CC BY
18
j Mechanisms
Regulatory Mechanisms
in Biosystems
ISSN 2519-8521 (Print) ISSN 2520-2588 (Online) Regul. Mech. Biosyst., 8(3), 369-376 doi: 10.15421/021757
The influence of a selenium-chromium-lipid complex obtained from Chlorella vulgaris on the energy metabolism in rats with experimental diabetes
O. Y. Lukashiv, V. V. Grubinko
Volodymyr Hnatiuk Ternopil National Pedagogical University, Ternopil, Ukraine
Article info
Received 12.06.2017 Received in revised form
28.07.2017 Accepted 29.07.2017
Volodymyr Hnatiuk Ternopil National Pedagogical University, M. Kryvonos Str., 2, Ternopil, 46027, Ukraine. Tel.: +38-097-225-34-66. E-mail: [email protected]
Lukashiv, O. Y., & Grubinko, V. V. (2017). The influence of a selenium-chromium-lipid complex obtained from Chlorella vulgaris on the energy metabolism in rats with experimental diabetes. Regulatory Mechanisms in Biosystems, 8(3), 369-376. doi: 10.15421/021757
One of the leading roles in treating diabetes mellitus belongs to chrome ions therapy (III), especially in the complex with selenium (IV). Currently selenium is obtained from unicellular algae, which contain biologically active substances and which are capable of accumulating exogenous microelements. By incubating unicellular algae Chlorella vulgaris Biej. in the conditions of aquaculture with sodium selenite (IV) and chromium (III) chloride, we obtained a biologically active lipid substance which contains selenium and chromium. The substance was tested for the impact on energy metabolism of animals exposed to experimentally induced diabetes mellitus. The diabetes was caused by modeling obesity of the animals with further injection of streptozotocin in the amount of 65 mg/kg and nicotinamide at the dose of 230 mg/kg. The rats were intragastrically injected with 1 ml of 1% starch solution which contained a selenium-chrome-lipid complex extracted from the Chlorella containing 0.6 ^g of selenium, 1.05 ^g of chrome and 0.5 mg of lipids for prophylactic, therapeutic and prophylactic-therapeutic purposes; the other group of rats for therapeutic purposes was injected with starch solution with the same composition of microelements in inorganic form - sodium selenite (IV) and chromium chloride (III). This paper presents the results of our study of the impact of organic and inorganic compounds of chrome and selenium on the energetic metabolism of rats exposed to experimental diabetes mellitus. The analysis determined that in the rats' organism, the selenium-chrome-lipid complex from the Chlorella improved the indicators of the energetic metabolism - in the group of rats which received it for therapeutic purposes, we observed an up to 7.5 fold increase in the activity of succinate dehydrogenase compared to the rats which did not receive therapeutic treatment. The increase in the activity of succinate dehydrogenase corresponded to the increase in the activity of cytochrome c oxidase to 17.2% - in the group of rats injected with the substance for therapeutic purposes. Also, the selenium-chrome-lipid complex activated NADPH-glutamatedehydrogenase in groups of rats which received it for prophylactic and therapeutic-prophylactic purposes. A decrease in NADPH-GDH was observed in all groups of rats which were injected with the Chlorella complex, and its activation was observed only in the group of rats injected with inorganic forms of selenium and chrome. In rats injected with the Chlorella complex, we observed change in the ratio of NAD and NADPH-GDH towards increase. This indicates the intensification of the energy metabolism in the animals' liver by using aminoacids as energetic substances. In the conditions of injecting inorganic forms of selenium and chrome, the ratio of NAD/NADPH decreased. Therefore, the results allow us to consider the algal complex obtained from Chlorella to be effective for regulating the energetic metabolism of subjects suffering from diabetis mellitus compared to the use of inorganic forms of chrome and selenium.
Keywords: microalgae; metabolism; micronutrients; streptozotocin; nicotinamide
Вплив селенхромлшщнот субстанци i3 Chlorella vulgaris на енергетичний метаболiзм у щурiв за експериментального цукрового дiабету
О. Я. Лукашiв, В. В. Грубшко
Тернотлъсъкий нацюналъний педагоггчний утверситет ¡мет Володимира Гнатюка, Тернотлъ, Украша
Унаслвдок шкубаци однокттинно! водоросп Chlorella vulgaris Biej. в умовах аквакультури з натрш селеттом i хром (III) хлоридом отримано та видшено стабшьну селенхромлшдну субстанщю, вивчено ii вплив на щурiв з експериментальним цукровим даабетом II типу на тл ожиршня. Дiабет викликали в два етапи: спочатку моделювали алiментарне ожиршня за допомогою висококалоршно! дieги та натрго глутамату упродовж чотирьох тижшв, наступним етапом ввдтворено модель цукрового дiабету шляхом внутршньоочеревинного уведення стрептозотоцину (65 мг/кг) i3 попередтм уведенням шкотинам^ (230 мг/кг). Щурам з експериментальним дiабегом уводили
внутршньошлунково очищену селенхромлiпiдну субстанцiю i3 хлорели, що мiстила 0,6 мкг селену, 1,05 мкг хрому та 0,5 мг лшдав, у складi 1% водно-крохмально! суспензи в кiлькостi 1 мл i3 профiлактичною, лiкувальною та л^вально-профшактичною метою. Iншiй групi щурiв i3 лiкувальною метою вводили внутршньошлунково неоргашчш форми хрому (III) та селену (IV) у виглядi хром хлориду та натрш селенiту в щентичнш кiлькостi. Наведено результати дослщження впливу органiчних (селенхромлiпiдного комплексу) та неоргашчних сполук хрому та селену на енергетичний мегаболiзм щурiв за експериментального цукрового дiабегу. Пiд час вживання селенхромлiпiдного комплексу i3 хлорели в органiзмi щурiв бiльшою мiрою полiпшувалися показники енергетичного обмiну, зокрема активнiсть цитохромоксидази, сукцинатдег1дрогенази та глутаматдегщрогенази. Результати дозволяють вважати отриманий водоростевий комплекс iз хлорели ефекгивнiшим га^вняно з неорганiчними формами хрому та селену.
Ключовi слова: м^оводоростц обмш речовин; мiкроелементи; стрептозотоцин; нжотинамщ
Вступ
Пропоноване дослвдження - маловивчене в науковш лгтера-Typi, а тому стаття претендуе на оригшальтсть. Упродовж остан-нiх роюв не опублжовано жодно! Грунтовно! пращ що стосуеться ща проблематики. Вiтчизнянi та заpyбiжнi вченi здебiльшого анапiзyвали вплив неоpганiчного хрому (Cr3*) на обмшт процеси за цукрового дiабетy, а також вивчали перспективи використання мжроводоросп Chlorella vulgaris Biej. у щypiв з експерименталь-ним дабетом.
Етдетчний характер поширення захворюваносп на цук-ровий даабет II типу (ЦД 2), що супроводжуеться ожиpiнням, -важлива проблема медицини. Близько 80% хворих на ЦД 2 ма-ють надмрну масу тша (Aguirre et al., 2011), до того ж у людей 1з потрним ступеней ожиршня частота д1абету зростае учет-веро, а з р1зко вираженим - у 30 раяв. Дослщження остантх pокiв вказують на значне поширення ожиршня, яке виступае основним фактором ризику не тшьки цукрового д1абету II типу, а й атеросклерозу, серцево-судинних захворювань i деяких шших патологш (Vlasenko et а1., 2011; Laakso and Kuusisto, 2014; Reaven, 2011). Ожиршня визнане Всесвiтньою оргатза-цiею охорони здоров'я як нова нешфекцшна ещдемш XXI сто-лiття. У зв'язку з низьким piвнем фiзичноi активном!, збшь-шенням у pацiонi висококалоршних продуктгв, а також некон-трольованим вживанням харчових добавок, наприклад, глута-мату натрта, понад половину дорослого населення Украши мае надмipнy масу тша. Остантми роками вiдмiчають постш-не збшьшення кiлькостi осiб iз надлишковою масою тша та цукровим дiабетом II типу, особливо серед працездатного населення, тому ЦД 2 та ожиршня - актуальт проблеми медицини (Vlasenko et а1., 2011; Khairoubi and Darwish, 2015). До того ж, даабет i ожиршня супроводжуються розвитком складних супутнх захворювань i ранньою iнвалiднiстю, а також висо-кою смеpтнiстю (Islam and Loots, 2009).
