CC BY
36
BicHUK ,fl,mnponeTpoBCBKoro ymBepcmeTy. Bionoria, eKonorifl. Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biologia, ekologia Visnyk of Dnepropetrovsk University. Biology, ecology.
Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 2016. 24(1), 103-108.
doi:10.15421/011612
ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online
www.ecology.dp.ua
УДК 547.979.7+582.263
Шгментний склад Chlorella vulgaris за дп селенiту натрiю та юшв металiв
О.1. Боднар, Г.Б. В^рська, О.В. Василенко, В.В. Грубшко
Тернотльський нацюнальний педагогiчний ynieepcumem iMeni Володимира Гнатюка, Тернотль, Украхна
Досщджували вмст nirMeHTiB у Chlorella vulgaris Beij. (Chlorophyta) за да селенту натрто у концентрациях i3 розрахунку на Se4+ 0,5, 5,0, 10,0 i 20,0 мг/дм3 протягом щте!, трьох та семи до та за одночасно! да сeлeнiту в концентрани 10,0 мг Бе4+/дм3 i iонiв Zn2+, Mn2+, Co2+,Cu2+, Fe3+ у концентрац1ях 5,00, 0,25, 0,05, 0,008 та 0,002, мг/дм3 вщповщно протягом семи д!6 культивування водоростей i3 метою встановлення умов для отримання в аквакультурi лквдно! субстажщ, збагачено! селеном i бюактивними ме-талами. Вмтст пirмeнтiв визначали спектрофотометрично. Кштинну стшку видляли центрифугуванням у rрадieнтi перколу та досщджували мiкроскопiюванням. За д!! 10,0 мг Se^/дм3 окремо та одночасно з юнами дослiджeних мeталiв вмтст шгментв у хло-рели збшьшуеться в 1,5-2,5 раза в усгх варiантах експериментального впливу унаслiдок зв'язування Se032- бiлками та лЫдами. Селен включаеться до всгх фракцiй лтдав (триацилглщероли, дiацилглiдeроли, фосфолтди, нeeтeрифiкованi жирн кислоти), а максимальна юльюсть сeлeнумiсних лшщв вщмчена у хлоропластах. Збiльшeння вмсту каротинощв за д!! експериментальних чинниюв вщцрае виняткову роль у мехатзт антиоксидативного захисту, що обериж: вщ руйнування хлорофш та, вщповщно, збшьшуе його юльюсть у клiтинах. Змши у функдiонуваннi фотосинтетичного апарату Ch. vulgaris вiдбиваються на всьому ком-плeксi мeтаболiчних перетворень. За концентрани сeлeнiту 10,0 мг Se^/дм3 i зазначених кондeнтрадiй юшв вщповщних мет^в протягом 7 можливе успшне культивування хлорели, збагачено! селеном i бiогeнними металами.
Ключом слова: хлорела; селен (IV); мжроелементи; хлорофши; каротино!ди; клiтинна оболонка
Pigments content in Chlorella vulgaris under the influence of the sodium selenite and the ions of metals
O.I. Bodnar, H.B. Viniarska, O.V. Vasilenko, V.V. Grubinko
Ternopil National Pedagogical University named after Volodymyr Gnatiuk, Ternopil, Ukraine
We investigated the content of pigments in Chlorella vulgaris Beij. (Chlorophyta) under the influence of sodium selenite in concentrations based on Se4+ 0.5, 5.0, 10.0 and 20.0 mg/dm3 during one, three and seven days and under the influence of the simultaneous action of selenite in concentrations 10 mg Se4+/dm3 and ions of Zn2+, Mn2+, Co2+,Cu2+, Fe3+ in concentrations 5.00, 0.25, 0.05, 0.008 and 0.002 mg/dm3 over seven days. This research was carried out to establish the conditions for obtaining algal lipidis substance enriched with selenium and biogenic metals in the aquaculture. The content of pigments was determined spectrophotometrically, the cellular walls were separated by centrifuge in the percoll gradient and investigated microscopically. The pigments content in the Ch. vulgaris increased by 1.52.5 times in comparison with the control sample under the influence of 10 mg Se4+/dm3 with and without metal ions, in all variants of experimental influence due to binding of Se032- with proteins and lipids. We found that selenium was included in all lipid fractions (triacylglycerols, dyacylglycerols, phospholipids, nonetherified fatty acids); the maximum amount of selenium-containing lipids was recorded in chloroplasts. The increase in the contents of carotenoids caused by the actions of experimental factors played an exceptional role in the mechanism of antioxidant protection that prevents destruction of chlorophyll and, accordingly, increases its amount in cells. Changes in the functioning of the photosynthetic apparatus of Ch. vulgaris affect the whole complex of metabolic transformation. Thus, the successful cultivation of chlorella, enriched with selenium and biogenic metals, is possible within seven days under the influence of 10 mg Se4+/dm3 and the above-mentioned concentration of metal ions.
