CC BY
18
Ri'qi: - tmy Mcchanisms
înTïiosystems
* %
Regulatory Mechanisms
in Biosystems
ISSN 2519-8521 (Print) ISSN 2520-2588 (Online) Regul. Mech. Biosyst., 8(4), 577-582 doi: 10.15421/021789
The effect of antimicrobial agents on planktonic and biofilm forms of bacteria that are isolated from chronic anal fissures
I. M. Kozlovska*, N. Y. Romanjuk**, L. M. Romanjuk**, M. D. Kukhtyn***, Y. V. Horiuk****, G. V. Karpyk***
*Bukovinian State Medical University, Chernivtsi, Ukraine
**I. Y. Horbachevsky Ternopil State Medical Universi, Ternopil, Ukraine
***TernopilIvan Puluj National Technical University, Ternopil, Ukraine
****State Agrarian and Engineering University in Podilya, Kamianets-Podilskyi, Ukraine
Kozlovska, I M., Romanjuk, N. Y., Romanjuk, L. M., Kukhtyn, M. D., Horiuk, Y. V., Karpyk, G. V. (2017). The effect of antimicrobial agents on planktonic and biofilm forms of bacteria that are isolated from chronic anal fissures. Regulatory Mechanisms in Biosystems, 8(4), 577-582. doi:10.15421/021789
The microorganisms that are formed in biofilm cause about 60% of chronic and recurrent diseases, and as a consequence, traditional etiotropic antibacterial therapy is ineffective. Chronic anal fissures are also a disease which is caused by biofilm forms of bacteria, has a chronic course and is difficult to treat. The sensitivity of planktonic and biofilm forms of bacteria isolated from chronic anal fissures to antibacterial drugs was determined and the method of degradation of biofilm by electrophoresis for the effective treatment of fissures was developed. It was found that the most effective antibiotics against planktonic forms of bacteria were cephalosporins III and IV generations: cefepime, cefoperazone and ceftazidime. Exceptionally, only bacteria of the genus Enterococcus, which were sensitive to ceftazidime, were found to be 38.9%. The sensitivity of the bacteria to Furamag was from 60.0% to 100.0%, and only P. aeruginosa exhibited resistance in 100.0% of the studied cultures. The number of sensitive to gatifioxacin strains of P. aeruginosa and Enterobacter spp. was 71.4%, all other isolated bacteria were sensitive to this preparation from 77.8% to 100.0%. Among the five studied antiseptics (chlorhexidine, decasan, octinisept, povidone iodine, dioxidine), the greatest antimicrobial activity was found in dioxidine and betadine (povidone iodine) solutions, the sensitivity of the microflora was from 60.0% to 100.0%. We found that the most protected biofilm matrix was P. aeruginosa and Enterococcus spp. We found that the antibiotic which had the best effect on cells in biofilm was fluoroquinoione gatifloxacin. After its influence on fhe biofilm P. aeruginosa and Enterococcus spp., the number of living cells didn't exceed lg 1.5 ± 0.02 CFU/cm2 in the area of the biofilm, and S. aureus and E. coli cells were completely inactivated. After the influence of other antibiotics, the number of microbial cells that survived in the biofilm did not exceed lg 2.9 ± 1.6 CFU/cm2 of the area. It was found that after the action of dioxin, the amount of viable microbial cells was up to lg 2.9 ± 1.7 CFU/cm2 of biofilm area. Antiseptics: octine septum, ranopost, decaSan and chlorhexidine exhibited less strong bactericidal action on cells in biofilms, and the number of bacteria that survived after fheir action ranged from 2.9 ± 1.8 to lg 3.7 ± 2.1 CFU/cm2 of biofilm area. We propose using solution "Dioxysol-Darnitsa" (active substance dioxidine) for local treatment of patients with chronic anal fissures for intracutaneous electrophoresis of the fissure. We established that under the influence of electrophoresis at a current of 0.05-0.10 mA/cm2 of the area of the biofilm with dioxidine, bacteria were not isolated. This indicates on the destruction of the matrix and the effective contact of dioxidine with microbial cells and the manifestation of bactericidal action. Consequently, laboratory microbiological studies indicate that the use of electrophoresis with dioxysole in the treatment of chronic anal fissures is promising.