Сучаст погляди на етюлогто, механiзм розвитку та лшу-вання цукрового дiабетy II типу в основному сконцентроват на дослщжент pолi iнсyлiноpезистентностi та порушення функцп ß-клiтин тдшлунково! залози. Однак недостатня увага придшяеться шшим аспектам патогенезу, зокрема особливос-тям енергетичного обмшу, що зумовлюють весь спектр клшч-них проявгв цього захворювання.
Ефективтсть функцюнування енергетичних систем в оргатз-м - один iз критерив успшносп лжування ЦД (Stancic et а!., 2017). Вивчення енергетичного забезпечення може як послужити основою для визначення його pолi в патогенезi ЦД 2, так i бути подставою для розроблення нових методiв лжування та профшак-тики цього захворювання за допомогою корекцц виявлених порушень (Tatsumi et а!, 1998; Inzucchi et а1., 2012). За дабету на тлi активацй оксидативного стресу в оргатзм ввдбуваються знач-m змши молекулярно! структури мембран мггохондрш, що зумов-люе порушення функцюнування ферментних комплексiв дихаль-ного ланцюга (Mokryy et а!, 2016) i, як наслщок, бюенергетичних пpоцесiв у клпинах, оскiльки вуглеводи не можуть використову-ватися для енергетичних потреб печшкою, скелетними м'язами, серцем, нирками (Zanozyna et al., 2010; Stancic et al., 2017).
Незважаючи на досить широкий арсенал сучасних антидаа-бетичних засобiв, проблема реально! компенсаци цукрового дiабетy залишаеться невиршеною, що обГрунтовуе пошук i створення нових ефективних i, водночас, малотоксичних анти-
дiабеIичних 3aco6iB. Один i3 найперспекшвнших cnoco6iB про-фшактики порушень обмзну речовин - використання бюлопчно активних добавок (БАД), в яких мшеральш речовини природного походження перебувають у зв'язанш форм у природному комплексi з бшками, вуглеводами та лтдами. Значний штерес становлять комплекси селену та i бюлопчно активних метал!в (Lukashiv et а1., 2016).
Селен i хром (Ш) - вaжливi мжроелементи для обмшу речовин (Vincent, 2012a, 2012b, 2013), бо беруть участь у клгтин-ному зaхистi в!д вшьнорадикальних реакци i тому корист для запоб!гання знaчноï кiлькостi хвороб i ïх лжування (Vincent, 2012b; Selenium, 2003). Хром (Ш) бере участь у полiпшеннi метaболiзму в живих оргатзмах, адже в1н регулюе вуглевод-ний, протешовий та лшдний обмши (Brownley et al., 2015; Ganguly, 2016). Числент дослщження (Jain and Kannan, 2001; Cefalu and Hu, 2004; Cheng et al., 2004; Jainet al., 2007; Huaet al., 2012) показали, що хром корисний для лжування шсулшо-резистентносп та цукрового дабету у людей. У рая недостат-нього надходження Cr (Ш) в оргатзм! виникають метaболiчнi порушення, симптоми яких схож! на т!, що виникають за диабету та серцево-судинних захворюваннях (Cefalu and Hu, 2004). Cr (Ill) вщграе важливу роль у тдтримант нормального ргвня глюкози в кров! (Sundaram et al., 2012), знижен-н1 р!вня холестеролу та триацилглщерол!Б у плазм!, пригшчен-ш секреци запальних цигоишб, а в комплекс! !з селеном -шпбуе розвиток оксидативного стресу (Jain et al., 2007; Ganguly et al., 2017). Хром тдтримуе нормальну функцию шсулшу, сприяе транспорту глюкози з кров! в клгтини печшки, м'язгв i жировоï тканини.
Щодо хром- i селенумсних препаратв, споживання селенумсних продуктБ не може повшстю задовольнити потреби людини в селет, як i в багатьох шших мжроелементах, особливо в ïх комплексi. Багато сучасних добавок, однак, е синтетични-ми аналогами вiтaмiнiв i мшеральних речовин, вони не зв'язат у бюлопчт комплекси та можуть мати шшу структуру, н!ж нату-ральн1 нутрiенIи, а також вони часто низькоефекшвт та можуть виявляти по6!чн1 ефекти.
Останн1м часом як джерело селену та шших мткроелементтв використовують однокттинт фотосинтезувальн1 водоростг (Zo-lotor'ova et al., 2008) як джерело бюлопчно-акшвних речовин, утворених за рахунок внутршньоклгганного бiосинтезу, що можуть поглинати та накопичувати екзогенн1 мткроелементи, включаючи ïх до складу, насамперед, шгментв, 6!лк1б та л1ш1д!в (Minyuk, 2000). Досить добре зарекомендували себе, наприклад, препарати з хлорели, не тшьки як джерела 6!олог!чно доступного хлорофшу, низки вiтaмiнiБ, ам1нокислот, а й жирних кислот, що мають антитоксичний (Kim et al., 2009; Lee and Kim, 2009) чи антисклеротичний ефекти (Lee et al., 2008). У попередшх досл!д-женнях установлено опIимaльнi умови накопичення селену та мжроелеменлв клiтинaми хлорели в aквaкулыурi (Vinjarska et al., 2014).
Бкштчно виправдане отримання лгп^д-селенових суб-станцгй !з хлорели протягом 7 даб вирошування водоростг у середовищi з 10,0 мг Se4+/дм3, а оптимальне для досл1джень i перспектив видлення хром-лiпiдноï субстaнцiï !з хлорели використання концентраци хрому 5,0 мг/дм3 (Vinjarska et al., 2014). У здорових щур!б селенхромлiпiднa субстaнцiя збшьшу-вала сукцинaтдегiдрогенaзну та цитохромоксидазну активно-ст!, глутaмaтдегiдрогенaзний шлях утворення глутамату, що
сприяло утворенню та активному функц!онуванню компонента антиоксидантно! системи (Lukashiv et al., 2016).
Виходячи i3 цього, мета нашого дослiдження - оцшити стан енергетичних процесiв у шур!в i3 цукровим дiaбетом за впливу селенхромлiпiдного комплексу i3 Ch. vulgaris, а також порiвняти вплив неорган!чних i оргaнiчних сполук хрому та селену на енергетичний метaболiзм у шур!в за ц!е! патолог!!.
Матер1ал i методи досл1джень
Бiологiчно активну субстанц!ю отримали шляхом культи-вування мжропопуляцш aльгологiчно чисто! культури Chlorella vulgaris Beij. CCAP-211/11в в умовах накопичення у середо-вишi Фiтцджерaльдa в модифжапи Цендера та Горхема № 11 за температури +22...+25 °С та осв!тлення 2 500 лк 16/8 год (Topachevskyy, 1975). До культури водоростей додавали вод-ний розчин Na2SeO3 у розрахунку на Se4+ - 10,0 мг/дм3, та вод-ний розчин CrCl3 • 6H2O з умiстом Ci3+ - 5,0 мг/дм3. Бюмасу живих клiтин в!дбирали на сьому добу культивування. Контроль - культура, яку вирошували у середовишi без селенiту та юив хрому.
