CC BY
16
УДК 616.33/.34:612.397:678.048-092.9
О. С. Заячшвська ВПЛИВ МОДИФ1КАЦП
ЖИРНОКИСЛОТНОГО СКЛАДУ КЛ1ТИННИХ МЕМБРАН НА ГАСТРОПРОТЕКЦ1Ю ЗА УМОВ СТРЕС-1НДУКОВАНИХ УРАЖЕНЬ
Львiвський нацюнальний медичний утверситет
кафедра нормально'1 фезюлогИ
(зав. - д. мед. н., проф. М.Р.Гжегоцький)
Ключовi слова: гастропротекщя, стрес, m-3 ПНЖК, NO, про- i антиоксидантний захист Key words: gastroprotection, stress, m-3 PUFA, NO, pro- and antioxidant protection
Резюме. Известно, что стресс - фактор риска для многих гастроэнтерологических заболеваний. Исследовали влияние m-3 полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) на гастропротекцию при стресс-индуцированном повреждении. В опытах на крысах, которым вводили плацебо и ПНЖК 8 недель ежедневно и моделировали однократно стресс, изучали площадь повреждения желудка планиметрией, колориметрически метаболитов NO, про - и антиоксадантною активность, биохимическими методами в-липопротеиды и щелочную фосфатазу. Показано, что модификация клеточных мембран m-3 ПНЖК демонстрирует гастропротекторные свойства за счет мембранотропного действия, увеличения содержания нитрит аниона, что улучшает микроциркуляцию и активации антиоксидантной защиты. Summary. Stress is considered to be a risk factor of several gastroenterology diseases. The aim of the study was investigation of the effect a m-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA) on gastric mucosa in stress-induced injury. Rats were treated with placebo and m-3 PUFA once daily for 8 weeks and then exposed to a single stress. The area of gastric lesions was measured by planimetry. Colorimetric assays were used to determine levels of nitric oxide, prooxidative- and antioxidative activity and biochemical methods - for в-lipoproteins and basic phospholipase contents. We demonstrated that m-3 PUFA exerts a gastroprotective activity, possibly due to cell membrane modification, which possess the increased nitric anion concentration in blood. This improves gastric microcirculation and antioxidant protection activation.
1з лтературних джерел вщомо, що дисбаланс мiж агресивними бюлопчними та небюлопч-ними чинниками, включно з токсичним впливом, змшою параметрiв гомеостазу (оксигенащя, температура, внутршньопорожнинний й осмотич-ний тиск, ацидоз), впливом хвороб, сощальним перевантаженням тощо та природними захисни-ми системами призводить до порушення щ-люносп слизово! оболонки оргашв травно! сис-теми, що е тригером розвитку численно! гастро-ентеролопчно! патологи [1, 7]. Незважаючи на нов^ш стратеги лшування гастроентеролопчних хвороб та потужний арсенал медикаментозних засобiв, простежуеться тенденщя до хрошзаци !х перебиу. Загальновизнано, що стрес е важливим фактором ризику багатьох гастроентеролопчних хвороб. Одшею з ланок ульцерогенезу е порушення функщональних характеристик кттинних мембран ефекторних структур. За рахунок зни-ження плинносп плазматичних мембран, дисба-
лансу в OTcreMi про - i антиоксидантного захисту (АОЗ), сповшьнення швидкосп метаболiзму оксиду азоту (NO) виникають порушення шлунко-вого кровотоку, клггинного дихання, енергоге-незу та апоптозу, що призводять до ураження слизово! оболонки шлунка (СОШ).