Keywords: chlorella; selenium (IV); microelements; chlorophyll; carotenoids; cellular wall
ТернопЛьсъкий шцюналъний педагогичный yuieepcumem mem Володимира Гнатюка, вул. М. Кривоноса, 2, ТернопЛъ, 46027, Украгна
Ternopil National Pedagogical University named after Volodymyr Gnatiuk, M. Krivonis Str., 2, Ternopil, 46027, Ukraine
Tel. +38-035-43-59-01. E-mail: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected]
Вступ
Селен як есенщальний мшроелемент у водоростей бе-ре участь у багатьох метаболчних процесах, зокрема, в регулюванш фотосинтезу (Zhou et al., 1997). Проте сполу-ки селену у високих концентрациях виявляють токсичну дю, пригн1чують ркт, викликають порушення метабо-л1зму та можуть спричиняти загибель водоростей (Minjuk et al., 2000). Вплив селену на водоросп залежить вщ морфофункцюнальних особливостей 5|х окремих видв, концентраци сполук i ступеня окиснення селену у них, а також фiзико-хiмiчних параметрiв водного середовиша (Bodnar et al., 2015). Доступтсть сполук селену для мшроводоростей також суттево залежить ввд вмюту у культуральному середовиша iонiв металш (Prevot and Soyer-Gobillard, 1986; Tsvetkova et al., 2016). Ран1ше нами показано, що юни деяких метатв, насамперед бiогенних, можуть як викликати порушення фiзiолого-бiохiмiчних процесiв у водоростей, так i регулювати 5|х метаболзм у межах адаптивно! реакцiï (Kostiuk and Grubinko, 2014; Grubinko et al., 2011). Результата цих робгт свщчать, що певн1 кшькосп сполук селену володють здатн1стю зни-жувати токсичну дю окремих металiв. Також селении розглядаються як джерело цього мiкроелемента та здатн1, взаемодючи з юнами металiв, сприяти 5|х накопиченню кл1тинами (Prevot and Soyer-Gobillard, 1986; Uminska, 1990). Високу бiоакумуляцiю неоргашчних солей та утво-рення !х бiокомплексiв iз макромолекулами кл1тин водоростей in vitro можна використати для одержання бюло-пчно активних добавок, що мiстять необхщш мшроеле-менти, включно селен та юни бiогенних металiв (Zolo-tareva et al., 2008; Grubinko et al., 2014; Goltvjans'kyj, 2002).
Стшшсть водоростей до екстремальних вщхилень показникiв чиннишв навколишнього середовища забез-печуеться адаптащями, насамперед фотосинтетичного апарату, який формуе адаптацiйний статус кл1тин водоростей шляхом бюсинтезу лшвдв. Останнi е джерелом енерги, а також забезпечують адаптивн1 структурно-фунцiональнi перебудови мембран (Vance et al., 2002).
За до на водоросп стресових чиннишв змшам насамперед шддаеться фотосинтетичний апарат кл1тин (Buchanam et al., 2015). Особливий iнтерес для вивчення викликае адаптивна роль фотосинтетичних тгменпв -хлорофтв а, b, каротинощв, феофiтинiв (Sun et al.,
2014). Змши, що викликають екстремальн1 стани у кл1тинах, шдукують утворення вторинно! клиинно! стшки, що е структурою, виявленою у багатьох рослин-них кл1тинах, розташованою м1ж першою стшкою кл1тин i плазматичною мембраною (Buchanam et al.,
2015). Ранше ми встановили формування тако! стшки, яку назвали феноменом утворення «подвшних концен-тричних мембран» (Grubinko and Kostiuk, 2012), за до iонiв цинку при досягнент критичних р1втв його нако-пичення. При цьому з пулу метаболтв вилучаються необх1дн1 сполуки для зв'язування токсиканта, що також вимагае посилення бiосинтетичних процес1в (Gorda and Grubinko, 2011). Дослвдження змiн, що вщбуваються у фотосинтетичному апарап Chorella vulgaris Beij. -один iз важливих етапiв комплексного оцшювання впливу селенiту натри» та ютв метал1в на водоросп.
Мета дослвдження - встановити змши шгментного складу та особливосп морфологи клиинно! стшки у Ch. vulgaris за да селениту натрш окремо та за його спшьно!' д!' з юнами метатв, установити оптимальш концентраци цих речовин для отримання альгосубстанци, збагачено! селеном та юнами бюактивних метал1в.
Матерiал i методи дослщжень
Дослвдження проводили на мшропопулящях альголо-пчно чисто! культури Chorella vulgaris Beij. CCAP-211/11в (Chlorophyta), яку вирошували в умовах накопи-чувально! культури на середовиш! Фтгцджеральда в моди-фшаци Цендера та Горхема № 11 за температури +22.. .+25 °С та освилення 2500 лк, 16/8 год (Topachevskij, 1975). В експерименп до культури водоростей, вщбраних у логарифмчнш фаз1 росту, додавали водний розчин селениу натрш у розрахунку на Se4+ - 0,5, 5,0, 10,0 i 20,0 мг/дм3. Бiомасу живих клiтин вщбирали на першу, третю та сьому добу експерименту.
Для вивчення сильно! да селенiту натрш та iонiв метал1в селенiт вносили iз розрахунку на Se4+ - 10,0 мг/дм3,
гу 2+
а солi металiв у розрахунку на юн металу: Zn (ZnSO4^7H2O) - 5 мг/дм3, Mn2+ (MnSO4) - 0,25 мг/дм3, Cu2+ (CuSO4^5H2O) - 0,002 мг/дм3, Fe3+ (Fe2(SO4)3) -0,008 мг/дм3, Co2+ (CoSO4) - 0,05 мг/дм3. Контролем бу-ла культура, яку вирошували у середовиш! без селениу та солей металiв. В!дб!р проб для аналiзу здшснювали на сьому добу культивування.
Вмкт хлорофтв а та b i каротинощв визначали спектрофотометрично за довжин хвиль, шо вщповь дають !х максимумам поглинання: 430, 480, 630, 645, 663 та 750 нм тсля !х екстракцi!' 90% розчином ацетону (Topachevskij, 1975). Визначення феопiгментiв здйсню-вали вимiрюванням р!знищ оптичних ш^льностей екст-ракту пименив за 665 нм до щдкислення проби 0,1 N хло-ридною кислотою i 5 хв пота цього (Romanenko, 2006).