ЛЫди з включеними в них атомами селену та хрому у процес! метaболiзму in vivo з б!омаси водоростей екстрагували хлороформ-метаноловою сум!шшю у вiдношеннi 2 : 1 методом Фолча (Hokin and Hexum, 1992): до одн!е! масово! частки волого! бiомaси додавали 20 масових часток екстрагувально! сумтт! та залишали на 12 год., а нелтдн! домппки з екстракту видаляли вiдмивaнням 1% розчином KCl. Загальну кiлькiсть лiпiдiв визначали ваговим методом пiсля вiдгонки екстрагувально! сумтт! (Keyts, 1975). Вм!ст селену в лЫдному екстрак-тi тсля його озолення нiтрaтною кислотою (HNO3) в герме-тичних бюксах за 120 °С упродовж двох годин визначали спектрофотометрично з о'-фенiлендiaмiном за довжини хвил! 335 нм (Dedkov and Musatov, 2002), а хрому - тсля озолення лЫдного екстракту сумшшю нiтрaтно! (HNO3) та сульфатно! (H2SO4) кислот у герметичних бюксах визначали спектрофотометрично за допомою хромазуролу S за довжини хвил! 556 нм (Yatskiv et al., 2009).
Постановка експерименту. Об'ект досл!джень - б!л! безпо-родн! шури-самц (125 тварин) початковою масою 160-180 г. Утримання тварин та машпуляцй з ними проводили в!дпов!дно до положень «Загальних етичних принципов експериментв на тваринах», ухвалених Першим нацюнальним конгресом !з б!о-етики (Кшв, 2001), а також керувалися положеннями «Свропей-сько! конвенпи про захист хребетних тварин, як! використову-ються для експериментальних та !нших наукових ц!лей» (Страсбург, 1985). Тварин утримували у звичайних умовах вiвaрiю. Щури адаптован! 10 д!б у дослщнш к!мнап, повaженi та под!ле-н! на ом груп:
I - контрольна група - здоров! шури (К);
П-VII - тварини з експериментальним цукровим дабетом (ЕЦД):
II - тварини з ЕЦД, виведен! з експерименту на 21 -шу добу (ЦД 1); Ш - тварини з ЕЦД, виведет з експерименту на 35-шу добу (ЦД 2);
IV - тварини з ЕЦД + профшактичне уведення селенхромл!п!дно-
го комплексу (ЦД + П);
V - тварини з ЕЦД + уведення селенхромлквдного комплексу з
л!кувальною метою (ЦД + Л 1);
VI - тварини з ЕЦД + л!кувально-проф!лактичне уведення селенхромлквдного комплексу (ЦД + П + Л 1);
VII - тварини з ЕЦД + уведення хром хлориду CrC13 • 6H2O та натр!й селен!ту Na2SeO3 з лшувальною метою (ЦД + Л 2). Така к!льк!сть експериментальних груп шур!в допшьна, ос-
юльки дае змогу не лише дослщити л!кувальн! властивосп селенхромлквдного комплексу !з Ch. vulgaris за цукрового д!абе-ту II типу, а й вивчити його проф!лактичну д!ю при факторах ризику д!абету, пор!вняти л!кувальний вплив препарату !з хлоре-ли з д!ею неорган!чних сполук Cr3+ i Se4+ за цього захворювання.
Нин! в!домо понад десять експериментальних моделей цукрового д!абету, як! застосовуються в науково-медичнш
практиц!. Найпопулярн!шим методом моделювання ЦД в експериментальних тварин шляхом уведення !м певних х!м!чних речовин визнано використання стрептозотоцину (СТЗ) (Gryt-siuk et а1., 2014). П!д час вибору експериментально! модел! стрептозотоцинового цукрового дiабету брали за взiрець реко-мендаци Spasov et а1. (2011) та низки шших досл!дник!в (Islam and Wilson, 2012), яш показали, що у раз! превентивного вве-дення ткотинам!ду (НА) п!двищуеться стiйкiсть Р-кл!тин ост-рiвцiв Лангерганса до пошкоджувально! до стрептозотоцину. Ця модель дае змогу змоделювати стан, максимально близький до цукрового д!абету II типу, що проявляеться розвитком гшерглжеми, глюкозур!! без явищ ацидозу.
Виходячи з анал!зу л!тературних джерел (Nolan and F®rch, 2012), ми вир!шили змоделювати цукровий д!абет у два етапи, тобто змоделювати д!абет на тл! ожиршня в експериментальних тварин. Перший крок - моделювання ал!ментарного ожиршня, а наступний - в!дтворення стрептозотоцин-нжотинамщ-шдуковано! модел! ЦД 2.
Ожиршня моделювали шляхом 4-тижневого призначення висококалор!йно! д!ети, до складу яко! входили стандартна !жа (47%), солодке концентроване молоко (44%), кукурудзяна ол!я (8%), рослинний крохмаль (1%) з додаванням глутамату нат-р!ю у сшвв!дношенн! 0,6 : 100,0 (д!ета #С 11024, Research Dietes, New Brunswick, NJ) (Marushchak and Krynyts'ka, 2012). Ця модель дозволяе викликати ал!ментарне ожиршня, при цьому зменшуеться ризик загибел! тварин п!д час експеримен-ту (He et al., 2008; Luz et al., 2010). Тварини контрольно! групи упродовж усього перюду експерименту отримували cтандарт-ну !жу та мали в!льний доступ до води. Процес в!дтворення ал!ментарного ожир!ння контролювали шляхом зважування тварин, вим!рювання назально-анально! довжини та розрахун-ку шдексу маси тша (1МТ) - дшення маси тша в грамах на довжину в сантиметрах у квадрат! (Jeyakumar et al., 2006). Без-посередньо за передн!ми к!нц!вками тварини вим!рювали ок-ружн!сть трудно! кл!тки (ОГ), перед задн!ми к!нц!вками визначали окружн!сть живота (ОЖ). Вим!рювання проводили санти-метровою стр!чкою з точн!стю до 1 мм.
Другий етап - одноразове уведення д!абетогенного препарату стрептозотоцину ф!рми «Sigma» (США) внутршньооче-ревинно п!сля попереднього 24-годинного !х голодування за втьного доступу до питно! води з розрахунку 65 мг/кг (приго-товленого на цитратному буфер!) !з попередшм (за 15 хв) штра-перитонеальним уведенням нжотинамщу у доз! 230 мг/кг на ф!з-розчит. Контрольним щурам уводили тльки цитратний буфер.
Тваринам IV групи, починаючи з першого дня введення цитотоксину щодня упродовж 21 доби внутршньошлунково вводили 1 мл 1% водного крохмального розчину, який м!стив у соб! видлений !з хлорели та очищений в!дмиванням хлоро-форм-метаноловою сум!шшю (2 : 1) та 1% розчином кал!ю хлориду лквдний екстракт, що м!стив 0,6 мкг селену, 1,05 мкг хрому у 0,5 мг л!пщв, що сп!вв!дноситься !з щоденними ф!з!о-лог!чними нормами споживання цих м!кроелемент!в (Forcevil-le et а!, 1998; Iskra and Vlizlo, 2013).
Тваринам V групи введення селенхромлтдного комплексу починали з 21-! доби з моменту введення цитотоксину про-тягом 14 д!б.
Щурам VI групи суспензта призначали з першого дня вве-дення СТЗ упродовж 35 д!б.
Тваринам VII групи з 21-! по 35-ту добу вводили крохмаль-ний розчин натрш селен!ту та хром хлориду, який у перера-хунку на !они Se4+ ! Cr3+ м!стив !дентичну добову дозу цих м!к-роелемент!в.
Для чистоти експерименту тваринам I та II груп упродовж 21 доби вводили per os ф!з!олог!чний розчин, тваринам III групи -впродовж 35 д!б. Евтаназ!ю щур!в I, II та IVтруп здйснювали на 21-шу добу експерименту пд тюпенталовим наркозом, евта-назта Ш, V, VI та VII груп виконували аналог!чно на 35-ту добу.