Актуальним залишаеться пошук нових ефек-тивних гастропротекторних засобiв, що реал> зують свiй вплив через молекулярш та генно! експресi! мехашзми [7]. Важливим компонентом клiтинних мембран СОШ е полшенасичеш жирнi кислоти (ПНЖК), що визначають чутливiсть кл> тини до дi! рiзних лiгандiв (гуморальних чин-никiв, цитокiнiв, iмуноглобулiнiв тощо) [11]. До iнших властивостей ННЖК належить регуляцiя проникностi мембран за рахунок впливу на по-верхневi властивостi фосфолiпiдiв, бшково-лшщ-ш та лiпiдно-лiпiднi взаемодi!, модуляцiю актив-ностi ензимiв та транспортних молекул, що вбу-дованi в мембрану. Модифшащя спiввiдношення
мiж ю- 3 (докозагексаенова i ейкозапентаенова кислоти) [12] i ю- 6 ПНЖК у фосфолiпiднiй обо-лонщ кттинно! мембрани зменшуе bmíct арахь доново! кислоти та ii активних метаболiтiв (лей-котрiенiв i тромбоксашв), що володiють вазокон-стрикторною дiею та цитоагресивними власти-востями. Одночасно ю- 3 ПНЖК спричиняють активащю природно! захисно! системи, що здатна забезпечити змши архiо- й ангютектошки та метаболiзму клiтин, i виявляють протипух-линну [13], антипролiферативну [9], лшолгтичну [6] та цитопротекторну [8] ди. Так, iз лте-ратурних джерел вiдоме застосування ю- 3 ПНЖК як засобу з антиатеросклеротичними, ан-тиагрегацшними [10], антиаритмiчними, проти-запальними [5, 11], антиоксидантними властиво-стями з метою кардюпротекци [2] та лшування атерогенних дислшопротешемш [14].
Метою нашо! роботи е вивчення впливу ю- 3 ПНЖК на структурно - функщональш вла-стивостi СОШ i на модуляцiю вивiльнення NO у щурiв за умов моделювання стрес-iндукованого ураження, яке, як вщомо, е етiопатогенетичним чинником численних гастроентеролопчних хвороб.
МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛ1ДЖЕНЬ
Для експерименпв використовували самцiв бiлих лабораторних дорослих щурiв масою 0,180,22 кг, що утримувались у стандартних умовах вiварiю з дотриманням мiжнародних вимог щодо гуманного вiдношення до тварин. Перед вщтво-ренням гострого стресу за стандартною методикою Takagi et al., 1964 (3,5-годинний водно-iмобiлiзацiйний стрес) застосовували харчову депривацiю, не обмежуючи тварин водою. Всiх щурiв було роздшено на групи по 8-12 тварин. Щурi I групи склали контрольну групу, а рештi тварин моделювали стрес, проте протягом 8 тиж-нiв щурам II групи вводили 1мл фiзiологiчного розчину per os (плацебо), а III групи - перо-рально за допомогою спещально! орогастрально! металево! трубки вводили ю- 3 ПНЖК (препарат епадол ЗАТ „Кшвський вiтамiнний завод" в дозi 30 мг/кг/добу). За лтературними даними, в такiй дозi епадол in vivo володiе виразним цитопро-текторним впливом [2, 8]. Пюля евтанази тварин виводили з експерименту; для вiзуалiзацil ура-жень СОШ шлунок фiксували у 10% розчиш формалiну на 10 хвилин, розрiзали по великiй кривизнi i методом плашметри обраховували площу (мм2) геморапчних уражень. Для мшро-скопiчного дослщження клiтинних та тканинних компонентiв СОШ при збшьшенш х200 та х400 проводили виготовлення серiйних гiстологiчних зрiзiв товщиною 5 мкм iз наступним забарвлен-
ням гематоксилiн-еозином. У KpoBi тварин до-слiдних груп визначали bmíct кiнцевих метабо-лiтiв оксиду азоту штрипв за методом Грюа, 1983, кiлькiсть продуктiв лшопероксидаци (малонового дiальдегiду, МДА) визначали за методикою Тимирбулатова та ш., 1981, каталазну активнiсть (Кат) - за штенсившстю забарвлення комплексу Н2О2 з молiбдатом амонiю (Королюк та ш., 1988), глутатiонпероксидазну активнiсть (ГПО) - за розвитком кольорово! реакци внасль док взаемодп SH-груп з реактивом Еллмана (Моин, 1986). Актившсть супероксиддисмутази (СОД) визначали методом Костюк та iн., 1990, який грунтуеться на вiдновленнi нiтросинього тетразолiю супероксидними радикалами. Для розрахунку вiдповiдностi мобшзаци антиокси-дантних систем ступеню активаци реакцiй лшопероксидаци розраховували коефщент контролю пероксидаци, К = СОД/МДА; К= СОД х КАТ/МДА, якi мають унiверсальний характер i е високошформативними. Bei вищеперелiченi па-раметри визначали спектрофотометрично на мiкроаналiзаторi PV 125 1С SOLAR. Визначали bmíct лшопроте!шв низько! щшьносп (ß-ЛП) (Бурштейн, 1982) i лужно! фосфатази (ЛФ). Ста-тистичну обробку даних проводили з вико-ристанням середшх значень ± середньоквадра-тичне вiдхилення та опрацьовували за допомогою програмного забезпечення STATISTICA for Windows 5.0 за допомогою апостерюрного тесту з порiвняння середнiх iз використанням критерiю Newman-Keuls. Значення p<0,05 вважали досто-вiрними.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ
Biдомо, що одшею з характерних швидких вiдповiдей кл^ин СОШ на дiю гострого стресу е !хш морфо-функцiональнi змiни. У таблицi зве-денi показники кшцевого продукту метаболiзму NO2 нiтриту - NO2 , перекисного окиснення лш> дiв (ПОЛ), природного АОЗ (КАТ, СОД, ГПО), bmíct ß-ЛП i ЛФ у кров^ а також даш плашметри про ураження СОШ тварин ушх експеримен-тальних груп.
