CC BY
10ВПЛИВ СЕЛЕН-ХРОМ-ЛШЩНО1 СУБСТАНЦП 13 Chlorella vulgaris Biej. НА ЕНЕРГЕТИЧНИЙ МЕТАБОЛ13М
У ЩУР1В
астрант Лукаш1в О. Я. к. б. н., доцент Боднар О. I.
к. б. н. Василенко О. В д. б. н., проф. Грубшко В. В.
кафедра загально1 бюлогп та методики навчання природничих дисциплт Тернопыьського нацюнального педагог1чного ушверситету iмет Володимира Гнатюка
Abstract. By incubation unicellular alga Chlorella vulgaris Biej. in aquaculture with sodium selenite and chrome (III) sulphate received and allocated stable lipid and selenium- chrome-lipid substance and studied their effects on energy metabolismin healthy rats experiment. Putting substances at a dose of 1.85 meg of selenium, chrome 1.1 mcg and 0.5 mg lipid per 1 ml of 1% aqueous starch slurry body in healthy rats every day for 14 days increased activity of succinate dehydrogenase and cytochrome oxidase. For the actions of the lipid complex has decreased activity glutamate dehydrogenase as NADH and NADPH, selenium-chrome-lipids complex activated as NAD-and NADP- glutamate dehydrogenase and changed their ratio is 3 times. This indicates activation in the liver of experimental animals energy metabolism using amino acids for energy.
The influence lipid extract and selenium, chrome-lipid complex of chlorella on oxidative status in rats showed that all of those factors we suppressed the activity of oxidative processes in serum and liver of experimental animals. This activated glutathione-dependent antioxidant link - content of reduced glutathione and glutathione peroxidase activities. The research allowed to mark the activation of lipid and selenium, chrome-lipid complexes of chlorella energy metabolism at the level of the Krebs cycle and macro production, and the level of use of amino acids as an energy substrate.
Keywords: selenium-chrome-lipids substance, Chlorella vulgaris Biej., energy metabolism, rats, enzymes.
Бiохiмiчнi функцп сполук селену в opraHi3Mi складт i pi3HOMaHrrai. Особливо! уваги щодо енергетичного обмшу заслуговують: участь у функцюнувант системи оксидази а-кетоглутарово! кислоти; кaтaлiзувaння окислення а-кетоглутарово! та тровиноградно! кислоти; участь в окисно-вщновнш OT^^i клггинних мембран; шпбування депдрогеназ, блокування сульфпдрильних ензимiв, опосередкований фермент-субстратний зв'язок з антиоксидантною системою [9, 20]. У присутносп селену зменшусться концентращя лшщв i глюкози в кров^ нейтральних жирiв в печшщ, змшюеться активнють фермента метаболiзму -декарбоксилаз, лужно! фосфатази, амшази; фермента енергетичного обмшу - сукцинат- та iзоцитрат- депдрогенази, глюкозо-6 фосфатдепдрогенази, лактатдепдрогенази, термшального ферменту дихального ланцюга - цитохром оксидази, у зв'язку з чим розвивасться гiпоiнсулiнемiя, порушення обмшу речовин, в т. ч. дiабет [9, 20].
Тривалентний хром (Cr3+) також е одним iз найважливших регуляторiв вуглеводного та енергетичного обмтв. Бюлопчна функщя хрому (III) в органiзмi людини i тварин полягае у збшьшент чутливосп до шсулшу i полшшент метаболiзму глюкози [11, 24]. Бюлопчно важливим регулятором енергетичного метаболiзму е також комбшащя селену з хромом [9].
Останшм часом як фармацевтично-активт пропонуються водоростевi селенвмюш препарати [7]. Добре зарекомендували себе препарати з хлорели (Chlorella vulgaris), жирт кислоти яко! мають антитоксичний [16] чи антисклеротичний ефекти [17].
Нами в попередшх дослщженнях встановлено оптимальш умови накопичення селену та цинку клггинами хлорели в аквакульт^ з бiологiчно адекватним для отримання бiодобавок вмiстом селену, цинку та складом лшщв [1]. З Chlorella vulgaris Beij. CCAP-211/Пв отримано з шдтвердженням чистоти, сталосп складу i структури мас-спектрометричним методом бюлопчно-активний селен-цинк-лiпiдний комплекс, як в органiзмi здорових щурiв пригшчували прооксидантнi процеси, активiзували антиоксидантний статус, сукцинатдегщрогеназну та цитохромоксидазну активностi [1]. Останш дослiдження показали гiпоглiкемiчнi ефекти хлорели за рахунок збiльшення поглинання глюкози в печiнцi i м'язах [12].