Клиинну стшку видляли !з гомогенапв водоростей в 40мМ трис-НС1 (рН 7,6) за методикою Фшдлея та Еван-са (Findley and Evans, 1987) як описано нами рашше (Grubinko and Kostiuk, 2012). Морфолопчм змши клтин фiксували за допомогою мшроскопа МБИ-15 !з наступ-ним iнтегрованим цифровим аналiзом на комплекс «SSTU-camera Manual Vision SSD-color-WOYV00020» тсля !х фарбування «хлор - цинк - йод» реактивом (Broda, 1971). Статистичне опрацювання здiйснювали з використанням t-критерiю Стьюдента за допомогою про-грами Statistica 6.0 пкля попереднього аналiзу нормаль-носп розподлу.
Результата та ix обговорення
Максимальне збiльшення вмюту хлорофшу а шодо контролю (бiльше шж утрич) виявлено за д!' селенiту натрiю у концентрациях 0,5 та 20,0 мг/дм3 на сьому добу д!' (табл. 1). За до селениу у концентраци 0,5 мг/дм3 на першу та третю добу експозици вмют хлорофшу а зрю на 36,2% та 68,5% шодо контролю вщповвдно, а за концентраци 20 мг/дм3 - бшьше шж у 2,6 раза, починаючи з першо! доби дослщу. За да селениу у концентраци
10,0 мг/дм3 вмют xлopoфiлy a rn ipciM тa cьoмy дoбy збiльшивcя вiдпoвiднo нa 48,7% тa 81,7% щoдo кoнтpoлю. Зa да cеленiтy y кoнцентpaцiï 5,0 мг/дм3 в^мчею змен-шення вмicтy цьoгo пименту щoдo кoнIpoлю нa 16,8% m
Bmíct nirMeHriB у клiтинах Ch. vulga
œpmy дoбy екcпoзицiï тэ нa 27,4% - нa ^to дoбy дй. Ha cьoмy дoбy кiлькicть xлopoфiлy a бyлa незшчш ви-щoю, нж y кoнтpoлi.
Taблuця 1
is за дй" ceлeнiту матр1ю (M ± m, n = 5)
КoнцеEтpaцiя Se4+, мг/дм3 TpmMÍcn> культиву- BrnCT шгментГв
вaEEя xлopели Гз ccлcmтoм Eaтpiю, дГб Хлopoфiл a, мкг/дм3 Хлopoфiл b, мкг/дм3 СшввГдшшення xлopoфiлiБ a/ b ГИгментний iндекc: cyма кapoтиEOïдiБ / xлopoфiл a
KOETpOЛЬ 160,1 i 9,0 81,l i 5,0 1,96 0,22
1 218,2 i 12,2* 146,4 i 8,8* 1,49 0,33
0,5 3 269,8 i 14,l* 190,8 i 10,5* 1,41 0,2l
l 494,2 i 30,2* 231,8 i 15,l* 2,13 0,20
1 133,3 i 5,l* 106,1 i 6,5* 1,26 0,38
5,0 3 116,3 i 9,2* 102,9 i l,4* 1,13 0,62
l 168,l i 8,3 131,0 i 9,4* 1,29 0,32
1 208,3 i 22,2 105,8 i 12,8 1,97 0,42
10,0 3 309,l i 21,l* 13l,1 i 10,9 2,26 0,34
l 3l8,4 i 26,8* 149,5 i 9,8* 2,53 0,2l
1 431,1 i 24,2* 138,6 i l,2* 3,11 0,11
20,0 3 435,8 i 24,6* 199,6 i 11,1* 2,18 0,14
l 501,3 i 30,6* 238,5 i 13,9* 2,10 0,13
Примiтка: * - тут i в нacтyпниx тaблицяx вiдмiнmocтi ш^зн
Щoдo вмету xлopoфiлy b, то зa до cеленiтy нaтpiю в ycix дocлiджyвaниx кoнцентpaцiяx виявили йoгo збгль-шення щoдo кoнтpoлю: як i у випэдку iз xлopoфiлoм a, мaкcимaльне збшьшення cпocтеpiгaли зa да 0,5 тэ 20,0 мг Se4+/дм3. Ha œpmy дoбy екcпеpименIy зa да cеленiтy в кoнцентpaцiï 0,5 мг/дм3 втст цьoгo пименту зpic m 79,2% щoдo кoнтpoлю. Ha третю тa cьoмy дoбy вмicт xлopoфiлy b пеpевишyвaв йoгo вмicт у кoнтpoлi бгльше нж yдвiчi. Зa дЛ' cеленy у кoнценIpaцiï 20,0 мг/дм3 втст цюш пименту збiльшивcя Ea 69,7% шoдo кoнтpoлю. Ha третю дoбy вмicт xлopoфiлy b пеpевищyвaв кoEтpoльEий пoкaзEик yдвiчi. Ha аюму дoбy кiлькicть пiгмеEтy зменши-nac^ пpoте пеpевишyвaлa ЗEaчення в кoнтpoлi нa 69,6%.
Bмicт кapoтинoïдiв зa дй cеленiтy нaтpiю в ycix дocлiджyвaниx кoнцеEтpaцiяx збiльшyвaвcя (тэбл. 2).