Для досл!джень брали печшку та сироватку кров! тварин. Печшку (500 мг) використовували для отримання гомогенату
методом диференцшжй гомогетзацп, яку проводили тсля попереднкй перфузiï з 5,0 мл ф!зюлопчного розчину. Кров забирали i3 серця тварин, центрифугували за 3 000 об./хв протягом 30 хв для отримання сироватки.
Розвиток цукрового даабету II типу контролювали за вмк-том глюкози у кровi (ммоль/л), яку визначали глюкометром «Accu-Chek Active» фiрми «Roche Diagnostics GmbH» (Н!меч-чина), рiвнем фруктозамiну (Johnson et а1., 1982) у сироватц кровi, наявнiстю глюкози («Глюкотест», %) та кетонових тш у сечi («Ацетонтест», ммоль/л), якi визначали за допомогою шдикаторних смужок «ПВП «Норма».
Глюкозотолерантний тест проводили на 14-ту добу розвит-ку ЦД. Кров для дослщжень вiдбирали iз хвостовоï вени шурiв.
У печшщ визначали активтсть ензимiв енергетичного метаболiзму: сукцинатдепдрогенази (СДГ, КФ 1.3.99.1) - за окисненням сукцинату до фумарату фершцатдом калта, шо реестрували спектрофотометрично за довжини хвилi 420 нм (Рго1ююта, 1982); цитохромоксидази (ЦО, КФ 1.9.3.1) - за кон-денсацею а-нафтолу та и-феншендаамшпдрохлориду з утво-ренням фенолу (540 нм) (Straus, 1954); глутаматдепдрогенази (ГДГ, КФ 1.4.1.2) - за швидюстю окиснення НАДН або НАДФН, яке фжсували за 340 нм (Sof in et al., 1984).
Юльюсть бiлкiв визначали за Lowry еt al. (1951).
Отриман данi обробляли методами варiацiйноï статистики на основ! 8-13 повторiв. Статистичну обробку даних здшсню-вали за допомогою програмного пакета Statistica 6.0 (StatSoft, США). Обчислювали середне арифметичне (М) та стандартну похибку середнього арифметичного (m). Достовiрнiсть р!знищ показникв оцшювали за допомогою t-критерiю Стьюдента пiсля пiдтвердження нормальност! розподiлу вибiрки. В!ропд-ною вважали р!зницю м!ж вибiрками за Р < 0,05.
Результати
Хроматографiчний та мас-спектрометричний аналiз селен-умтсних лшвдв Ch. vulgaris (Perales et al., 2006), вирощених за високих концентраций Se (IV), показав, що селен присутнш у вах фракцiях лшвдв, механiзм включення елемента до ïх складу поки що не зрозумший. Однак включет в лтди селен i метали зв'язуються з ними мшно, оскшьки в результата проце-дури видiлення в ïх складi виявляеться значна юльюсть цих мiкроелементiв. Можливо, це - результат ïх включення до складу молекул лшщв за мсцем подвшного зв'язку у ненасичених жирних кислотах або за рахунок мiжмолекулярноï взаемодiï координацино (Selenium, 2003), що тим самим дозволяе вважа-ти ц комплекси ф!зюлопчно адекватними та збалансованими.
У попередтх експериментах (Lukashiv et al., 2016a, 2016b), яю здшснювались на здорових щурах-самцях !з масою тша 160-180 г тсля введення крохмального розчину селенхромль тдного комплексу, 1 мл якого мтстив 1,85 мкг селену, 1,1 мкг хрому, 0,5 мг лЫдав один раз на добу упродовж 14 даб, в оргатзм щургв не виявлено iнтоксикацiï, бо вмст середньомо-лекулярних пептидв (МСМ) знижувався: МСМ[ - в 1,6 раза, МСМ2 - в 1,4 раза. У печшщ та сироватщ кров! тварин знижу-валися вмст малонового даальдепду та даенових кон'югапв, а також тдвищувався енергетичний статус (збиьшувалася активтсть сукцинатдепдрогенази та цитохромоксидази), активу-вався глутаматдепдрогеназний шлях утворення глутамату, зросла активтсть каталази та вмст вщновленого глутатюну.
Протягом перюду моделювання ал!ментарного ожиршня вщмчалося збшьшення маси тша тварин. Зокрема, анал!з ос-новних анатомо-ф!зюлопчних показниюв на 28-шу добу експе-рименту вказуе на достов!рне щдвищення маси тша щургв до-слiдноï групи на 46,6% та шдексу маси тша - на 33,3%, поряд з! зростанням окружностей живота та груджд клики, поргвня-но з контрольною групою (табл.). Таким чином, достов!рне зростання бюметричних показниюв щургв дослщжй групи свщчить про розвиток ожиршня. Визначення вмсту глюкози та фруктозамшу в кров!, а також проведення глюкозотоле-
рантного тесту - одн з визначальних MapKepiB цукрового дiaбету. Проведенi нами дослщження показали, що на третю добу у тварин з експериментальним цукровим даабетом piBern глiкeмii зpiс у 3,8 раза поpiвняно з контрольними тваринами (15,9 ± 0,33 ммоль/л). 1з 14-i доби piвeнь глюкози у кpовi зни-зився до 8,9 ± 0,23 ммоль/л i до юнця спостереження майже не змiнювaвся. Також у тварин i3 дабетом на 21-шу добу шдукци ЦД спостерггали iстотнe щдвищення концентраци фруктозамъ ну у сиpовaтцi кpовi (в 1,9 раза, трупа ЦД1), що свщчить про активащю пpоцeсiв неензимного глжозилювання, а також про посилення метабол1зацп глюкози гeксозaмiновим шляхом (тобто з утворенням фруктози) в iнсулiнонeчутливих тканинах (Reznilfflv, 2003).
Таблиця
Бюметричт параметри тварин (М ± m)
Показники Групи щур!в
контроль, n = 16 ожир!ння n = 109
Маса т!ла, г 192,1 ± 1,3 281,7 ± 2,0*
Довжина т!ла, см 20,02 ± 0,96 20,98 ± 0,44
1ндекс маси тла, г/см2 0,48 ± 0,02 0,64 ± 0,01*
Окружн1сть грудно1 кл1тки, см 11,18 ± 0,53 15,21 ± 0,51
Окружтсть живота, см 12,76 ± 0,41 18,3 ± 0,55
Окружн1сть живота / 1,14 ± 0,04 1,20 ± 0,03
окружшсть грудно! кл!тки
Примтка: * - р1зниця достов1рна иор1вняно з контрольними тваринами за Р < 0,05.
У здорових тварин piвeнь глюкози у сeчi складав 0%, пiсля введення цитотоксину на 3-7-му добу зpiс до 0,5%, дал показник становив 0,1%. 1з 7-i доби пiсля введення СТЗ кетонових тш у сeчi не знайдено. Отpимaнi результати вказують на вiдсутнiсть кетоацидозу, характерного для цукрового дабету I типу.
Проведений глюкозотолерантний тест показав, що у тварин з експериментальним ЦД piвeнь глжеми через да години з моменту введення глюкози становив 13,4 ± 0,52 ммоль/л, у тварин контрольна групи - 5,6 ± 0,62 ммоль/л. Результати свщчать про порушення толерантносп до глюкози у щуpiв з ЕЦД.
Основнi бiохiмiчнi процеси, що мають вщношення до енергетичного обмшу та вщбуваються в мттохондаях, - цикл три-карбонових кислот (цикл Кребса), Р-окиснення жирних кислот, карнпиновий цикл, транспорт електрошв у дихальний ланцюг i окисне фосфорилювання. Кожен з них може бути причиною мттохондр1альжа дисфункцп (Morino et al., 2006; Grattagliano et al., 2012). Враховуючи велику юльюсть ензим1в, що беруть участь у генерувант енерги в клiтинi, у нашому достдженн1 визначено aктивнiсть ключового ензиму циклу трикарбонових кислот (сукцинатдепдрогенази) та електронотранспортного лан-цюга (цитохромоксидази), а також глутаматдеддрогеназну актив-тсть, яка пов'язуе eнepгeтичнi та бюсинтетичт процеси в клiтинi.