Keywords: antibiotics; antiseptics; sensitivity; biofilm; electrophoresis; anal fissures
Article info
Received 08.10.2017 Received in revisedform
14.11.2017 Accepted 1611.2017
Bukovinian State Medical University, Theatralna sq., 2, Chernivtsi, 58002, Ukraine. Tel.: +38-050-670-59-13 E-mail: irkakim5@gmail com
I. Horbachevsky Ternopyl State Medical University, m. Voli, 1, Ternopil, 46001, Ukraine. Tel.: +38-097-854-87-81 E-mail: fedchyshyn@tdmu. edu. ua
Ternopil Ivan Puluj National Technical University, Ruska st., 56, Ternopil, 46001, Ukraine. Tel.: +38-097-239-20-57 E-mail: [email protected]
State Agrarian and Engineering University in Podilya, Schevchenko st., 13, Kamianets-Podilskyi, 32300, Ukraine.
Tel.: +38-097-661-79-64 E-mail: [email protected]
Bn^HB aHTHMÏKpoÔHHx npenapaTiB Ha nmHKTOHHi
Ta ôion^ÎBKOBi (|)opivin oaKTepin, Bigmem 3 xpomHHix aHa.ibHiix Tpi^HH
I. M. Ko3noBCbKa*, H. G. POMOHMK**, H. M. POMOHTOK**, M. fl. KyxTHH***, M. B. ToproK****, r. B. KapnHK***
*EyKoeuncbKuü depwaenuü Medmnuü ynieepcumem, Hepnie^, YKpaïna
**TepnoninbCbKuü depwaenuü Medmnuüynieepcumem iMeni I. fl. Гор6ацeeсbкого, Tepnonim, YKpaïna ***TepnoninbCbKuü natyoncwbnuü mexniunuüynieepcumem iMeni I. nynmx, TepnoniMb, YKpaïna ****nodinbCbKuü depwaenuü czpcpno-mexnmnuüynieepcumem, Кcм'мneцb-ПoдiмbCbкuü, YKpaïna
Визначено чутлив^ь планктонних та бiоплiвкових форм бактерш, видiлених i3 хронiчних анальних трiщин, до антибакгерiальних препаратов, розроблено спосiб деградацй бiоплiвки електрофорезом для ефекгивного лiкування дефекту слизово! оболонки. Найефекгивнiшими з антибiотикiв на планктонш форми бактерш виявилися цефалоспорини III i IV поколiння: цефепiм, цефоперазон i цефтазидим. 1з п'яги дослщжених антисептиюв виявлено найбiльшу протимiкробну даю розчину дюксидину та розчину бегадину (пов1донйод): чутливiсть мiкрофлори становила 60-100%. 1з дослiджених антибiотикiв найкраще впливае на клiтини бiоплiвки гатифлоксацин. Пюля його ди на бiоплiвки Pseudomonas aeruginosa i Enterococcus spp. юлькюгь живих клiтин не перевищувала lg 1,5 ± 0,02 КУО/см2 площi бiоплiвки, а клiтини Staphylococcus aureus i Escherichia coli повнютю iнакгивованi. Пюля впливу iнших антибiотикiв юлькюгь мiкробних клiтин, що вижили у бюпшвщ, не перевищувала lg 2,9 ±1,6 КУО/см2 площь Пiсля ди дюксидину юльюсть життездатних мiкробних клiтин становила до lg 2,9 ± 1,7 КУО/см2 площ бiоплiвки. Запропоновано для мюцевого лiкування хворих на хрошчш анальнi трiщини та для внутршньотканинного елекгрофорезу трiщин використовувати розчин «Дюксизоль-Дарниця» (дiюча речовина дюксидин). П1д час електрофорезу силою струму 0,05-0,10 мА/см2 площi бiоплiки з дюксидином бактерш не видшено. Це вказуе на руйнування матриксу та добрий контакт дюксидину з мiкробними кттинами та прояв бактерицидно! ди.
Ключовi слова: антибютики; антисептики; чутливiсть; бiоплiвка; електрофорез; анальнi трiщини Вступ Матерiал i методи досл1джень
Нинi проблема боротьби i3 септичними запальними захво-рюваннями, яи мають хронiчний перебгг, досить актуальна, оскшьки вони спричиняються мжрооргатзмами у бiоплiвцi, а традицшна етютропна антибактерiальна терапiя малоефектив-на (Zhao et al., 2013; Penesyan et al., 2015; Banin et al., 2017; Vorobey et al., 2017). Це пов'язано з тим, що мжрооргатзми у бiоплiвцi в 10-100 разов спйктп до антибактерiальних препаратов за сво! планктоннi форми (Но&у et al., 2010; Fuente-Nunez et al., 2013; Manavathu et al., 2014; Kukhtyn et al., 2017). У нау-ковiй лiтературi описано низку чинниив, якi вщповщають за резистентнiсть бiоплiвкових форм бактерш до антибютиив. Бактери у бюпшвщ мають знижений метаболiзм i сповшьнену швидисть росту клiтин, внаслiдок чого антимжробш препара-ти дифундують iз бiоплiвки швидше, нiж досягаеться !х дш (Weigel et al., 2007; Hall-Stoodley and Stoodley, 2009). У бюпшв-ц вiдбуваегься шактиваця антибютиюв позаклiтинними поль мерами та ензимами та формування за впливом антимжробних препаратов клiтин-персистерiв (Gostev and Sidorenko, 2010). Також бактери у бюпшвщ можуть обмшюватися плазмiдами, яи мтстять гени, що вiдповiдають за !х резистенгнiсть до анти-бiотикiв (Hall-Stoodley et al., 2004; Atkinson and Williams, 2009; Flemming and Wingender, 2010; Van Acker et al., 2014). Екзопо-люахариди матриксу бюшпвки перешкоджають фагоцитарнш акгивностi макрофапв, внаслщок чого фагоцити не дгать на бактерй, сформованi у бiоплiвки (Mah and O'Toole, 2001; Perci-val et al., 2012; Soto, 2013).