Taблuця 2
Вмкт каротиноУ.мв i фeoфiтимiв у клiтимах Ch. vulgaris за дй" ceлeмirу матр1ю (M ± m, n = 5)
Тpивaлicть куль- Brn^ пiгмcEтiБ
КoнцеEтpaцiя Se4+, мг/дм3 тиБyвaEня xrop&-ли Гз ccлcEiтoм Eaтpiю, дб Кapoтинoïди, м^Р^дм3 Феoфiтини, мкг/дм3
KOETpOЛЬ 35,1 i 1,9 154,9 i 9,3
1 l1,3 i 4,0* 21l,6 i 12,0*
0,5 3 l3,1 i 4,1* 2l3,0 i 14,8*
l 97,0 i 5,l* 4l8,l i 26,9*
1 50,0 i 2,3* 112,2 i 10,5*
5,0 3 72,0 i 3,l* 10l,0 i 3,0*
l 54,0 i 4,2* 97,5 i 0,8*
1 8l,5 i l,3 211,5 i 26,5
10,0 3 104,2 i 9,1 215,2 i 3,9*
l 103,1 i 72 166,8 i 1l,8*
1 46,3 i 2,9* 413,3 i 23,4*
20,0 3 62,0 i 3,5* 320,5 i 18,1*
l 64,5 i 3,4* 340,4 i 18,5*
Мaкcимaльне збiльшення вмiстy unx пiгментiв вгдмГ-тили зa до cеленiтy у кoнцеEтpaцiï 0,5 мг/дм3 yпpoдoвж
ib щoдo кoEтpoлю вipoгiднi зa Р < 0,05.
ycieï екcпoзицiï тa зa кoнцеEтpaцiï 5,0 мг/дм3 га тpетю дoбy дocлiдy - бiльше нж yдвiчi щoдo кoнтpoлю. Зa Aiï cеленiтy в кoнцентpaцiï 10,0 мг/дм3 нa третю тэ cьoмy дoбy екcпеpимеEтy вмкт кapoтинoïдiв пеpевишyвaв кoнтpoльнi пoкaзники га 19,1% тэ 17,8% b^ob^o. Зa дй cеленiтy в кoнцентpaцiï 20,0 мг Se4+/^3 yмicт кapoтинoïдiв збiльшивcя нa 32,1% тa 76,3% га œpmy тa тpетю дoбy в^тавию. Ha cьoмy дoбy вмicт цм пiгмеEтiв пеpевишyвaв кoнтpoльнi пoкaзники га 83,9%.
ffl^o феoфiтинiв, то дигамм ïx вмiстy бyлa пoдiбнoю дo змiн вмiстy xлopoфiлy a: ra aorny дoбy зa дй геленг^ в кoнцентpaцiï 0,5 мг/дм3 i впpoдoвж ycieï тpивaлocтi дocлiдy в кoнцеEтpaцiï 20,0 мг Se4+/дм3 вадмнене збшьшення ïx кiлькoстi бгльше нгж удбгч1 щo-дo кoEтpoлю (табл. 2). Зa кoнцентpaцiï 5,0 тэ 10,0 мг/дм3 cпocтеpiгaли зменшення вм^ту феoфiтинiБ щoдo шн-тpoлю ra aorny дoбy нa 37,1% тэ 21,1% вiдпoвiдEO.
Hезвaжaючи нa збшьшення зaгaльнoгo бмГсту фoто-cиEтетичEиx пiгментiв зa дй cеленiтy в кoнцентpaцiï 0,5 мг/дм3, cпiввiднoшення xлopoфiлiв a/b зменшилocя щoдo кoнтpoлю нa œpmy дoбy нa 23,9%, нa тpетю - нa 27,9%. Щoдo пiгментнoгo iEдекcy, то зa дiï uieï кoнцеEтpaцiï cеленiтy внacлiдoк збiльшення б^ит^у кapoтинoïдiв пopiБнянo Гз xлopoфiлoм a што пoкaзник зpocтaБ: нa œpmy дoбy нa 49,3%, нa тpетю - нa 23,7% щoдo кoнтpo-лю. Ha cьoмy дoбy екcпoзицiï cпiБвiднoшенEя мгж пiгмеEтaми бyлo близьким дo знaчень у кoEтpoлi.
Зa дй 5,0 мг Se4+/дм3 cпiввiдаoшення мгж oбoмa фop-мэми xлopoфiлy змiEилocя: Ea пеpшy дoбy шгазник змен-шивcя га 35,9%, га тpетю - га 42,3%, ra aorny - га 34,3% b^octo кoEтpoлю. ПiгмеETEий iEдекc пpи цюму збiльшивcя: га пеpшy дoбy га 71,4%, га третю - у 2,8 paзa, ra aorny - га 46,2% щoдo кoEтpoлю. Мoжливo, це пoв'язaEO з пеpетвopенням «мoлoдиx» мoлекyл xлopoфiлy a га xлopoфiл b, щo вiдбyвaeтьcя у темювш фэзГ фoтоcиEтезy (Shlyk, 1975).