Адекватне вщображення вираженосп дисметаботчних про-цeсiв i стану енергетичного обмшу - активтсть сукцинатдецдро-генази (СДГ). СДГ належить до сукцинатоксидазжа системи фер-менпв, об'еднаних у ланцюг у мтохондаях. СДГ - перший ензим uiei системи, цитохромоксидаза - остaннiй. 1х aктивнiсть вщобра-жае енергетичний потенщал клпини, функщональний стан i кшь-кють активних мпохондрш. Деяю автори (Readon et al., 1992) за-значають, що ЦД мае перше мсце серед ендокринопатй, виявле-них за мiтохондpiaльноi пaтологii. Здгйснюючи окиснення в орга-н!зм1, СДГ бере участь у знешкоджент токсин!в i недоокиснених продуктов, що з'являються у хворих на ЦД. Активн1сть цього ензиму - показник окисного метабол1зму у кл1тинах д1абетик1в (Ferreica et al., 2003).
У тварин на 21-шу добу розвитку ЦД активносп ЦО та СДГ у печшщ знизилися ввдповщно на 20,0% i 10,5%, поргвняно з контрольною групою (рис. 1). При ЦД 2 з ожиршням внутршньо-клпинний piвeнь НАДФН, як правило, тдвишуються, що ви-кликае збiльшeння продукци супepоксид-paдикaлiв, посилення оксидативного стресу та появу деструктивних пpоцeсiв у ткани-
нж (Gupte et al., 2009). У narnnx дoслiджeнняx y щypiв iз дiaбe-том aктивнiсгъ HАДФH-ГДГ (рис. 2) зpoслa yHeraepo пopiвнянo
з кompoлeм, HАДH-ГДГ знизилaся лиme ни 2,3%, a сшввщ-нomeння HАДH-ГДГ/HАДФH-ГДГ змeншилoся в 4,1 paaa.
5 S
u я
^ «
и я я
я и
£ .5
И io
80
70
60
50
S " 40
30
20
10
ДО СДГ
ЦД1 ЦД2 ЦД+П ЦД+Л1 ЦД+П+Л1 ЦД+Л2
Рис. 1. Активтстъ циIoxpoмoксидaзи ти сyкцинaтдeгiдpoгeнaзи y шчшщ щypiв пiсля зистосувиння сeлeнxpoмлimднoгo кoмплeксy Ia ввeдeння нeopгaнiчниx фopм Cr3+ Ia Se4+ (M ± m; n = 8-13): piзниця пoкaзникiв дoстoвipнa (P < 0,05) вщносно * - кoнгpoльнoï групи (К), # - вщносно ipynn ЦД 2
UI m « £
К .5
& «3
О и
16
14
12
10
Í © А
а 5
Я S
m нч
я л
^ к
* §
< S Я
HАДH-ГДГ
HАДФH-ГДГ
HАДГ-ГДГ/HАДФH-ГДГ
К
ЦД1 ЦД2 ЦД+П ЦД+Л1 ЦД+П+Л1 ЦД+Л2
Рис. 2. Активтстъ HA,HH- Ia HАДФH-глyтaмaтдeгiдpoгeнaз i ïx спiввiднoшeння y пeчiнцi щypiв пiсля зистосувиння сeлeнxpoмлiпiднoгo кoмплeксy Ia ввeдeння нeopгaнiчниx фopм Cr3+ ти Se4+ (M ± m; n = 8-13): piзниця пoкaзникiв дoстoвipнa (P < 0,05) вiднoснo: * - кoнтpoльнoï гpyпи (К), | - вiднoснo гpyпи ЦД1, # - вщносно ^уии ЦД 2
BMRnem змни ввдтаждаютъ китчиш rap^m, що сyпpoвoд-жуе poзвиroк дiaбeгy ти узгоджуеться з мeIaбoлiчними Hop^eE-нями y xвopиx ни iнсyлiннeзaлeжний ЦД. Зи ввeдeння сeлeнxpoм-лкпдного кoмплeксy вiдмiчaеться пiдвищeння aктивнoсгi СДГ (жс. 1), зо^ми, y ^ym ЦД + Л 1 ïï aктивнiсгъ збiльmилaся y 7,5 paaa пopiвнянo з гpyпoю ЦД 2, y ipym ЦД+Л 2 збiльшeння в1дбулося лиme ни 3%, a y Fpym ЦД+П+Л 1 - y 5,2 paaa.
Пiдвищeння сyкцинaтдeri1дpoгeнaзнoï иктивносп узгоджуеться з oiдвищeнням иктивносп циIoxpoмoксцдaзи: y Fpym ЦД + Л 1 вщмчнетъся ooлiomeння aктивнoсгi ЦG ни 17,2%, y гpyoi ЦД+ Л 2 - ни 49,1% ти ни 7,0% y гpyпi Ц Д+П+Л 1 ¿ис. 1). Активтстъ СДГ i ЦG y mypib, яким уводили сeлeнxpoмлioiдний кoмoлeкс iз opoфiлaктичнoю мсгою, газнич^} знизилися.
HАДH-глyтaмaтдeгiдpoгeнaзнa aктивнiсгъ зи до сeлeнxpoм-лкпдного кoмoлeксy iз xлopeли дoстовipнo зpoслa ни 80,6%i y ipym ЦД + П пopiвнянo з гpyпoю ЦД 1, y ipym ЦД + Л 1 ти ЦД+Л 2 (зи ввeдeння нeopгaнiчниx фopм Cr^ Ia Se4+) aкIивнiсгъ HÄflH-ГДГ знизилися ни 43,0% i 39,8%, вiдooвiднo, a y Fpym ЦД+П + Л 1
зpoслa ни 90,3% щодо покизники твapин гpyпи ПД7. фис. 2).
Активтстъ П^Ф^Г^ зи ввeдeння щypaм сeлeнxpoмлi-шдного кoмoлeксy iз xлopeли також сугтево змeнmyвaлaся y ^ym ЦД + П (в 2,1 paзa вiднoснo гpyoи ЦД 1), a зи споживиння щypaми сeлeнxpoмлioiднoгo кoмoлeксy гpyп ЦД + Л 1 ти ЦД + П + Л 1 дoстoвipнo знизилися в 2,3 ти 1,9 paзa, лиme зи ввeдeн-ня нeopгaнiчниx фopм Cr3+ Ia Se4+ покизник зpiс в 1,9 paзa щодо покизники y IEapm гpyпи ЦД 2 (pис. 2).
B eкспepимeнгi спoсгepiгaли зpoстaння покизники сшвввдно-meння HАДH-ГДГ/HАДФ-ГДГ (pис. 2) в ydx Fpynax гвapин, яким уводили сeлeнxpoмлiпiдний кoмплeкс, бiльmoю mpoKi y гpyпi ЦД + П - в 3,7 paзa (щодо ^упи ЦД1) Ia y ^ym ЦД + П + Л 1 - в 3,5 paзa вiднoснo гpyпи ЦД2. Зpoсгaння спiввiднomeння ELAHH-ГДГ/Г[АДФ-ГДГ свiдчигъ npo aкгивiзaцiю кaгaлiтичнoï линки тт-poгeнoвoгo мeгaбoлiзмy в opгaнiзмi твapин. CyтIевe знижeння по-кизники спiввiднomeння HАДH-ГДГ/HАДФ-ГДГ вщмчзлося y гpyпi mypib, яким уводили нeopгaнiчm фopми Cr^ Ia Se4+ вiднoс-но гpyпи ЦД 2, a y Fpym ЦД+Л 1 покизник зpiс в 1,2 paзa.