Ниш домхжрно встановлено роль бюгшвок у розвитку понад 60% хротчних або рецидивуючих захворювань, в пато-генезi яких бере участь мжробний чинник (Sanchez et al., 2013). Для мжрооргантмв перебування у стат бiоплiвки, який ха-рактеризуеться прикртленням до будь-яко! поверхнi, що оми-ваеться - базова властивiсть, яка виробилася впродовж мшьйо-нiв роив за впливу природного вiдбору та змшних екологiчних чинникiв (Atkinson and Williams, 2009; Bessa et al., 2015). Тому ниш науковц вважають, що ефектившсть будь-якого антимж-робного препарату чи способу лiкування слщ шеревiряти на ад-гезованих мжрооргатзмах i вважати ефективними тi концен-трацii (дози), яи дтоть бактерицидно на бшьшкть бактерш у бюгшвках, а не на планктоннi !х форми (Levis, 2001; Cooper et al., 2014; Kukhtyn et al., 2017).
До захворювань, яи мають хрошчний перебог i важко лжу-ються, вiдносягъ хронiчнi аналънi трщини (ХАТ) (Ebinger et al., 2017; Stewart et al., 2017; Wienert et al., 2017). Проте наразi дослiдники недостатньо звертають увагу на роль бюгшвкових форм бактерiй у виникнент ХАТ. Тому вивчення видового складу мжрофлори ХАТ, здатнiсть iзольованих бактерiй фор-мувати бiоплiвки та розроблення ефективних методов терапев-тичного впливу на бiоплiвки - ключовi питання лжування ще! патологи.
Мета дослщження - визначити чутливiсть планктонних i бiоплiвкових форм бактерiй, видлених iз ХАТ, до антибакте-рiальних препарата i розробити сшосiб деградацй бюттвки електрофорезом для ефективного лжування трщин.
Вид1лення та 1дентиф1кац1я мжрооргатзм1в. Для видь лення стафiлококiв змиви з ХАТ засiвали на середовище -жовтково-сольовий м'ясошептонний агар. Видлення ентеро-кок1в проводили на середовищ Bile Esculin Azide Agar, стреп-тококiв - Streptococcus Selective Agar (HiMedia). Ентеробакте-рй (ешерихй, проте!, клебаели та iншi) вирощували на середо-вищах Ендо, Левiна та Плосюрева (Фармактив). Видiлення Pseudomonas aeruginosa проводили на середовищi Pseudomonas Isolation Agar (HiMedia). 1дентифкащю видлених чисгих культур проводили за морфолопчними, тинкторiальними, культуральними, бiохiмiчними властивостями та ознаками па-тогенностi. Посiви шкубували в термостатi за температури 37 °С упродовж 24-48 годин. 1дентифжацто чистих культур проводили, враховуючи бiохiмiчнi тести, описанi у визначнику бак-терiй Берджi (Vos et al., 2011).
Визначення щиьносп утворених бюпл1вок. У стерильш одноразовi пласгиковi чашки Петрi вносили 5 см3 м'ясопептонно-го бульйону та 1 см3 добово! тест-культури мжрооргашмв (Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, P. aeruginosa) у концентраций 10 КУО/см3 та шкубували за температури 37 °С упродовж 24-48 годин. Пюля шкубацй чашки триразово вiдмивали вщ планктонних (неприкрiплених) мжроор-ганiзмiв фосфатним буфером, висушували га фiксували утворет бiоплiвки 96° етиловим спиртом упродовж 10 хвилин. Погiм за-барвлювали 0,1% розчином кристалiчного фiолетового впродовж 10 хвилин. У чашки Петрi додавали 3,0 см3 96° етилового спирту га запищали на 20-30 хвилин, перюдично струшуючи. Вимрюва-ли оптичну густину спиртового розчину спектрофотометрично за довжини хвилi 570 нМ (Stepanovic et al., 2000). За густини промив-ного розчину з бiоплiвок до 0,50 од. щльтсть сформованих бю-плiвок вважали низькою, вiд 0,51 до 1,00 од. - середньою та за густини розчину понад 1,01 од. - високою (Kukhtyn et al., 2017).