При вивченш СОШ щурiв груп, яким моделювали стрес, виявлено альтеращю епггель альних елементiв та мiкрогемодинамiчнi розлади у прилеглiй стромi, проте простежувались оче-виднi особливостi у ступеш пошкодження. Так, епiтелiоцити шлунка, як за нормальних умов мають плоску форму, розпласташ по пiдлеглих структурах, унаслщок стрес-реакци змiнили форму, а деяка !х частина взагалi вiдокремились вiд прилеглих структур, зруйноваш мiжклiтиннi зв'язки. Biдомо, що одночасно спостершаеться змiна топологи клггинно! поверхш, знижуються
06/ Том XI/ 4
25
И адгезивш властивостi, а також морфолопя та функцiональна актившсть клiтинних органел. При гiстологiчному дослщженш СОШ тварин II групи рееструвались поверхневi та ерозивнi пошкодження, що виражались дистрофiчними змiнами, некрозом та апоптозом та гемодина-мiчними розладами (ознаками нерiвномiрноl гшереми, стазу, мюцями - периваскулярними дiапедезними крововиливами та нерiвномiрно вираженим набряком у шдлеглш стромi). Вплив
виявив менш виражеш ураження СОШ щурiв III групи, площа поверхневих пошкоджень зменши-лась на 33%, а площа ерозш - на 38% по вщ-ношенню до тварин II групи (табл.). Отримаш результати дозволяють трактувати введення ю- 3 ПНЖК як цитопротекторну мембранотропну дiю на токсичний вплив катехоламiнiв, лiзосо-мальних ензимiв i порушення енергетичного забезпечення СОШ, якими характеризуеться роз-виток стресово! реакци.
Змши дослiджуваних показникчв у кров1 щурiв у норми (I група) i за умов стрес-iндукованих уражень (II i III групи) при застосуваннi ю- 3 ПНЖК (III група), (М+т;
п=8-12)
Показники
Контроль Дослвд
1група 2 група 3 група
N02 , ткМ 7,51 ± 0,02
МДА, мкмоль/мл 56,75 ± 2,50
СОД 269,85 ± 0,68
Каталаза, мкмоль Н2О2 /млхгод 0,0298 ± 1,91
ГПО, мкмоль GSH/млxхв 0,52 ± 0,03
СОДхКат/МДА 1,44 ± 11,07
Лужна фосфатаза, мкмоль/с х л 4,27 ± 0,05
В-л1попроте1ди, ум.од. 4,03 ± 0,15 Площа поверхневих уражень, мм2 -Площа ерозш, мм2 -
7,64 ± 0,04 141,31 ± 3,60* 255,31 ± 2,17 0,0307 ± 0,77 1,81 ± 0,02* 0,56 ± 1,87
10,42 ± 0,40
7,15 ± 0,11 20,90 ± 0,84 2,69 ± 0,19
10,23 ± 0,07* 96,30 ± 0,91* 395,80 ± 7,27* 0,0481 ± 1,03* 3,14 ± 0,08* 1,98 ± 6,37
7,21 ± 0,06
4,12 ± 0,17 14,08 ± 0,68 1,07 ± 0,21
Прим1тка: * - в1рогщшсть вщмшност вщ контролю, р<0,05
Нами встановлено, що для тварин рiзних екс-периментальних груп характернi змiни NO2 , причому порiвняно з контролем у тварин, яю споживали ю- 3 ПНЖК, характерне збшьшення на 36% (р<0,05). Це свiдчить, що ю- 3 ПНЖК пiдвищують вазотропну ендотелiальну актив-нiсть N0, який сприяе розслабленню гладень-ком'язових клiтин, покращуе локальне крово-постачання СОШ. Таке збшьшення продукци та/або вивiльнення N0 може запобшати впливу будь-яких уражувальних чинникiв, що викли-кають дисфункщю ендотелiю та дефiцит N0 ^ як наслiдок, погiршують перфузiю тканин. Це тдтверджують лiтературнi джерела, в яких дослщники показали, що модифшащя синтезу ейказаноадв унаслiдок змiни лшщного складу клiтинних мембран модулюе реактившсть судин-ного тонусу у бш вазодилатаци [2].