0
*
8
6
4
2
0
Отримаш результата свщчать про актив!защю енергетич-ного метаботзму за введення селенхромлквдних комплекс!в !з хлорели на фот ЦД 2 як на ршт циклу Кребса, так в термъ нальнш фаз! дихального ланцюга, а також про використання амшокислот як енергетичного субстрату.
Обговорення
Експериментально вщтворений цукровий дабет II типу в!д-значаеться порушенням метаболвму в органзм щур!в, що тд-тверджуеться результатами комплексних бюхмчних дослвджень. Глибою розлади енергетичного обмшу виникають за дабету, коли значно зменшуеться вироблення макроерпчних сполук у зв'язку з порушенням дихального ланцюга, зумовленим обмеженням по-тужносп циклу Кребса (F erreica et а!, 2003).
Адекватне вщображення вираженост! дисметаботчних про-цеав i стану енергетичного обмшу - зменшення активност! цито-хромоксидази, сукцинагдецдрогенази, НАДН-глутаматдещроге-нази, актив!зацк дяльносп НАДФН-ГДГ, а також зниження стввщношення НАДН-ГДГ/НАДФ-ГДГ.
Спрямоватсть глутаматдепдрогеназнм реакцiï, напрям якоï визначаеться наявтстю коферменту (НАД-залежна - пряма, НАДФ-залежна - зворотна), зумовлюе напрям метаботзму (Metzler, 2003; Dudina, 2005). У прямш реакцiï вщбуваеться дезамшування глутамату з утворенням 2-оксоглутарату з по-дальшим його використанням у цикл! Кребса або шших мета-ботчних системах, виконуючи енергетичну функпто. У зво-ротнш реакпи фермент спрямовуе метабол!зм у бж бюсинтезу амшокислот (синтетазний шлях). Закономрносп активност! глутаматдепдрогенази з НАД+ та НАДФ+ свщчать про перева-жання утворення глутамату над його дезамшуванням, тобто актив!защю зв'язування ам!аку як один !з девих детоксикаци-них механзмгв, який розвиваеться тд час використання амшо-кислот як енергетичних субстратгв у стресових i патолопчних станах (Grubinko and Arsan, 1998).
Результата дослщжень сшввщносяться з даними окремих авторгв (Shibata et al., 2003; Jeong et al., 2009) про те, що хлорела може бути корисною для профшактики дабету та розвитку да-бетичних ускладнень, а також володе гшоглжетчним ефектом. Завдяки властивостям Ch. vulgaris акумулювати !з середовища культивування юни неметал1в i метал!в, а також накопичувати екзогенн мжроелемента, включаючи ïх у значнш юлькост! до складу лкпдв, антидабетична дя хлорели посилюеться. Пер-оральне введення в органзм лабораторних щур!в з експеримен-тальним дабетом селенхромлшдного комплексу з Ch. vulgaris покращило енергетичний статус щургв.
З огляду на дат, вщображен в рисунках 1 та 2, можна уз-годити ïх !з твердженнями, наведеними Cefalu et al. (2004) про те, що вщповщь оргатзму на дю Cr3+ та Se4+ залежить в!д форми його введення. Добавки хрому використовують у вигляд неоргаичних (в основному це хлорид хрому) та органчних (нжотинат хрому, пжолшаг хрому, цитрат хрому, ацетат хрому) сполук, а також у вигляд хромумсних даждж1в. На думку деяких достднижв, неоргашчн сполуки хрому мають нижчий ргвень засвоення цього елемента в оргатзт поргвняно з органчними сполуками, не зв'язан у бюлопчш комплекси та можуть мати шшу структуру, тж натуральн нутр!енти; вони часто проявляють низьку ефективтсть i можуть виявляти по-б!чш ефекти. Зпдно з даними Vincent (2012), бюзасвоення хрому з неорганчних сполук невисоке (до 1%), однак воно зрос-тае до 25% за надходження хрому у вигляд! органчних сполук (пжолшати, нжотинати, цитрати). Таким чином, результати дослщжень дозволяють зробити обгрунтований висновок про те, що використання селенхромлквдного комплексу, видленого !з хлорели, дае набагато бшьший терапевтичний ефект при змо-дельованому ЦД, i е ефективншим, пор!вняно з неоргашчними сполуками, засвоення яких в органзм набагато нижче.
Висновки
Дослщження дозволило вперше Грунтовно вивчити вплив лтдв Ch. vulgaris за спшьжа дii Cr3+ та Se4+ на енергетичний метабол1зм щургв за змодельованого ЦД 2. Селенхромлгщдний комплекс проявляе вплив на обмшн процеси в оpгaнiзмi тварин за експериментального цукрового дабету.
Отриман1 результати - зростання ргвня фруктозамгну, гш-кеми, глюкозури, вщсуттсть кетонури, а також оцшка дина-мжи глжеми тд час проведення орального тесту толерантносп до глюкози у щургв, за якого piвeнь глжеми через 2 години вгд моменту введення глюкози залишався вищим за 13 ммоль/л, св1дчили про розвиток ЦД 2 у щургв.
1з Ch. vulgaris в умовах аквакультури видлено стабшьний селенхромлквдний комплекс, за введення якого щурам з екс-периментальним цукровим д1абетом у доз! з 0,6 мкг селену, 1,05 мкг хрому в 0,5 мг лтдв на 1 мл 1% водно-крохмальжа суспензи у печшщ вщбувалося щдвищення активностей сук-цинатдепдрогенази та цитохромоксидази. Виняток становлять лише т! групи тварин, яким уводили селенхромлтдний комплекс !з профглактичною метою, у них активн1сть досл1джених ензимгв незначно знизилася.
Селенхромлгпгдний комплекс активував НАДН-глутамат-дег1дрогеназу у групах щургв, яким його вводили з профшак-тичною та лГкувально-профглактичною метою. Вщбулося зниження НАДФН-ГДГ у вах групах щургв, яким уводили комплекс !з Ch. vulgaris, його активацто в1дм1чали лише у груш щургв, яким уводили неорган1чн1 форми селену та хрому. За введення селенхромлгщдного комплексу з мжроводоросп вщбулася змгна спГввгдношення активност! НАД+ та НАДФ+-ГДГ у бгк зростання (до 3,7 раза у грут ЦД + П), що св1дчить про прискорення у печ1нц1 експериментальних тварин енергетичного метабол1зму з використанням як енергетичних субстрапв амшокислот. За введення неорган1чних форм селену та хрому сшвв1дношення НАДН/НАДФН знижуеться.
Результати показали позитивний вплив селенхромлкпдного комплексу з Ch. vulgaris на енергетичний обмгн щургв з експери-ментальним ЦД 2 над неоргаычними формами хрому та селену. Це дозволяе вважати даний комплекс !з хлорели перспективним регулятором енергетичного метаботзму за цукрового дабету.
References
Aguirre, L., Arias, N., Macarulla, T., Gracia, A., & Portillo, M. (2011). Beneficial effects of quercetin on obesity and diabetes. The Open Nutraceuticals Journal, 4, 189-198.