Визначення чутливост1 м1кроорган1зм1в, що перебува-ють у бюгшвковш форма, до антибютиив i антисешгикiв проводили на добових мiкробних бiоплiвках, вирощених у пласти-кових чашках Петрi. Пiсля 24 годин шкубацй культур чашки триразово вщмивали вiд планктонних (неприкрiшлених) мжро-органiзмiв стерильним фосфатним буфером i вносили 5 см3 свiжоприготовлених антибютиив або антисептиив. Пiсля екс-позици антибiотики та антисептики зливали, чашки триразово промивали стерильним фосфатним буфером, вносили 5 см3 стерильного 0,9% розчину натрто хлориду та стерильним тампоном ретельно вщмивали зi стiнок i дна чашки мiкробну бю-пшвку. 1з чашок вiдбирали 1,0 см3 суспензи, готували низку десятикратних розведень, проводили шосiв 1,0 см3 кожного розведення у чашки Петрi, заливали МПА та iнкубували за температури 37 °С упродовж 24-48 годин для визначення кшь-костi бактерш (Cucarella et al., 2004).
Визначення чутливосп планктонних мiкроорганiзмiв, видъ лених iз хронiчних ран, до антибютиив проводили класичним диск-дифузiйним методом Кiрбi - Бауера. Визначення чутливосп планктонних мiкроорганiзмiв до антисептикiв проводили таким способом. Готували суспензи з чистих культур, витали суспензи в чашки Петрi з МПА, виготовляли в МПА лунки за
допомогою пробойника № 10, заповнювали лунки антисептиками. Чашки Петр1 шкубували в термостат упродовж 24 годин, потам оцшювали результат за даметром затримання росту мiкроорганiзмiв навколо лунки. Д1аметр до 15 мм - мжроорга-нiзми нечутлив1 до антисептиюв, вщ 16 до 20 мм - мжроорга-нiзми помрно чутлив1 до антисептиюв, вщ 21 до 25 мм - мжро-органозми чутлив1 до антисептиюв, вщ 26 мм i бшьше - мшроор-ганiзми високочутлив1 до антисептиюв (КиШуп е1 а1., 2014).
Вивчення впливу електрофорезу р1зно! сили струму на бактерш, яю перебувають у бюптвковш форм1, проводили за власною методикою. Вирощували мiкробнi бюшпвки у сте-рильних одноразових чашках Петрг Шсля вщмивання план-ктонних кллин фосфатним буфером вносили у чашки з бю-пшвками 5 см3 стерильного 0,9% розчину натрою хлориду, вставляли електроди та овдключали прилад «Поток-1». Трива-лгсть до - 60 хвилин, сила струму - 0,025-0,100 мА/см2 площ1 чашки Петрг Посля закшчення до електрофорезу з чашок Петр1 зливали ф1зрозчин 1 змивали вiдшарованi мiкробнi бю-плшки стерильним фосфатним буфером. Потiм вносили 5 см3 стерильного 0,9% розчину натрто хлориду та стерильним тампоном ретельно вщмивали зi стшок i дна чашки мiкробну бю-
пл1вку. 1з чашок в1дбирали 1,0 см3 суспензи, готували десяти-кратн розведення, витали 1,0 см3 кожного розведення у чашки Пегр1, заливали МПА та гнкубували за температури 37 °С упродовж 48 годин для визначення юлькостт бактерш. Для ви-значення впливу електрофорезу з антисептиком дюксизолем на мжробш бюошвки дослщження проводили аналопчно, тшь-ки електроди занурювали в чашки Петр1 з бюшпвками не у ф1зрозчин, а в дюксизоль.
Статистичну обробку результата здшснювали методами вар1ацшно1 статистики з використанням програми Statistica 6.0 (StatSoft Inc., USA). Застосовували непараметричнi методи до-слiджень (критери У1лкоксона, Манна - У1тт). Визначали се-редне арифметичне (x), стандартну похибку середньо1 величини (SE). Р1зницю мiж пор1внюваними величинами вважали досто-в1рною за Р < 0,05.
Результати
Проведено пор1вняльт досл1дження чутливосп видлених бактерш, яю перебувають у планктонному стаи (табл. 1) та у сформованих бюпшвках (табл. 2), до антимжробних препаратов.