Вiдомо, що тд час стресу пiдвищуеться штенсившсть процесу лшопероксидаци (ПОЛ), а новоутвореш продукти мають мембранотоксичнi властивостi. Дослщжено, що тварини, яким вводили ю- 3 ПНЖК, тд час стрес-вщповда мали
нижчий рiвень вторинного продукту ПОЛ - МДА (64% вщ аналогiчних результатiв щурiв II групи; р<0,05). Цей ефект можна пояснити тим, що модифшоваш кттинш мембрани мають менший стутнь ненасичених ацильних залишкiв жирних кислот для процесу переокиснення лiпiдiв. Ак-тивацiя процесiв лшопероксидаци у кровi вщ-бувалась з одночасними змшами активностi АОЗ, причому змiна показниюв СОД, Кат, ГПО була рiзноспрямованою. Доведено, що дисбаланс мiж ПОЛ i АОЗ, що виникае тд час стресу, зумовлюе ураження кл^ин. Результати засвiд-чили, що застосування ю- 3 ПНЖК спричинило збiльшення активностi СОД на 47%, тодi як у тварин, що отримували плацебо, простежувалось зниження на 5% щодо штактних тварин. Поряд iз цим, вмют Кат пiд час стрес-вiдповiдi у щурiв II групи збiльшився на 3%, а у III груш - на 61%. Змша активносп ГПО мала таку ж спрямо-вашсть, як i Кат, а саме: була шдвищена для тварин II групи ( в 3, 4 рази), i для тварин III групи (6 разiв). Збшьшення активносп антиокси-дантних ензимiв у II груш можна трактувати як
компенсаторне явище, призначене для усунення кшькосп вшьнорадикальних продуктiв та !х метаболтв, а значний рiст у III групi - як позитивну прогностичну ознаку захисту ю- 3 ПНЖК бiологiчних мембран вiд ди перекисiв [3]. Аналiз унiверсальних коефiцiентiв стввщно-шення ПОЛ-АОЗ (СОДхКат/МДА) засвiдчив мо-бiлiзацiю антиоксидантно! активностi (> 1) у тварин III групи, якi споживали ю-3 ПНЖК, тодi як у II груш (< 1) переважали процеси перо-ксидаци.
Гострий стрес характеризуеться порушеннями вуглеводно-лiпiдного обмiну, що супроводжу-еться зсувом окиснювально-вiдновного гомео-стазу в бiк утворення вщновлених еквiвалентiв, що викликае блокування аеробних процешв та розвиток тканинно! гшокси. Нами виявлено, що динамiка змш Р-ЛП пiсля моделювання стресу свщчить про зменшення на 57,6% у щурiв III групи порiвняно до аналопчних показникiв II групи (р<0,05). Оскiльки Р-ЛП е основною тран-спортною системою жирiв ендогенного поход-ження та мiстять у своему складi важливi енергетичнi (ПНЖК) та пластичш речовини (холестерин, фосфолiпiди), то таку метаболiчну перебудову можна трактувати як шдтримку гомеостазу з мобшзащею використання енерге-
тичних ресуршв [4]. Актившсть ЛФ унаслiдок стрес-вiдповiдi достовiрно pi3KO пiдвищyвалась у тварин II групи у 2,4 раза в пор1внянш з контрольною групою, тодi як у тварин III групи -лише в 1,6 раза, що свщчить про зменшення темпу розвитку порушень, знижену метаболiчнy потребу, кращий рiвень кровопостачання тканин, меншу iнтенсивнiсть глiколiзy.
ВИСНОВКИ
1. Цитопротекторна дiя на СОШ ю-3 ПНЖК зумовлена модифшащею синтезу ейкозано1дав, посиленням мембраностабiлiзyючих i бшково-синтетичних процешв у клiтинах.