Bнеcення cеленiтy в кoнцеEтpaцiï 10,0 мг Se4+^rn тэк caмo, як i зэ кoнцеEтpaцiï 0,5 мг/дм3, cпpиялo збшь-
шенню зaгaльнoï кiлькoстi фoтoсинтетичниx пи-мешть. Пpoте спiввiднoшення xлopoфiлiв a/b пеpевишувaлo кoнтpoльнi пoкaзники упpoдoвж усьoгo пеpioду дoслiду: на т^тю дoбу - на 14,8%, на ^oi^ - на 28,5% (зумoв-ленo пеpевaжaнням утвopення xлopoфiлу а). Пiгментний iндекс за paxунoк меншoï iнтенсивнocтi утвopення кapoтинoïдiв пopiвнянo iз зеленими пiгментaми змен-шився: на гpетю дoбу - на 19,3%, на сызму - на 35,2%. Таку саму тенденцш вiдмiтили за дй' 20,0 мг Se4^!3: вiдбулoся значне зpoстaння вмкту всix пiгментiв та збiльшення спiввiднoшення xлopoфiлiв a/b (на пеpшу дoбу - на 58,7%, на тpетю - на 11,1%, на сьoму - на 7,2% щoдo кoнтpoлю). Як i за дiï 0,5 мг Se4+/^w3 шказ-ник дюна спiввiднoшення нaпpикiнцi експoзицiï набли-жався дo значень у кoнтpoлi. Шгментний iндекс змен-шився удв1ч1 на пеpшу дoбу, на гpетю пеpевишувaв кoнтpoльнi пoкaзники на 34,9%, на сьэму - на 41,3%. Сшвввдюшення xлopoфiлiв a/b мoже xapaктеpизувaти
штенцшну фoтoxiмiчну та бioсинтетичну aктивнiсть вoдopoстi. За сгpесoвиx впливiв в1дбуваеться зменшення вм1сту xлopoфiлу а як менш стiйкoгo пopiвнянo iз xлopoфiлoм b, та, вiдпoвiднo, спiввiднoшення м1ж цими фopмaми пiгменгу зменшуеться. Пpи цюму пиментний шдекс зpoстae за paxунoк пoсиленoгo утвopення кapoтинoïдiв, як1 викoнують як дoпoмiжну, так i закисну функцш у пpoцесi фoтoсинтезу. Таю змши вiдмiченi за д11 5,0 мг Se4+/^3. Збiльшення вм1сту xлopoфiлу а, а o^ же, i збшьшення пoкaзникa спiввiднoшення xлopoфiлiв a/b пopiвнянo з кoнтpoлем - oзнaкa успiшнoгo фopму-вання фiзioлoгiчнoï адаптаци xлopели (Grubinko et al., 2014; Gorda and Grubinko, 2011), щo нaйяскpaвiше вия-вилoся за 10,0 мг Se4+/^3 пpoтягoм семи даб дй". Саме цi умoви змoдельoвaнi в нaступниx дoслiдженняx.
За сшлью1 д11 селенiгу нaтpiю та ютв метaлiв у всix вapiaнтax експеpименту вмiст зелениx пiгментiв у xлo-pели зpoстaв (табл. 3).
Таблиця 3
bmíct шгмемпв у клтгимах Ch. vulgaris за одночacноï дй" cелеmту натрпо та iонiв метал1в протягом l дiб культивуваммя (M ± m, n = 5)
Bapiam дослщу Хлopoфiл а, мкг/дм3 Хлopoфiл b, мкг/дм3 Стввщшшення xлopoфiлiв а/ b ГИгменгний 1ндекс: сума кapoтинoщв xлopoфiл а
кoнгpoль 142,2 i 19,0 60,6 i 5,2 2,35 0,33
10 мг Se4+W 193,1 i 12,2 90,1 i 9,7 2,14 0,33
Se4++Co2+ 189,6 i 10,0 118,0 i 3,4* 1,61 0,37
Se4++Mn2+ 252,2 i 8,1* 185,5 i 16,2* 1,36 0,32
Se4++Cu2+ 295,6 i 9,9* 239,5 i 9,1* 1,23 0,25
Se4++Zn2+ 280,0 i 10,6* 229,8 i 2,5* 1,22 0,27
Se4++Fe3+ 257,2 i 20,3* 243,7 i 5,7* 1,06 0,28
За да Se4++Co2+ кiлькiсть xлopoфiлу а збiльшжлaся на 33,4% пopiвнянo з кoнтpoлем та була близьтою дo пoкaзникiв, зaфiксoвaниx за до селенiгу. За дд1 Se4++Mn2+ щ пoкaзники збiльшжлися на 77,3% та 30,6% вiдпoвiднo, за дй" Se4++Zn2+ - на 96,9% та 45,0%, за дй" Se4++Fe3+ - на 80,8% та 33,7%, за да Se4++Cu2+ - у 2,1 та 1,5 paja вiдпoвiднo.
Вм1ст xлopoфiлу b зpiс на 94,8% пopiвнянo з Kornpo-лем за да Se4++Co2+ та на 30,9% пopiвнянo з дieю селенiгу oкpемo, за да Se4++Mn2+ цi пoкaзники збшьшилися у 3,1 га у 2,1 paзa вiдпoвiднo, за дд1 Se4++Zn2+ - у 3,8 та у 2,6 paзa, за дй" Se4++Fe3+ - у 4,0 та у 2,7 paзa, за дй" Se4++Cu2+ - у 4,0 та 2,6 paзa вiдпoвiднo (табл. 3). Вм1ст кapoтинoïдiв у
4+
клlтинax xлopели за да Se та юшв метaлiв тaкoж збiльшжвся пopiвнянo з кoнIpoлем (табл. 4).
Таблиця 4
Bмicт каротиноУдш та феофгтин!в у клтгимах Ch. vulgaris за одночacноï дй' cелемiту натрпо та iомiв метал1в протягом l д1б культивуваммя (M ± m, n = 5)
^и цюму к1льк1сть кapoтинoïдiв за oднoчaснoï дй" селениу та метал1в незнaчнo вiдpiзнялaся в1д пoкaзникlв за дй" селениту oкpемo. За да Se4++Co2+ вмст ^x п1гмент1в зб1льшився на 51,4% пopiвнянo з кoнтpoлем i на 9,7% пopiвнянo з д1ею селениу oкpемo. За да Se4++Mn2+ кшькють кapoтинoïдiв зpoслa на 74,7% щoдo кoнтpoлю, та на 26,6% щoдo дй" селен1ту, за да Se4++Cu2+ - на 60,8% та 16,6% ввдшвщю, за да Se4++Zn2+ - на 60,7% та 16,5%, за да Se4++Fe3+ на 52,9% та 10,9% вiдпoвiднo.