Таблиця 1
Чутливють (%) планктонних форм бактерш, видлених i3 хронiчних анальних трщин до ашимжробних препаратов
Антимжробт препарати, -кОлькОсть д1ючо1 речовини P. aeruginosa, n = 7 E. coli, n = 34 S. aureus, n = 6 / 1,41__II. l/lii. 111 V kll\ Enterococcus spp., n = 18 Ltpil Proteus spp., n = 10 Enterobacter spp., n = 3 Citrobacter spp., n = 3
ЦефепОм, 30 мкг 87,7 91,2 83,3 83,3 100,0 100,0 100,0
Цефтазидим, 30 мкг 100,0 91,2 100,0 38,9 100,0 100,0 100,0
Цефоперазон, 75 мкг 71,4 91,2 100,0 88,9 100,0 100,0 100,0
Цефтриаксон, 30 мкг 42,8 67,6 83,3 44,4 0,0 66,7 33,3
Цефуроксим, 30 мкг 71,4 82,3 83,3 77,8 30,0 33,3 66,7
ГентамОцин, 10 мкг 87,7 88,2 83,3 72,2 100,0 100,0 100,0
Доксициклш, 10 мкг 0,0 76,5 50,0 38,9 60,0 33,3 66,7
Фурамаг, 300 од. 0,0 97,0 83,3 83,3 60,0 66,7 100,0
Гатифлоксацин, 5 мкг 71,4 97,0 83,3 77,8 100,0 66,7 100,0
Ципрофлоксацин, 5 мкг 71,4 91,2 66,7 72,2 100,0 100,0 100,0
Дюксизоль (дОоксидин) 87,7 88,2 100,0 88,9 60,0 66,7 100,0
Октетсепт, 1 : 1 42,8 76,5 100,0 83,3 30,0 66,7 66,7
Бетадин, 10% 71,4 88,2 100,0 88,9 100,0 100,0 100,0
Декасан, 0,02% 42,8 67,6 50,0 72,2 30,0 66,7 33,7
Хлоргексидин, 0,05% 57,1 58,8 50,0 77,8 60,0 66,7 66,7
Найефективтшими серед дослджених антибютиюв вия-вилися цефалоспорини III i IV поколгння: цефешм, цефопера-зон i цефтазидим. Ц антибютики проявляли бактерицидну д1ю на ва видiленi бактерй з ХАТ. Винятком виявилися лише бактерй роду Enterococcus spp., якi чутливi до цефтазидиму в 38,9%. Протимжробна активнiсть гнших цефалоспоритв хоча й була висока, але значно менша, нiж у цефоперазону та цефтазидиму. Чутливють планктонних форм бактерш до цефтри-аксону коливалася у межах 33,3-83,3%, а Proteus spp. узагал стшю до цього препарату. Чутливiсть видiлених бактерш до препарату ттрофуранового ряду - фурамагу - також висока (60-100%), лише P. aeruginosa проявляла стшюсть у 100% до-слiджуваних культур.
Амiноглiкозид гентамшин проявляв стабiльну бактерицидну дiю на ва видiленi бактерй, чутливю'П) 1х становила 72,2-100,0%. Ефективтсть антибiотикiв тетрациклшового ряду, зокрема, докси-циклшу, низька. Сл1д в1дмтити досить високу протимжробну ак-тивтсп> у препаратов фторхшолонового ряду гатифлоксацину та ципрофлоксацину. Кльюсть чутливих до гатифлоксацину штамзв P. aeruginosa та Enterobacter spp. становила 71,4%, ва rnmi видле-m бактерй чутлив1ш1 до цього препарату (77,8-100,0%). Найвища чутливiстъ до ципрофлоксацину була в ентеробактерш - 91,2100,0%, найменша - у стафiлококiв i ентерокоюв - 66,7-72,2%. Отже, результати визначення чутливосп видлено1 мжрофлори до антибютиюв мають велике юптчне значення, оскiлъки дозволя-ють обгрунтувати вийр радюнальжа схеми антибiотикотерапii.
Для мсцевого лiкування хронjчних анальних трjщин з анти-мiкробних препаратов найчасттше використовують антисептики.
Ми визначили чутливiсть видшежд мзкрофлори до антисептиюв. 1з п'яти дослОджених антисептиюв виявлено найбльшу протимжробну дю у розчинiв доксидину та бетадину (повОдонйод), чутли-вють мзкрофлори становила 60,0-100,0%. Найменш активний вОд-носно видiленоï мзкрофлори антисептик декасан: чутливiсть бактерш - 30,0-72,2%. Враховуючи антимжробну дю антисептиюв для мОсцевого лОкування хворих на ХАТ i для внутрОшньотканин-ного електрофорезу трщин ми використовували розчин «Дюкси-золь-Дарниця» (дюча речовина доксидин).