Brownley, K. A., Boettiger, C. A., Young, L. A., & Cefalu, W. T. (2015). Dietary chromium supplementation for targeted treatment of diabetes patients with comorbid depression and binge eating. Medical Hypotheses, 85(1), 45-48. Cefalu, W. T, & Hu, F. B. (2004). Role of chromium in human health and in
diabetes. Diabetes Care, 27(11), 2741-2751. Cheng, H. H., Lai, M. H., Hou, W. C., & Huang, C. L. (2004) Antioxidant effects of chromium supplementation with type 2 diabetes mellitus and euglycemic subjects. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(5), 1385-1389. Dedkov, Y. M., & Musatov, A. V. (2002). Selen: Byolohycheskaya rol', khymy-cheskye svoystva y metody opredelenyya [Selenium: Biological role, chemical properties and methods of determination]. Chemistry, 1688, 19-23 (in Russian). Dudina, Y. V. (2005). Effect of kainate-induced experimental epilepsy on NADPH-diaphorase and calcium-binding proteins in rat hippocampal neurons. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 139(3), 309-312. Ferreica, F. M., Palmeira, C. M, Seica, R., Moreno, A. J., & Santos, M. S. (2003). Diabetes and mitochondrial bioenergetics: Alterations with age. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology, 17(4), 214-222. Forceville, X., Vitoux, D., Gauzit, R., Combes, A., Lahilaire, P., & Chappuis, P. (1998). Selenium, systemic immune response syndrome, sepsis and outcome incritically ill patients. Critical Care Medicine, 26(9), 1536-1544. Ganguly, R., Sahu, S., Ohanyan, V., Haney, R., Chavez, R., Shah, S., Yalaman-chili, S., & Raman, P. (2017). Oral chromium picolinate impedes hypergly-cemia-induced atherosclerosis and inhibits proatherogenic protein TSP-1 expression in STZ-induced type 1 diabetic ApoE-/- mice. Scientific Reports, 7, 45279.
Ganguly, R., Wen, A. M., Myer, A. B., Czech, T., Sahu, S., Steinmelz, N. F., & Raman, P. (2016). Anti-atherogenic effect of trivalent chromium-loaded CPMV nanoparticles in human aortic smooth muscle cells under hyperglycemic conditions in vitro. Nanoscale, 8(12), 6542-6554.
Grattagliano, I., de Bari, O., Bernardo, T. C., Oliveira, P. J., Wang, D. Q., & Portincasa, P. K. (2012). Role of mitochondria in nonalcoholic fatty liver disease - from origin to propagation. Clinical Biochemistry, 45, 610-618.
Grubinko, V. V., & Arsan, V. O. (1998). Rol' hlutamat - hlutaminovoho peretvo-rennya v rehulyatsiyi homeostazu v mozku tvaryn za stres-diyi faktoriv zovnishn'oho seredovyshcha [The role of glutamate-glutamine in the regulation of homeostasis in the brain of animals subject to stress-action from environmental factors]. Ecological Physiology, 1, 13-18 (in Ukrainian).
Grytsiuk, M. I., Boychuk, T. N., & Petryshyn, A. I. (2014). Porivnyal'na kharakte-rystyka eksperymental'nykh modeley diabetu [Comparative characteristic of experimental models of diabetes]. World of Medicine and Biology, 44, 199203 (in Ukrainian).
Gupte, R. S., Floyd, B. C., Kozicky, M., George, S., Ungvari, Z. I., Neito, V., Wolin, M. S., & Gupte, S. A. (2009). Synergistic activation of glucose-6-phosphate dehydrogenase and NAD(P)H oxidase by Src kinase elevates superoxide in type 2 diabetic, Zucker fa/fa, rat liver. Free Radical Biology and Medicine, 47(3), 219-228.
He, K., Zhao, L., Daviglus, M. L., Dyer, A. R., Van Horn, L., Garside, D., Zhu, L., Guo, D., Wu, Y., Zhou, B., & Stamler, J. (2008). Association of monosodium glutamate intake with overweight in Chinese adults: The INTERMAP study. Obesity, 16(8), 1875-1880.
Hokin, L. E., & Hexum, T. D. (1992). Studies on the characterization ofthe sodium -potassium transport adenosinetriphosphatase on the role of phospholipids in the enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics, 151(2), 58-61.
Hua, Y., Clark, S., Ren, J., & Sreejayan, N. (2012). Molecular mechanisms of chromium in all eviating insulin resistance. Journal of Nutritional Biochemistry, 23(4), 313-319.
Inzucchi, S., Bergenstal, R. M., & Buse, J. B. (2012). Management of hyperglyce-mia in type 2 diabetes: A patient-centered approach. Position Statement of the American Diabetes Association (ADA) and the European Association for the Study of Diabetes (EASD). Diabetes Care, 35, 1-16.
Iskra, R. Y., & Vlizlo, V. V. (2013). Osoblyvosti funktsionuvannya systemy anty-oksydantnoho zakhystu v erytroyidnykh klitynakh i tkanynakh svyney za diyi khromu khlorydu [Peculiarities of functioning of the system of antioxidant protection in erythroid cells and tissues of pigs under the action of chromium chloride]. Ukrainian Biochemical Journal, 85(3), 96-102 (in Ukrainian).
Islam, M. S., & Wilson, R. D. (2012). Experimentally induced rodent models of type 2 diabetes. Methods in Molecular Biology, 933, 161-174.
Islam, S., & Loots, D. T. (2009). Experimental rodentmodels oftype 2 diabetes: A rewiev. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 31(4), 249-261.
Jain, S. K., & Kannan, K. (2001). Chromium chloride inhibits oxidative stress and TNF-a secretion caused by exposure to high glucose in cultured U937 monocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications, 289, 687-691.
Jain, S. K., Rains, J. L., & Croad, J. L. (2007). High glucose and ketosis (acetoace-tate) increases, and chromium niacinate decreases, IL-6, IL-8, and MCP-1 secretion and oxidative stress in U937 monocytes. Antioxidants and Redox Signaling, 9, 1581-1590.
Jeong, H., Kwon, H., Kim, M. (2009). Hypoglycemic effect of Chlorella vulgaris intake in type 2 diabetic Goto Kakizaki and normal Wistar rats. Nutrition Research and Practice, 3(1), 23-30.
Jeyakumar, S. M., Vajreswari, A., & Giridharan, N. V. (2006). Chronic dietary vitamin A supplementation regulates obesity in an obese mutant WNIN/Ob rat model. Obesity, 14, 52-59.
Johnson, R. N., Metcalf, P. A., & Baker, J. R. (1982). Fructosamine: A new approach to the estimation of serum glycosylprotein. An index of diabetic control. Clinica Chimica Acta, 127(1), 87-95.
Keyts, M. (1975). Tekhnika lipidolohii. Vydelenie, analiz i identifikatsiya lipidov [Technique of lipidology. Isolation, analysis, identification of lipids]. Mir, Moscow (in Russian).
Kharroubi, A. T, & Darwish, H. M. (2015). Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes, 6(6), 850-867.
Kim, Y. J., Kwon, S., & Kim, M. K. (2009). Effect of Chlorella vulgaris intake on cadmium detoxification in rats fed cadmium. Nutrition Research and Practice, 3(2), 89-94.
Laakso, M., & Kuusisto, J. (2014). Insulin resistance and hyperglycaemia in cardiovascular disease development. Nature Reviews Endocrinology, 10(5), 293-302.
Lee, H. S., Park, H. J., & Kim, M. K. (2008). Effect of Chlorella vulgaris on lipid metabolism in Wistar rats fed high fat diet. Nutrition Research and Practice, 2(4), 204-210.
Lee, H. S., & Kim, M. K. (2009). Effect of Chlorella vulgaris on glucose metabolism in Wistar rats fed high fat diet. Journal of Medicinal Food, 12(5), 1029-1037.
Lowry, O. H., Rosenbroug, N. I., Farr, A. L., & Randall, R. J. (1951). Protein measurement with the folin phenol reagent. Journal Biological Chemistry, 193(1), 265-275.
Lukashiv, O. Y., Bodnar, O. I., & Grubinko, V. V. (2016). Vplyv na metabolichni protsesy v orhanizmi selenovmisnykh biodobavok ta perspektyvy yikh vykorystannya [Effect on metabolic processes in the organism of selenium-containing bio-supplements and prospects for their use]. Bulletin of Biology and Medicine, 130, 30-34 (in Ukrainian).
