболеваний.
Несмотря на очевидный потенциал применения КП из МСК, на сегодняшний день существуют ограничения для их широкого применения. В первую очередь, КП из МСК очень гетерогенны по своему составу, т. к. формируемая МСК тканеинженерная конструкция представляет собой многослойный пласт с организованным ВКМ. В связи с этим формируемые КП из МСК трудно стандартизируемы, ведь получаемые из тканей доноров МСК зачастую сильно отличаются друг от друга. Уникальные свойства используемых МСК усложняют процесс получения готовых конструкций заданных характеристик в установленные сроки.
В работе был отработан протокол получения КП из МСК и проведена детальная характеристика МСК, использованных для получения тканеинженерных конструкций и их анализа. Сравнительный анализ МСК в составе монослоя и КП позволил выявить ключевые параметры, которые определяют сроки сборки. Было установлено, что культуры МСК с длительным временем лаг-фазы формируют КП в более длительные сроки, при этом зависимости от скорости роста клеточной культуры обнаружено не было. Методами качественного и количественного анализа было экспериментально установлено, что высокое содержание коллагена I типа и IV типа в культивируемых МСК также положительно коррелирует с длительными сроками сборки КП.
Результаты, полученные в данной работе, расширят представление о механизмах, опосредующих сборку КП, что позволит разработать протоколы для получения в установленные сроки тканеинженерных конструкций заданных характеристик, пригодных для клинического применения. Исследование выполнено в рамках государственного задания МГУ им. М.В. Ломоносова и по перспективному направлению научно-образовательного развития Московского университета «Молекулярные технологии живых систем и синтетическая биология»
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГЕНЕРАЦИИ КЛЕТОК ОРГАНИЗМА И ВОЗРАСТНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ЧЕЛОВЕКА
В.В. Глебов1, 2, В.В. Шевцов3, Е.В. Аникина3
1 Российский государственный аграрный университет— МСХА им. КА. Тимирязева, Москва, Россия
2 Институт проблем управления
им. В.А. Трапезникова РАН, Москва, Россия
3 Российский университет дружбы народов, Москва, Россия
e-mail: vg44 author1@mail.ru
Ключевые слова: регенерация клеток, сенесценция, физиологические механизмы, возрастные заболевания человека
В теле организма человека существует более трехсот различных типов функциональных клеток, которые выполняют различные функции: размножение, деления,
терминальные, дифференцированные, а также постмито-тические клетки (нейроны, кардиомиоциты) и другие [2].
В ходе эволюции в организме человека сложились физиологические механизмы регенеративных процессов, которые позволяют обновлять клетки виде постоянно делящихся клеток, помогающие заменять отработанные и мёртвые клетки. Большую роль в этом играют стволовые клетки, которые могут не только делиться, но и становится клетками и исполнять те функции в тканях в которую они попадают [1].
Вместе с этим с возрастом отмечается сенесценция клеток, которые накапливаются в процессе старения, что ведет к генеративным нарушениям и неспособности к регенерации и обновлению клеток в теле организма. Это связано с каскадом физиологических процессов: увеличением роста провоспалительных цитокинов и ме-таллопротеиназы, что ведет разрушению внеклеточного матрикса (ВКМ). Помимо этого, отмечается накопление нефункцирующих фибробластов в кожном покрове, разрастанию близлежащих предраковых клеток [3].
Важно отметить, что процессы старения происходят на всех уровнях организма человека и проявляются в виде увеличения атеросклеротических бляшек, артрит-но-атрозных нарушениях опорно-двигательной системы, в язвах кожного покрова и резком деление клеток и поражении печени и во внутренних железах организма человека [1-3].
Таким образом, физиологические механизмы регенерации клеток организма тесным образом связано с возрастные заболеваниями человека, при которых запускаются воспалительные процессы.
Литература:
1. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. СПб.: «Наука», 2008. - т. 1 с. 465, т. 2, с. 473
2. Gomes N.M.V., Shay J.W., Wright W.E. (2010). Telomeres and Telomerase. The Comparative Biology of Aging (ed. Wolf N.S.). Springer, p. 227-259
3. Фаллер В.М. и Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. М.: «Бином-Пресс», 2006. — 235 с.
БИОПЕЧАТЬ ТРЕХМЕРНЫХ КОНСТРУКТОВ НА ОСНОВЕ КОЛЛАГЕНА И СФЕРОИДОВ ИЗ ХОНДРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ
Е.Г. Глинская1, О.Н. Кошуба2, А.Н. Копылов, С.Ш. Каршиева3, А.А. Левин3, С.В. Петров3, А.В. Ковалёв4, В.А. Миронов3, Е.В. Кудан3
1 ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. ИМ. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Москва, Россия
2 НИЯУ МИФИ, Москва, Россия
3 НИТУ МИСиС, Москва, Россия
4 ФГБУ НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова, Москва, Россия
e-mail: gliza@inbox.ru
Ключевые слова: сфероиды, коллаген, биопечать, хрящ, регенерация.
Лечение дефектов суставного хряща является одной из наиболее сложных задач современной ортопедии [1]. Новые перспективы в решении этой проблемы открылись с развитием тканевой инженерии и связаны с применением сфероидов, которые сохраняют функциональные характеристики хрящевой ткани и способны интегрироваться в нативную архитектуру хряща [2, 3].