У зв'язку з зазначеним завданням цього дослщження було отримання з Chlorella vulgaris Beij. в аквакультурi очищено! селен -хром-лшщно! субстанцп i вивчення !! впливу на енергетичний статус здорових щурiв в експерименту
Матерiали та методи дослщження. Дослiдження здiйсненi на мiкропопуляцiях альголопчно чисто! культури Chlorella vulgaris Beij. CCAP-211/Пв, яку вирощували в умовах накопичення на середовищi Фiтцджеральда в модифшаци Цендера i Горхема №11 при температурi 22-250С та освггленш 2500 лк 16/8 год. [8]. В експеримент згiдно з попередшми результатами [3] до культури водоростей додавали водний розчин натрш селешту у розрахунку на Se4+ - 10,0 мг/дм3, та водний розчин CrCl36H2O з кiлькiстю Cr3+ - 5,0 мг/дм3. Бiомасу живих клггин вiдбирали на 7-му добу культивування. Контролем була культура, яку вирощували у середовищi без селешту та солi хрому.
Лшщи iз бюмаси водоростей екстрагували хлороформ-метаноловою сумiшшю за методом Фолча [15]: до одше! масово! частки волого! бiомаси додавали 20 масових часток екстрагуючо! сумiшi i залишали на 12 год. Нелшщт домiшки з екстракту видаляли вщмиванням 1% розчином KCl. Загальну кшьюсть лiпiдiв визначали ваговим методом тсля вiдгонки екстрагуючо! сумiшi [5].
Вмют селену в лiпiдному екстракп пiсля його озолювання нiтратною кислотою (HNO3) в герметичних бюксах при t=120°C протягом 2 год. визначали спектрофотометрично з о-фенiлендиамiном при довжиш хвилi 335 нм [4], а хрому тсля озолювання лшщного екстракту аналопчно, але у присутносп Н2О2, на атомно-адсорбцiйному спектрофотометрi Selmi С-115 М.
Постановка експерименту. Наважку видшеного з хлорели лiофiлiзованих лшщного та селен-хром-лшщного комплексiв, що мютили 3,70 мг селену/г лiпiдiв, 2,2 мг хрому/г лшщв розчиняли в 1% водному розчин крохмалю, 1 мл якого у тдсумку мютив 1,85 мкг селену, 1,1 мкг хрому i 0,5 мг лшщв.
Дослiди проводили на бiлих безпородних щурах-самцях з масою тiла 160-180 г, яких утримували на стандартному ращош вiварiю. Тварин було роздшено на три групи. Перша група щурiв - iнтактнi (контроль), яким вводили щоденно одноразово 1 мл фiзрозчину. Щурам друго! групи внутршньошлунково щоденно впродовж 14 дiб вводили лшщну суспензiю з хлорели на крохмальному розчиш, що мютила 0,5 мг лшщв в 1 мл суспензи, тваринам третьо! групи - видшений з хлорели лiпiдний комплекс з 1,85 мкг селену, 1,1 мкг хрому i 0,5 мг лшщв в 1 мл суспензи, що стввщноситься з щоденними фiзiологiчними нормами споживання цих мшроелеменпв [13].
На 14-у добу вщ початку експерименту проводили забш тварин шляхом евтаназп пiд тiопенталом натрiю.
Для дослщжень вiдбирали печiнку тварин (250 мг) i отримували гомогенат методом диференцшного гомогенiзування, яке проводили тсля попередньо! перфузi! з 2,5 мл фiзiологiчного розчину.
У печiнцi визначали актившсть ензимш енергетичного метаболiзму: сукцинатдегщрогенази (СДГ, КФ 1.3.99.1) - за окисленням сукцинату до фумарату феррищанщом калiю, що реесгрували спектрофотометрично при довжиш хвиш 420 нм [8]; цитохромоксидази (ЦО, КФ 1.9.3.1) - за конденсащею а-нафтолу та и-фентендиамшгщрохлориду з утворенням фенолу (540 нм) [22]; глутаматдегщрогенази (ГДГ, КФ 1.4.1.2) - за швидюстю окислення НАДН або НАДФН, яке фiксували при 340 нм. [10].
Кшьюсть бшюв визначали за Lowry еt al. [18].
Одержанi результати обробленi з використанням методiв варiацiйно! статистики за допомогою програми Statistica 6,0.