Мжрооргатзми здебшьшого перебувають у бюгтвках, а планктонна форма призначена для колотзацу Онших локалiза-ц1й. Результати дослщжень впливу антимгкробних препаратов на бактерй, яю сформован! у бюошвки, наведено в таблиц! 2. У дослщ в!д!брано штами бактерой, планктонш форми яких чутлив! до визначених у досл!д1 антиб0отик1в у диск-дифузному метод! КОрбО - Бауера та антисептикОв у луночковому метод!.
Як видно з даних таблиц! 2, антимжробт препарати (анти-бОотики та антисептики) проявляли бактерицидну дОю до мжроор-ганОзмОв у м1кробн1й бюшпвщ, проте м1кробн1 клОтини виявлялися життездатними на р1вн1 вище «порогу шфОкованосп». НайбОльше захищенО бОоплОвкою виявилися клпини P. aeruginosa та Enterococcus spp. 1з дослОджених антимОкробних засобОв найкраще впли-вае на клпини в бюплОвщ гатифлоксацин. ПОсля до гатифлоксацину на бОоплОвки P. aeruginosa та Enterococcus spp. юлькОсть живих клОтин не перевищувала lg 1,5 ± 0,1 КУО/см2 площ1 бОоплОвки, а клОтини S. aureus О E. coli повнОстю ОнактивованО. За д10 Онших анти-бютикОв кОлькОсть мОкробних клотин, що вижили, не перевищувала lg 2,9 ± 1,6 КУО/см2 площО бОоплОвки. З антисептикОв на бактерй у
бюшпвках найкраще дiяв дюксидин: кшькють життездатних мж-робних клпин становила lg 2,9 ± 1,7 КУО/см2 пищ бюшпвки. 1нш1 антисептики (октенюет; декасан i хлоргексидин) проявляли
меншу бактерицидну дю на клпини у бюплшках, кiлькiсгь бактерш, що вижили Шсля !х до, становила вщ lg 2,9 ± 1,8 до lg 3,7 ± 2,2 КУО/см2 площ1 бюшпвки.
Таблиця 2
Вплив антимжробних прешарагiв на бактерй у склада бюплшки (lg КУО/см2, x ± SE)
Антимiкробнi
Кiлькiсть кттин P. aeruginosa у бiоглiвцi, n = 4
Кiлькiсть клiтин E. coli у бюпшвщ, n = 12
Юльюсть клпин S. aureus у бюшдвщ, n = 3
Кшьюсть клiтин Enterococcus spp. у бюшдвщ, n = 5
дточо!речовини до ди препарату п!сля ди препарату до ди препарату п!сля ди препарату до ди препарату П!СЛЯ дй препарату до дй препарату п!СЛЯ дй препарату
Цефешм, 30 мг/л 6,6 ± 4,1 2,8 ± 1,3 6,5 ± 4,1 2,8 ± 1,5 6,7 ± 4,2 2,8 ± 1,3 6,7 ± 4,3 2,9 ± 1,3
Цефтазидим, 30 мг/л 6,6 ± 4,1 2,3 ± 1,3 6,5 ± 4,1 2,2 ± 1,2 6,7 ± 4,2 2,3 ± 1,2 6,7 ± 4,3 2,8 ± 1,5
Цефтриаксон, 30 мг/л 6,6 ± 4,1 2,1 ± 1,2 6,5 ± 4,1 2,9 ± 1,3 6,7 ± 4,2 2,7 ± 1,4 6,7 ± 4,3 2,8 ± 1,5
Гентамiцин, 10 мг/л 6,6 ± 4,1 2,5 ± 1,4 6,5 ± 4,1 2,3 ± 1,9 6,7 ± 4,2 2,9 ± 1,5 6,7 ± 4,3 2,9 ± 1,6
Гатифлоксацин, 5 мг/л 6,6 ± 4,1 1,5 ± 0,1 6,5 ± 4,1 0 6,7 ± 4,2 0 6,7 ± 4,3 1,4 ± 0,2
Дюксизоль 6,6 ± 4,1 2,8 ± 1,6 6,5 ± 4,1 2,8 ± 1,6 6,7 ± 4,2 2,8 ± 1,5 6,7 ± 4,3 2,9 ± 1,7
Октенiсепт, 1 : 1 6,6 ± 4,1 3,4 ± 1,9 6,5 ± 4,1 2,9 ± 1,8 6,7 ± 4,2 2,9 ± 1,8 6,7 ± 4,3 2,9 ± 1,7
Бетадин, 10% 6,6 ± 4,1 3,7 ± 2,0 6,5 ± 4,1 3,3 ± 1,9 6,7 ± 4,2 3,0 ± 2,0 6,7 ± 4,3 3,2 ± 2,1
Декасан, 0,02% 6,6 ± 4,1 3,7 ± 2,2 6,5 ± 4,1 2,9 ± 1,3 6,7 ± 4,2 3,1 ± 1,6 6,7 ± 4,3 3,2 ± 2,1
Хлоргексидин, 0,05% 6,6 ± 4,1 3,5 ± 1,7 6,5 ± 4,1 2,9 ± 1,3 6,7 ± 4,2 3,0 ± 1,6 6,7 ± 4,3 3,0 ± 2,1
Отже, бактерй у бiоплiвках стiйкiшi до антимжробних препарата, тж !х планктоннi форми. Оскшьки, за даними рiзних автор1в (Iftodij et al., 2014; Ebinger et al., 2017; Stewart et al., 2017; Wienert et al., 2017), хрошчт рани здебшьшого загоююгься упродовж тривалого часу, можна стверджувати, що мжроорга-шзми, що видшяються з цих ран, перебувають у бiоплiвцi та ускладнюють протимiкробну терапiю.