Lukashiv, O. Y., Bodnar, O. I., Vasilenko, O. V., & Grubinko, V. V. (2016). The effect of selenium-chrome-lipid substance from Chlorella vulgaris Biej. on energy metabolism in rats. World Science, 7(11), 17-21.
Lukashiv, O. Y., Bodnar, O. I., Vinyars'ka, H. B., & Grubinko, V. V. (2016). Vplyv selen-khrom-lipidnoyi substantsiyi iz Chlorella vulgaris Biej. na oksydatyvnyy status shchuriv [Effect of selenium-chromium-lipid substance on Chlorella vulgaris Biej. the oxidative status of rats]. Medical and Clinical Chemistry, 18(2), 28-33 (in Ukrainian).
Luz, J., Pasin, V. P., Silva, D. J. M., Zemdegs, J. C., Amaral, L. S., & Affonso-Silva, S. M. (2010). Effect of food restriction on energy expenditure of monosodium glutamate-induced obese rats. Nutrition and Metabolism, 56(1), 31-35.
Marushchak, M. I., & Krynyts'ka, I. Y. (2012). Sposib modelyuvannya alimentarnoho ozhyrinnya [A way to model alimentary obesity]. Patent of Ukraine No 68839, MPK G09B 23/28 (2006.01), A61K 31/195 (2006.01), application number u201112114 (in Ukrainian).
Metzler, D. E. (2004). Biochemistry: The chemical reactions of living cells. 2nd ed. Academic Press, New York - London.
Minyuk, G. S., & Drobetskaya, I. V. (2000). Vliyaniye selena na zhiznedeyatel'-nost' morskikh i presnovodnykh mikrovodorosley [Effect of selenium on the activity of marine and freshwater microalgae]. Ecology of the Sea, 54, 26-37 (in Russian).
Mokryy, V. Y., Ziablitsev, S. V., & Kryshtal', M. V. (2016). Osoblyvosti formu-vannya okysnoho stresu u patsiyentiv z tsukrovym diabetom 2 typu v zalezh-nosti vid tryvalosti zakhvoryuvannya i stati [Features of the formation of oxidative stress in patients with type 2 diabetes, depending on the duration of the disease and sex]. International Endocrinology Journal of the Year, 77, 67-71 (in Ukrainian).
Morino, K., Petersen, K., Shulman, F., & Morino, G. I. (2006). Molecular mechanisms of insulin resistance in humans and their potential links with mito-chondrial dysfunction. Diabetes, 55(2), 9-15.
Nolan, J. J., & F^rch, K. (2012). Estimating insulin sensitivity and beta-cell function: Perspectives from the modern pandemics of obesity and type 2 diabetes. Diabetologia, 55(11), 2863-2867.
Perales, H. V., Pena-Castro, J. M., & Canizares-Villanueva, R. O. (2006). Heavy metal detoxification in eukaryotic microalgae. Chemosphere, 64, 1-10.
Prokhorova, M. I., ed. (1982). Metody biokhimichnykh doslidzhen' (lipidnyy ta enerhetychnyy metabolizm) [Methods of biochemical studies (lipid and energy metabolism)]. Leningrad University Press, Leningrad (in Russian).
Reardon, W., Ross, R. J., Sweeney, M. G., Luxon, L. M., Pembrey, M. E., Harding, A. E., & Trembath, R. C. (1992). Diabetes mellitus associated with a pathogenic point mutation in mitochondrial DNA. Lancet, 8832, 1376-1379.
Reaven, G. M. (2011). Relationships among insulin resistance, type 2 diabetes, essential hypertension, and cardiovascular disease: Similarities and differences. Journal of Clinical Hypertension (Greenwich), 13(4), 238-243.
Rеznikоv, О. G. (2003). Zаgа1'n! еtytchn! pryncypy еksperymеntivnа ^ат^а^ [General ethical principles of experiments on animals]. The first national congress on bioethics. Endocrinology, 8(1), 142-145.
Shibata, S., Natori, Y., Nishihara, T., Tomisaka, K., Matsumoto, K., Sansawa, H., Nguyen, V. (2003). Antioxidant and anti-cataract effects of Chlorella on rats with streptozotocin-induced diabetes. Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 49(5), 334-339.
Sofyn, A. V., Shatylov, V. R., & Kretovych, V. L. (1984). Hlutamatdehydrohe-nazy odnokletochnoy zelenoy vodorosly. Kynetycheskye svoystva [Glutamate dehydrogenase of unicellular green algae. Kinetic properties]. Biochemistry, 49(2), 334-345 (in Russian).
Spasov, A. A., Voronkova, M. P., Snyhur, H. L., Cheplyaeva, N. Y., & Chepur-nova, M. V. (2011). Eksperymental'naya model' sakharnoho dyabeta typa 2 [Experimental model of type 2 diabetes]. Biomedicine, 3, 12-18 (in Russian).
Stancic, A., Filipovic, M., Ivanovic-Burmazovic, I., Masovic, S., Jankovic, A., Otasevic, V., Korac, A., Buzadzic, B., & Korac, B. (2017). Early energy metabolism-related molecular events in skeletal muscle of diabetic rats: The effects of l-arginine and SOD mimic. Chemico-Biological Interactions, 272, 188-196.
Straus, W. (1954). Colorimetric microdetermination of cytochromeoxidase. Journal of Biological Chemistry, 207(2), 733-743.
Sundaram, B., Singhal, K., & Sandhir, R. (2012). Ameliorating effect of chromium administration on hepatic glucose metabolism in streptozotocin-induced experimental diabetes. Biofactors, 38, 59-68.
Tatsumi, T., Matoba, S., Kobara, M, Keira, N., Kawahara, A., Tsuruyama, K., Tanaka, T., & Katamura, M. (1998). Energy metabolism after ischemic preconditioning in streptozotocin-induced diabetic rat hearts. Journal of the American College of Cardiology, 31(3), 707-715.
Vincent, J. B. (2012). Is chromium effective as a nutraceutical. The bioinorganic chemistry of chromium, 55-79.
Vincent, J. B. (2012). Is chromium essential the evidence. The bioinorganic chemistry of chromium, 7-30.
Vincent, J. B. (2012). Is chromium (III) effective as a therapeutic agent. The bioinorganic chemistry of chromium, 81-123.
Vincent, J. B. (2013). Chromium: Isitessential, pharmacologically relevant, ortoxic? Metal Ions Life Sciences, 13, 171-198.
Vlasenko, M., Semenyuk, I., & Slobodyanyuk, G. (2011). Diabet i ozhyrinnya -epidemiya XXI stolittya: Suchasnyy pidkhid do problemy [Diabetes and
obesity - The epidemic of the XXI century: A modern approach to problems]. Ukrainian Therapeutic Journal, 2, 50-55 (in Ukrainian).
Yatskiv, O. S., & Patsay, Y. O. (2009). Spektrofotometrychne vyznachennya Cr (III) z dopomoyu khromazurolu S v prysutnosti Cr (VI) [Spectrophotometric determination Cr (III) with chromazoorol S in the presence of Cr (VI)]. Methods and Objects of Chemical Analysis, 4(1), 43-47 (in Ukrainian).
Zanozyna, O. V., Borovkov, N. N., & Shcherbatyuk, T. H. (2010). Svobodnora-dykal'noe okyslenye pry sakharnom dyabete 2-ho typa: Ystochnyky obrazo-vanyya, sostavlyayushchye, patohenetycheskye mekhanyzmy toksychnosty [Free radical oxidation in type 2 diabetes, sources of formation, constitutive, pathogenetic mechanisms of toxicity]. Modern Technology in Medicine, 3, 104-112 (in Russian).
Zolotor'ova, O. K., Shnyukova, E. I., Sivash, O. O., & Mikhaylenko, N. F. (2008). Perspektivi vikoristannya mikrovodorostey u biotekhnologiyi [Prospects for the use of microalgae in biotechnology]. Al'terpres, Kyiv (in Ukrainian).