Результати дослщження та !х обговорення. Результати наших попередшх дослiджень показали, що лшщи акумулюють селен та хром [3]. Результати цього дослщження показали, що протягом 7 дiб шкубацп водоростей з селештом та юнами хрому спостерiгалося накопичення селену та хрому клгшнами Ch. vulgaris (табл. 1).
Так, за дп селешту спшьно з Cr3+ вмiст селену зростав на 345,8% щодо контролю. Хлорела також активно накопичуе хром у 5 разiв проти показниюв у контролi, який е одним з основних мшроелеменпв, що виконуе в органiзмi регуляторнi функцi! у багатьох ланках метаболiзму [23].
Хроматографiчний та мас-спектрометричний аналiз селенвмiсних лшщв Chlorella vulgaris [2], вирощених зависоких концентрацш Se (IY), показав, що селен присутнш в усiх фракщях лiпiдiв, механiзм включення елементу до !х складу поки -що не зрозумший, однак включенi в лшщи селен i метали зв'язуються з ними мщно, оскiльки в результат процедури
видшення в !х складi залишаеться значна кiлькiсть цих мшроелемента. Можливо, що цей зв'язок е не тшьки результатом адсорбцп мшроелемента, а й !х включенням до складу молекул лшдав за мюцем подвiйного зв'язку у ненасичених жирних кислотах або за рахунок мiжмолекулярно! взаемоди координацiйно [2, 20].
Таблиця 1. Вмют селену та хрому в лшщному комплексi з хлорели, п=5
Вмют Контроль Se(IY)+Cr3+ Вщхилення в1д контролю %
Селену (ГУ), мг/г сухо!' маси лшщв 1,07±0,01 3,7±0,15* +345,8
Хрому (III), мг/г сухо!' маси лшщв 0,44±0,05 2,20±0,07* +500,0
Примита: * - в1дмшност1 в1ропдш, р<0,05.
У нашому дослiдженнi визначено активнiсть ключового ферменту циклу трикарбонових кислот - сукцинатдепдрогенази (СДГ) та електроно-транспортного ланцюга -цитохромоксидази (ЦО), а також глутаматдепдрогенази. Встановлено, що лшдний екстракт та його селен-хромвмюний комплекс активували СДГ та ЦО (табл. 2).
Таблиця 2. Активнють деяких фермента енергетичного обмшу у печiнцi щурiв тсля застосування селен-лiпiдного та селен-цинк-лiпiдного комплекшв (M±m; п=9)
Умови дослщу СДГ, нмоль сукцинату, мг бшку*хв. ЦО, мг вдофенолу синього, мг бшку
Контроль 38,72 1,62 74,33±2,67
Л1шди 40,73 2,55 89,12±4,52*
Лшщи +Se(IY)+Cr (III) 61,85 3,62* 85,76±5,30*
При цьому, за споживання щурами лтдного екстракту активнють СДГ практично не зростала, то за споживання селен--хром--лшщного комплексу збшьшувалася майже на 160 %, а ЦО, зростала в обох випадках на 20 % та 15 % вщповщно проти !х значень у щурiв контрольно! групи.
Зростання цитохромоксидазно! активностi за ди як лiпiдiв окремо так i !х комплексу з селеном та хромом може бути пов'язане iз забезпеченням енерговитрат на адаптацшш процеси [6]. Жирш кислоти та йони металiв здатнi активувати !! каталiтичнi властивостi на молекулярному рiвнi [21].
Пiдвищення сукцинатдегiдрогеназно! активностi узгоджуеться з тдвищенням активностi цитохромоксидазно! ланки електронотранспортного ланцюга [19].
НАДН-глутаматдепдрогеназна активнють за ди лiпiдного екстракту з хлорели достовiрно знижувалася (на 32 %), а за ди селен-хром-лшщного комплексу - достовiрно зростала (на 410 %) (рис. 1).
Р
.3
£
04
с
с 5.
5
д
с г
16 14 12 10
5
6 4
*
* ■ НАДН-ГДГ.
□ НАДФН-ГДГ.
□ НАДН-ГДГ НАДФН -ГДГ
а
^ 1пП п
контроль
ЛНЦЦП Ulli IN+St'l П )+< I I III'
Рис. 1. Активтсть НАДН- та НАДФР- глутаматдеггдрогеназ i ix стввгдношення у печгнцг щур1в тсля застосування лШдного та селен-хром^тдного комплекте (M±m; n=9)
Актившсть НАДФН-ГДГ за введення щурам лшщного екстракту з хлорели також суттево зменшувалася - на 85 %, а за споживання щурами селен-хром-лшщного комплексу достовiрно зростала на 48 % щодо показника у тварин контрольно! групи.