1з метою обгрунтування ефективностi лiкування ХАТ за допомогою внутрiщньотканинного електрофорезу з дожсизо-лем вивчали вплив р!зно! сили струму на деградащю бiоплiвки (табл. 3). За до електрофорезу силою струму 0,05 мА/см2 пло-щi бюплшки, !х щiльнiсгь зменшувалася в середньому в 1,62,0 раза (Р > 0,05). 1з пiдвищенням сили струму до 0,1 мА/см2 плющ щшьтсть бiоплiвки суттево зменшувалася, що вказуе на
руйнування екзошолiсахаридного матриксу. Найсильнша де-градащя бiоплiвки вщбулася в Enterobacter spp.: зменшення вщ-булося у 2,8 раза (Р > 0,05), шорiвняно з контролем. У S. aureus, E. coli та Enterococcus spp. щшьтсть бюгшвок знизилася в 2,42,5 раза (Р > 0,05). Найстiйкiшими до до електрофорезу 0,1 мА/см2 пищ бiоплiвки виявилися бактерй виду P. aeruginosa - щтьнють бiоплiвок зменшилася в 1,9 раза.
Для лжування ХАТ iз метою руйнування мжробно! бю-плiвки та кращого бактерицидного впливу лжарських засобiв проведено гальватзащю з розчином «Дкжсизоль-Дарниця». Результата дослщжень впливу електрофорезу з дiоксизолем за р!зно! сили струму на мжробт бiоплiвки наведено в таблицi 4. У дослщ взято штами бактерш, планктонт форми яких чут-ливi до дiоксизолю у луночковому методо
Таблиця 3
Вплив електрофорезу силою струму 0,05-0,1 мА/см2 пшщ чашки Петра та гривалiстю 60 хвилин на мжробт бiоплiвки (x ± SE; n = 27)
Щiшьнiсть м!КРО6НИХ бiогшiвок
Вид бактерш до дй електрофорезу, од. (контроль) шсля дй електрофорезу силою струму 0,05 мА/см2 площ! бю^вки, од. до дй електрофорезу, од. (контроль) п!сля дй електрофорезу силою струму 0,1 мА/см2 площ! бющивки, од.
P. aeruginosa, n = 4 1,7 ± 0,1 1,1 ± 0,04* 1,8 ± 0,1 0,9 ± 0,04*
S. aureus, n = 3 1,8 ± 0,1 1,0 ± 0,04* 1,7 ± 0,1 0,7 ± 0,03*
E. coli, n = 12 1,4 ± 0,1 0,9 ± 0,05* 1,4 ± 0,1 0,5 ± 0,03*
Enterococcus spp., n = 5 1,8 ± 0,1 1,1 ± 0,03* 1,8 ± 0,1 0,7 ± 0,03*
Enterobacter spp., n = 3 1,3 ± 0,1 0,7 ± 0,04* 1,4 ± 0,1 0,5 ± 0,02*
Примтка: * - Р > 0,05, щодо контолю.