Щoдo феoфiтинiв, то за дй" селениу ïx кшькють зменшилась на 21,1% пopiвнянo з кoнтpoлем. Така сама тенденц1я збеpiгaeться за дй" Se4++Zn2+ (на 48,1% щoдo кoнгpoлю) та за дй" Se4++Fe3+ (на 54,9% щoдo кoнтpoлю). За дй" Se4++Cu2+ вм1ст феoфiтинiв близький дo кoнгpoль-ниx значень, а за дй" Se44+Mn2+ - на 13,7% пеpевaжaв пoкaзники в кoнгpoлl (див. табл. 4).
Отже, за спiльнoï дй" селен1ту нaтpiк> та ioнiв метал1в пopiвнянo 1з д1ею селен1ту oкpемo знaчнo збшьшуегься вм1ст xлopoфiлiв а та b. Вмст кapoтинoïдiв теж збшьшу-еться вшюсю кoнтpoлю, пpoте пopiвнянo з д1ею селен1ту зм1ни ïx юльшсп у клiтинax вoдopoстi несуттев1. Щкаю те, щo на тл1 збшьшення кlлькoстi п1гмент1в за да селениу нaтpiк п1гментний индекс i шказник спiввiднoшення xлopoфiлiв a/b сугтeвo не змшюегься пopiвнянo з Kornpo-лем, щo св1дчить npo в1дсутн1сть негaтивнoгo впливу селен1ту на фoтoсинтетичну систему xлopели. Внесення в сеpедoвище культивування xлopели 1з селен1том нaIplк шлей метал1в викликaлo зменшення спiввiднoшення xлopoфiлiв удв1ч1. Пггментний шдекс пеpевaжнo був ниж-
Bapiaнт дoслiду Kapoтинoïди, м^Ри/дм3 Феoфiтини, мкг/дм3
ro^KO^ 46,4 i 6,5 211,5 i 26,5
10 мг Se4+/дм3 64,0 i 4,0 166,8 i 6,6*
Se4++Co2+ 70,2 i 4,0* 88,7 i 8,2
Se4++Mn2+ 81,1 i 5,3* 240,4 i 5,3*
Se4++Cu2+ 74,6 i 6,9 211,6 i 20,0
Se4++Zn2+ 74,6 i 9,2 137,1 i 6,1
Se4++Fe3+ 71,0 i 6,9 159,1 i 2,3
чим пор1вняно з контролем, лише за да Se4++Co2+ його показник збшьшився на 12,3%. Проте це може бути зу-мовлено збшьшенням кшькосп хлороф1лу а внаслвдок запобпання руйнуванню хлороф1лу за да селен1ту, а та-кож окисненню л1п!д1в мембран хлоропластв, що забез-печуеться антиоксидантним механ1змом захисту, що посилюеться за наявносп юшб метал1в, яю входять до активних центр1в цих ферменпв (Demmig, 1990).
Хлорофш а входить до складу реакцшних центр1в i периферичних комплексiв фотосистем I i П, а хлорофiл b - компонент свiтлозбiрного комплексу фотосистеми II. Тому змша стБвщношення хлорофiлiв а/b може свщчити про змщення стехюметрично1 р1вноваги м1ж комплексами реакцшних центрш обох фотосистем i свiтлозбiрного комплексу фотосистеми II. Основними причинами зни-ження активност ФС II за надмрно! кшькосп iонiв металiв у кл1тинах е змша структури бшюв реакцшного центру та замщення iонами деяких металiв атом1в тих металiв, що входять до складу реакцшного центру (Мп2+, Са2+). Мгшень да iонiв метал1в, як правило, - первинний донор електрошв реакцшного центру фотосистеми II П-680, вщновник феофiтину. Можливо, iони металiв, пош-коджуючи П-680, зумовлюють зменшення вмiсту феофь тину в кштинах водоросп (табл. 4). Феофiтини - першi переносники електронiБ у фотосистем II. Оскшьки вщомо, що кшьюсть цих пiгментiБ прямо пропорцшна кшькосп реакцшних центрiв фотосистеми II, таю змши 1х вмiсту сввдчать про зменшення функцюнально! активно-сп реакцшних центр1в фотосинтезу (Prasad and Strzalka, 1999). Можлива причина iнгiбування юнами металiБ фотосинтетичного електронного транспорту - змши ультра-структури хлоропласта, зокрема, пошкодження тилако-1д1в (Maksymiec et al., 1992).