Спрямованють глутаматдегщрогеназно! реакци, яка е зворотньою, а ïï напрям визначаеться наявшстю коферменту (НАД-залежна - пряма, НАДФ-залежна - зворотна), обумовлюе спрямування метаболiзму [19]. У прямiй реакцiя вщбуваеться дезамiнування глутамату з утворенням 2-оксоглутарату з подальшим його використанням у цикл Кребса або iнших метаболiчних системах, виконуючи енергетичну функцiю. У зворотнш реакцiï фермент спрямовуе метаболiзм у бiк бiосинтезу амiнокислот - синтетазний шлях.
В нашому експерименп спостерiгалося зростання показника спiввiдношення НАДН-ГДГ/НАДФ-ГДГ в обох випадках, бшьшою мiрою за дiï лiпiдного екстракту - 1,79, та 1,14 за споживання селен-хром-лшщного комплексу проти 0,41 у тварин контрольноï групи, що свщчить про активiзацiю каталiтичноï ланки нггрогенового метаболiзму. Переважання дезамiнування амшокислот через глутамат з утворенням кетокислот свщчить про ïх використання в енергетичному обмiнi, насамперед в цикл Кребса, що узгоджуеться з зростанням активностi сукцинатдегщрогенази, особливо за впливу селен-хром-лшщного комплексу з хлорели. Зниження абсолютних показникiв активностi глутаматдегiдрогеназ за ди лiпiдного екстракту може бути пов'язано з використанням самих лшщв як енергетичного субстрату.
Вс використаш нами чинники пригнiчували активнiсть окиснювальних процесiв у сироватцi кровi та печшщ дослiдних тварин [6]. При цьому активувалася глутатюн-залежна ланка антиоксидантного захисту
Отже, проведен дослiдження дозволили вiдмiтити активацiю лшщним та селен-хром-лiпiдним комплексами з хлорели енергетичного метаболiзму як на рiвнi циклу Кребса та виробництва макроерпв, так i на рiвнi використання амiнокислот як енергетичного субстрату.
Висновки. 3i складу хлорели Chlorella vulgaris Beij. CCAP-211/Пв в умовах аквакультури видiлено стабiльнi лiпiдний та селен-хром-лшщний комплекси, за введення яких щоденно впродовж 14 дiб у дозi з 1,85 мкг селену, 1,1 мкг хрому i 0,5 мг лшщв на 1 мл 1% водно-крохмально1' суспензи у печшщ здорових щурiв вщбувалося пщвищення активностей сукцинатдегщрогенази i цитохромоксидази. За споживання лшщного комплексу знижувалася актившсть глутаматдегщрогенази як з НАДН, так i з НАДФН, селен-хром-лшщний комплекс активував обидвi глутаматдегщрогенази i змшу 1'х сшввщношення в 3 рази, що свщчить про активащю у печшщ експериментальних тварин енергетичного метаболiзму з використанням як енергетичних субстрата амшокислот.
Л1ТЕРАТУРА
1. Вшярська Г. Б. Вплив селен-цинк-лшщно1' субстанцш з Chlorella vulgaris Biej. на оксидативний та енергетичний статус щурiв / Г. Б. Вшярська, П. Г. Лихацький, О. I. Боднар [та im] // Медична та клшчна хiмiя. - 2015. - Т. 17, № 4. - С. 10-17.
2. Вшярська Г. Б. Накопичення селену та його вплив на метаболiзм у Chlorella vulgaris Beij. в культурi за ди селешту натрда та йонш металш / Г. Б. Вшярська : автореф. дисертаци на здобуття наук. ступеня канд. бюл. наук. Спецiальнiсть 03.00.04 - бюх1м1я. - Тернопiль, 2016. - 21 с.
3. Винярская Г. Накопление селена в липидах Chlorella vulgaris Beijer. (CHLOROPHYTA) in vitro / Г. Винярская, О. Боднар, А. Станиславчук [и др.] // Actual problems in modern phycology, Conferin. Internationalе (5; 2014; СЫ§теи). Y International Conference „Actual problems in modern phycology", 3-5 nov., 2014, Chisinau, Moldova. - СЫ§теи : CEP USM, 2014. - С. 153-158.
4. Дедков Ю. М. Селен: биологическая роль, химические свойства и методы определения // Ю. М. Дедков, А. В. Мусатов. ВИНИТИ по РЖ Химия № 1688 - В 2002. - С. 19-23.
5. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов / М. Кейтс. - М. : Мир, 1975. - 322 с.