2. Змша лiпiдного складу клiтинних мембран унаслщок вживання ю-3 ПНЖК призводить до виражено! активаци системи NO, змшюючи реа-ктивнiсть локальних судин у бш вазодилатаци.
3. За суттевих змiн прооксидантно- антиокси-дантного гомеостазу ю-3 ПНЖК мають виразну антиоксидантну дiю, можуть бути антагонiстом розвитку оксидативного стресу в органiзмi.
4. Встановлена в експеримент динамiка стану процешв ПОЛ-АОЗ вказуе на доцшьшсть засто-сування модифшацп жирнокислотного складу клггинних мембран для корекци стрес^ндуко-ваних порушень.
СПИСОК Л1ТЕРАТУРИ
1. Бойко Т.И. Использование жира акулы черноморской "Олеовит" в гастроэнтерологической практике // Гастроентеролопя. - Дншропетровськ, 2004.-Вип.35.-С.522-529.
2. Вплив модифшацп жирнокислотного складу клггинних мембран на адренерпчну реактивнiсть серця та судин / Шиш А.М., Пивовар С.М., Кукоба Т.В. та ш. // Фiзiол. журн. - 2004. - Т.50, № 6. - С.19-26.
3. Грвднев O.G. Перекисне окиснення лшщв i жирiв // Сучасна гастроентеролопя. - 2005.- № 5 (25).-С.80-83.
4. Свободнорадикальное окисление и антиокси-дантная терапия / Казимирко В.К., Мальцев В.И., Бутылин В.Ю., Горобец Н.И. - К.: Морион, 2004.-160 с.
5. Arimura K. Effects of omega-3 polyunsaturated fatty acids on inflammatory markers in COPD // Chest. -2005.- Vol. 128, N 6.-Р. 3817-3827.
6. Eicosapentaenoic acid, but not oleic acid, stimulates beta-oxidation in adipocytes / Guo W., Xie W., Lei T., Hamilton J.A. // Lipids.- 2005.- Vol. 40, N 8.-P.815-821.
7. Gyires K. Gastric Mucosal Protection: From Prostaglandins to Gene-Therapy // Current Medicinal Chemistry.- 2005.- N 12.-P. 203-215.
8. MacLean C.H. Systematic review of the effects of n-3 fatty acids in inflammatory bowel disease // Am. J. Clin. Nutr.- 2005.- Vol. 82, N 3.- Р. 611 - 619.
9. Merendino N. Docosahexaenoic acid induces apo-
ptosis in the human PaCa-44 pancreatic cancer cell line by active reduced glutathione extrusion and lipid peroxidation // Nutr. Cancer.- 2005.- Vol. 52, N 2.-P.225-233.
10. Modulation of antioxidant enzyme activities, platelet aggregation and serum prostaglandins in rats fed spray-dried milk containing n-3 fatty acid / Ramaprasad T.R., Baskaran V., Krishnakantha T.P., Lokesh B.R. // Mol. Cell. Biochem.- 2005.-Vol. 277, N 1-2. - P.19-26.
11. Modulation of respiratory syncytial virus-induced prostaglandin E2 production by n-3 long-chain polyun-saturated fatty acids in human respiratory epithelium / Bryan D.L., Hart P., Forsyth K., Gibson R. // Lipids. -
2005.- Vol. 40, N 10.- P.1007-1011.
12. Onuki Y. Docosahexaenoic Acid and eicosapen-taenoic Acid induce changes in the physical properties of a lipid bilayer model membrane // Chem. Pharm. Bull.-
2006. - Vol. 54, N 1.- P. 68-71.
13. Polyunsaturated fatty acids inhibit telomerase activity in DLD-1 human colorectal adenocarcinoma cells: a dual mechanism approach // Eitsuka T., Nakagawa K., Suzuki T., Miyazawa T. // Biochim. Biophys. Acta. -2005.- Vol. 1737, N 1.-P.1-10.
14. Zeman M. Effect of n-3 polyunsaturated fatty acids on plasma lipid, LDL lipoperoxidation, homocysteine and inflammation indicators in diabetic dysli-pidemia treated with statin + fibrate combination // Cas. Lek. Cesk. - 2005.- Vol. 144, N 11.- P.737-741.
06/ Том XI/ 4
♦
27