Змiни вмюту хлорофiлiБ можуть напряму залежати ввд змш кшькосп каротинощв. Останнi, завдяки сво1'м антиоксидантним властивостям, беруть участь у захисп фото-синтетичних мембран вщ фотоокиснення та знешкоджен-ня пероксидних радикал1в, що запобтае окисненню лшь д1в мембран хлоропласта, руйнуванню хлорофiлу (Demmig, 1990) i, вщповгдно, збшьшуе вмiст зелених шгмента
у клiтинах. Внесення селенггу нагр1ю у середовище культивування хлорели супруводжуегься збшьшенням вмюгу фогосингегичних пимента у кл1гинах водоросп майже в уах дослвджених випадках. Можливо, це зу-мовлено погребою оновлення хлоропласта, що часгково вграгили фотосингегичну ефекгившсгь. Осганне могло вадбутася унаслвдок зв'язування iонiв Se032- лшщами га хлорофш^лковими комплексами (Zhou et al., 1997). Селен присуташ у всiх фракщях лiпiдiв, а максимальна кшьшсгь селенумкних лiпiдiв ввдшчена в каротановдах (Gennity et al., 1984; Vinyarska et al., 2014). Збшьшення вмiстy каротанодав, у свою чергу, вiдiграe важливу роль у механiзмi аш'иоксидангного захисгу фогосингегичних мембран, що обериае вщ руйнування хлорофiл (Mager and Kruijff, 1995) i, вщповвдно, збшьшуе його кшьюсгь у клггинах. Цi змши у функцюнуванш фотосингегичного апарагу Ch. vulgaris ввдбивакггься на всьому комплека мегаболчних перегворень.
Збшьшення пименгного щдексу пояснюегься там, що за несприягливих умов у першу чергу руйнуегься хлорофiл а, а каротанощи бшьш сгшкг Осганн1 - важливi прогекгори зелених пiгментiв, а гакож неферменгт анги-оксиданги компонента клiтин. У процеа бюгрансфор-мацй' цих пимента угворюклься фiзiологiчно значимi метаболiти, яю беругь учасгь у регуляцй' адапгаци до умов середовища, зокрема, до впливу селенiтy наград га юшв металiв. Особливо чiтко yспiшне формування адап-гивних присгосувань водоростi на стресовi чинники просгежуегься за да селенiтy у конценграцй' 10,0 мг Se4+/^, га його одночасно! да з Zn2+.
За дй' селенггу наград у конценграцй' 10,0 мг Se4+/^3 на сьому добу у клггинах хлорели виявлено потовщення мембран (рис.). Розмiри ядерно-цигоплазмагичного про-сгору клiтин змiнилися на 3,5%, а товщина зовнiшньоi часгини оболонки - на 12,2% щодо конгролю (габл. 5). Ранiше було показано, що юни цинку у конценграцй' 5,0 мг/дм3 спричиняють зменшення лiнiйних розмiрiв клiтин хлорели вдвiчi га угворення другого кола клiтинноi' стiнки (Grubinko and Kostiuk, 2012).
Рис. Млкрофотографй кл1тин Ch. vulgaris: а - контроль, б - за дй 10 мг Se /дм , в - за одночасно! дп Se+Zn2 ; х 9000
Таблиця 5
Основн1 морфометричн1 параметри кЛтин Ch. vulgaris за дй" селешту патрпо в концентрацй 10 мг
та стльно з юнами цинку в концентрацй' 5,0 мг/дм3
Умови культивування водоросп Д1аметр клгшн, мкм Вщстань вщ центру клпини до внутшнього кола клпинно! стшки, мкм Вщстань вщ центру клгшни до зовншнього кола клггинно1 ст1нки, мкм Товщина кл1тинно! стшки, мкм
Контроль 3,95 ± 0,35 1,52 ± 0,16 1,98 ± 0,18 0,46 ± 0,12
10 мг Se4+W 3,81 ± 0,49 1,39 ± 0,20 1,90 ± 0,24 0,51 ± 0,09
Se4++Zn2+ 3,56 ± 0,48* 1,17 ± 0,16* 1,78 ± 0,24 0,61 ± 0,10
За одночасно! до селенiту та ioHiB цинку на сьому добу також вiдмiтили зменшення ядерно-плазматичного простору на 4,4% та потовщення концентрично! системи клиинно! спнки на 29,1%. При цьому змiни у фотосинтетичному апарап вказували на усшшне формування адаптаци клiтин хлорели до зазначених чинниюв.
Висновки
Динамка вмiсгу фотосинтетичних пirментiв, змши у !х сшввщношент, а також морфолоriчнi змiни свщчать про успiшне формування адаптацiй у хлорели у ввдповщь на вплив iонiв металiв за умов унесення в культуральне середовище селенiту натрш. У зв'язку iз цим за концентраци селенiту 10,0 мг 8е4+/дм3 i зазначених концентрацiй iонiв вщповщних металiв протягом 7 дiб можливе успiшне культивування хлорели, збагачено! селеном i бiогенними металами.
Бiблiографiчнi посилання
Bodnar, O.I., Vinyarskaya, G.B., Stanislavchuk, G.V., Grubinko, V.V., 2015. Peculiarities of selenium accumulation and its biological role in algae (A review). Hydrobi-ological Journal 51(1), 63-78. Broda, B., 1971. Methods histochemistry of plants. State
Agency Medical Publishing House, Warsaw (in Polish). Buchanan, B.B., Gruissem, W., Jones, R.L., 2015. Biochemistry
and molecular biology of plants. Wiley, Oxford. Demmig-Adams, B., 1990. Carotenoids and photoprotection in plants: A role for the xanthophyll zeaxanthin. Biochim. Bio-phys. Acta 1020, 1-24. Findley, J.B.C., Evans, W.H., 1987. Biological membranes: a
practical approach. IRL Press, Oxford. Gennity, J.M., Bottino, N.R., Zingaro, R.A., 1984. The binding of selenium to the lipids of two unicellular marin algae. Bio-chem. Biophys. Res. Commun. 118(1), 176-182. Goltvjans'kyj, A.V., 2002. Bioakumuljacija ioniv metaliv klity-namy zelenyh vodorostej ta oderzhannja biomasy bagatoi' na mikroelementy [Bioaccumulation of metal ions by green algae cells and production of biomass enriched with microelements]. Kyiv (in Ukrainian). Gorda, A.I., Grubinko, V.V., 2011. Biosyntez lipidiv u Chlorella vulgaris Beijer. za dii' Mn2+, Zn2+, Cu2+ ta Pb2+ [Biosynthesis of lipids in Chlorella vulgaris Beijer. under the action of Mn2+, Zn2+, Cu2+ and Pb2+]. Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine 11, 137-142 (in Ukrainian). Gorda, A.I., Grubinko, V.V., 2011. Vplyv dyzel'nogo palyva na biosyntez protei'niv, vuglevodiv i lipidiv u Chorella vulgaris Beijer [Effect of diesel fuel on biosynthesis of proteins, carbohydrates and lipids in Chlorella vulgaris Beijer]. Biotechnology Journal 4(6), 74-81 (in Ukrainian). Grubinko, V.V., Gorda, A.I., Bodnar, O.I., Klochenko, P.D., 2011. Metabolism of algae under the impact of metal ions of the aquatic medium (A review). Hydrobiological Journal 47(6), 75-88.