6. Лукашiв О. Я. Вплив селен-хром--лшщно1' субстанцп iз Chlorella vulgaris Biej. на оксидативний статус щурiв / О. Я. Лукашiв, О. I. Боднар, Г. Б. Вшярська [та im] // Медична та клшчна хiмiя. - 2016. - Т. 18, № 2. (в друщ).
7. Лукашiв О. Я. Селеновмюш бюдобавки: проблеми та перспективи використання / О. Я. Лукашiв, В. В. Грубшко // Матерiали IV Всеукрашсько1' наук.-практ. конференцп з мiжнародною участю "Хiмiя природних сполук". Тернопшь, 21-22 квггня 2016 р. - Тернопшь, 2016. - С. 34-36.
8. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике / А. В. Топачевский; под ред. А. В. Топачевского. - К. : Наукова думка, 1975. - 247 с.
9. Селен в жизни человека и животных / под ред. Л. П. Никитиной, В. М. Иванова. - М. : МП Союзиинформбиология, 1995. - 242 с.
10. Софьин А. В., Глутаматдегидрогеназы одноклеточной зеленой водоросли. Кинетические свойства / А. В. Софьин, В. Р. Шатилов, В. Л. Кретович // Биохимия. - 1984. - Т. 49, № 2. - С. 334-345.
11. Anderson R. A. Chromium, glucose in tolerance and diabetes / R. A. Anderson // J. Am. Coll. Nutr. - 1998. - Vol. 17. - P. 548-555.
12. Cherng J. Y. Improving glycogenesis in Streptozocin (STZ) diabetic mice after administration of green algae Chlorella / J. Y. Cherng // Life Sci. - 2006. - Vol. 78, № 11. - Р. 1181-1186.
13. Forceville X. Selenium, systemic immune response syndrome, sepsis and outcome in critically ill patients / X. Forceville., D. Vitoux., R. Gauzit [et al.] // Crit. Care. Med. - 1998. - Vol. 26, № 9. - P. 1536-1544.
14. Gojkovic C. Effect of Selenate on Viability and Selenomethionine Accumulation of Chlorella sorokiniana Grown in Batch Culture / C. Gojkovic, C. Vílchez, R. Torronteras [et al.] // Scientific World J. : Hindawi Publishing Corporation, 2014. - Vol. 2014, Article ID 401265. - P. 1-13.
15. Hokin L. E. Studies on the characterization of the sodium-potassium transport adenosinetriphosphatase оп the role of phospholipids in the enzyme / L. E. Hokin, T. D. Hexum. // Arch. Biochem. Biophys. - 1992 - Vol. 151, № 2. - P. 58-61.
16. Kim Y. Effect of Chlorella vulgaris intake on cadmium detoxification in rats fed cadmium / Y. Kim, S. Kwon, M. Kim [et. al.] // Nutr. Res. Pract. - 2009. - Vol. 3, № 2. - P. 89-94.
17. Lee H. S. Effect of Chlorella vulgaris on lipid metabolism in Wistar rats fed high fat diet / H. S. Lee, H.J. Park, M.K. Kim // Nutr. Res. Pract. - 2008. - Vol. 2, № 4. - P. 204-210.
18. Lowry O. H. Protein measurement with the folin phenol reagent / O. H. Lowry, N. I. Rosenbroug., A. L. Farr [et al.] // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193, № 1. - P. 265-275.
19. Metzler D. E. Biochemistry: The Chemical Reactions of Living Cells. 2nd ed. / D. E. Metzler. - New York-London : Academic Press, 2003. - 1973 р.
20. Selenium // Alternative Medicine Review. - 2003. - Vol. 8, № 1. - P. 63-71.
21. Sharpe M. Fatty acids as modulators of cytochrome c oxidase in proteoliposomes / M. Sharpe, I. Perin, J. Wrigglesworth [et al.] // Biochem. J. - 1996. - Vol. 320. - P. 557-561.
22. Straus W. Colorimetric microdetermination of cytochrome oxidase / W. Straus // J. Biol. Chem. - 1954. - Vol. 207, № 2. - P. 733-743.
23. Vincent J. B. Elucidating a biological role for chromium at a molecular level / J. B. Vincent // Accounts of Chemical Research. - 2000. - Vol. 33, № 7. - Р. 503-510.
24. Xiaogang Y. Effects of chromium on energy metabolism in lambs fed with different dietary protein levels / Y. Xiaogang, Z. Fangyu, L. Dong // Asian - Australasian J. Animal Sci. Publ. -2010. - Vol. 23, № 2. - Р. 205-212.