Grubinko, V.V., Kostiuk, K.V., 2012. Structural changes in the cellular membranes of the aquatic plants under the impact of toxic substances. Hydrobiological Journal 48(2), 40-54.
Grubinko, V.V., Kostiuk, K.V., Lutsiv, A.I., 2014. Structural adaptations of cell walls of Chlorella vulgaris Beijer. under the action of ions zinc and lead. Algologija 24(3), 282-287.
Kostiuk, K.V., Grubinko, V.V., 2014. Ion processes in the cell membranes of the aquatic plants under the toxic substances impact. Hydrobiological Journal 50(3), 80-89.
Mager, W.H., Kruijff, A.J.J., 1995. Stress-induced transcriptional activation. Microbiol. Rev. 59(3), 506-531.
Maksymiec, W., Russa, R., Urbanik-Sypniewska, T., Baszynski, T., 1992. Changes in acyl lipid and fatty acid composition in thylakoids of copper non-tolerant spinach exposed to excess copper. J. Plant Physiol. 140, 52-55.
Minjuk, G.S, Trenkenshu, R.P., Alisievich, A.V., Drobeckaja, I.V., 2000. Vlijanie selena na rost vodorosli Spirulina plat-ensis (Nords.) v nakopitel'noj i kvazinepreryvnoj kul'turah [Effect of selenium on the growth of algae Spirulina platen-sis (Nords.) in the storage and quasi-continuous cultures]. Ekologija Morja 54, 42-49 (in Russian).
Prasad, M.N.V., Strzalka, K., 1999. Impact of heavy metals on photosynthesis. Heavy Metal Stress in Plants. Springer Verlag. Berlin.
Prevot, P., Soyer-Gobillard, M.O., 1986. Combined action of cadmium and selenium on two marine dinoflagellates in culture, Prorocentrum micans and Crypthecodinium cohnii. J. Protozool. 33(1), 42-47.
Romanenko, V.D. (ed.), 2006. Metody gidrobiologichnyh dos-lidzhen' poverhnevyh vod [Methods of hydroecological investigation of surface waters]. Logos, Kyiv (in Ukrainian).
Shlyk, A.A. (ed.), 1975. Biosintez i sostojanie hlorofillov v ras-tenii [Biosynthesis and condition of chlorophylls in plants]. Nauka i Tehnika, Minsk (in Russian).
Sun, X., Zhong, Y., Huang, Z., Yang, Y., 2014. Selenium accumulation in unicellular green alga Chlorella vulgaris and its effects on antioxidant enzymes and content of photosyn-thetic pigments. PLoS ONE 9(11), e112270.
Topachevskij, A.V. (ed.), 1975. Metody fiziologo-biohimiches-kogo issledovanija vodoroslej v gidrobiologicheskoj prak-tike [Methods of physiological and biochemical research of algae in hydrobiological practice]. Naukova Dumka, Kyiv (in Russian).
Tsvetkova, N.M., Pakhomov, O.Y., Serdyuk, S.M., Yakyba, M.S., 2016. Biologichne riznomanittja Ukrajiny. Dnipropetrovs'ka oblast'. Grunty. Metaly u gruntah [Biological diversity of Ukraine. The Dnepropetrovsk region. Soils. Metalls in the soils]. Lira, Dnipropetrovsk (in Ukrainian).
Uminska, R., 1990. Selenium in human environment. Rocz. Panstw. Zakl. Hig. 41, 25-34.
Vance, J.E., Vance, D.E., Schmid, K.M., Ohlrogge, J.B., 2002. Lipid metabolism in plants. Biochemistry of lipids, lipopro-teins and membranes. Elsevier, Amsterdam.
Vinyarska, H.B., Bodnar, O.I., Stanislavchuk, A.V., Grubinko, V.V., 2014. Zv'jazuvannja selenu Chlorella vulgaris u kul'turi [The binding of selenium by Chlorella vulgaris in the culture]. Ukrainian Biochemical Journal 86(5), 50-51 (in Ukrainian).
Zhou, Z., Li, P., Liu, Z., Liu, X., 1997. Study on the accumulation of selenium and its binding to the proteins, polysaccharides and lipids from Spirulina maxima, Spirulina platensis and Spirulina subsalsa. Oceanol. Limnol. Sin. 28(4), 363-370.
Zolotareva, O.K., Shnyukova, E.I., Sivash, O.O., Mikhaylenko, N.F., 2008. Perspektyvy vykorystannja mikrovodorostej u biotehnologii' [Prospects of the use of microalgae in biotechnology]. Alterpres, Kyiv (in Ukrainian).
Hadiumna do редкonегii 19.01.2016