Таблиця 4
Кшькють бактерш у бiопшiвцi до та тюля до електрофорезу з дожсизолем iз рiзною силою струму (lg КУО/см2, x ± SE; n = 27)
Вид бактерiй Кшьккть бактерш на 1 см2 площ! бющивки до електрофорезу Кiшькiсть бактерш шсля ди силою струму 0,025 мА/см2 П^ОЩ! 6!ОП^ВКИ Кшьккть бактерiй шсля ди силою струму 0,05 мА/см2 ГЛОЩ! 6!ОГ^ВКН Кшьюсть бактерш шсля дй силою струму 0,1 мА/см2 глощ! бю^вки
P. aeruginosa, n = 4 6,7 ± 5,2 2,3 ± 1,2* не видшено не видшено
S. aureus, n = 3 6,8 ± 5,3 1,4 ± 0,3* не видшено не видшено
E. coli, n = 12 6,6 ± 5,2 1,5 ± 0,3* не видшено не видшено
Enterococcus spp., n = 5 6,7 ± 5,2 2,2 ± 0,9* не видшено не видшено
Enterobacter spp., n = 3 6,4 ± 5,1 не видшено не видшено не видшено
Примiтка: див. табл. 3.
1з табшицi 4 видно, що застосування електрофорезу з антисептиком дюксидином на мжробт бiоплiвки досигь дiевий. За сили струму 0,05-0,10 мА/см2 пищ бюшпвки бактерiй не видiшено. Це вказуе на руйнування бiоплiвки також добрий контакт дюкси-дину з мжробними кшiтинами та прояв бактерицидно! до.
Обговорення
Нин! достеменно з'ясовано, що хрончт гнiйно-зашашьнi шроцеси спричиняються мжрооргатзмами у бюплгвщ, та тра-дицшна етiотропна антибактерiашьна терашя малоефективна (Penesyan et al., 2015; Banin et al., 2017). Тому науковщ прово-
дят шошук дiевих методiв i засобiв впливу на бактерй у бю-пшiвках !з метою ефективного лiкування зашальних процесiв. Нащi дослщження виявили, що чутшивiсгь планктонних форм бактерш, видшених !з ХАТ, до антибютиюв цефашосшоринiв: цефетм, цефошеразон i цефтазидим становила 71,4-100,0%. Тшьки ентерококи були стшкими до цефтазидиму (чутливють -38,9%). Чутливють видiшених бактерш до гентамшину також була високою (72,4-100,0%), як i до фторхшолонгв (гатифлок-сацину та ципрофлоксацину - 66,7-100,0%). У достдженнях (Hidijatov et al., 2012; Wienert et al., 2017) також вказуеться на високу чутливють (73,4-100,0%) мжрофлори ХАТ до антибю-тикв цефашосшоринiв i амшоглжозидiв. Незважаючи на значну
чутливють планктонних форм бактерш, видшених iз ХАТ, до антибютиюв, не завжди досягаеться позитивний результат шiд час лжування (Castillo and Margolin, 2004; Ebinger et al., 2017; Stewart et al., 2017), оскшьки в шатогенезi ХАТ провщна роль належить бкшвковим формам бактерiй (Iftodij et al., 2014; Ne-dashkivs'ka et al., 2016). Ц дослiдження збкаються з численни-ми даними про необхвдтсть визначення чутливостi мжрофло-ри до антибiотикiв пiд час лжування гншно-запальних про-цесiв. За нашими даними, антисептики менш дiевi на планк-тоннi форми бактерiй, ¿ж антибiотики, що ймовiрно пов'язано з частшим застосуванням !х для мсцевого лжування ХАТ. Чутливiсть планктонних форм бактерш до антисептикв дюк-сидину та бетадину становила 60,0-100,0%, до розчишв окте-нiсепту, декасану та хлоргексидину - 33,7-83,3%.
Пiд час визначеня впливу антибiотикiв i антисептиюв на бiоплiвковi форми бактерiй встановлено, що клiтини у бiоплiв-ц стiйкiшi до антибактерiалъних прешаратiв. 1з дослiджених антибiотикiв найкраще дiяв гатифлоксацин ймовiрно завдяки його низъкiй молекулярной масi та здатностi проникати через пори та канали бiоплiвки до мжробних клiтин. Пiсля дii гати-флоксацину на бiоплiвки P. aeruginosa та E. feacalis кшькють живих клiтин не перевищувала lg 1,5 ± 0,02 КУО/см2 змиву, а клпини S. aureus i E. coli повтстю iнактивованi. Про те, що фторхшолони легко дифундують через бютшвку та ефективно знижують И рют i бактерицидно дiють на мжробт клпини, по-вiдомляють також автори, як проводили дослiди in vitro (Brooun et al., 2000; Stepanovic et al., 2000; Lewis, 2001). Також про тдвищену стшкють бактерiй у бiоплiвцi, видiлених iз хро-нiчних ран, до антибютиюв повщомляють дослiдження iнших авторов (Flemming and Wingender 2010; Sаnchez et al., 2013; Sanchez-Vizuete et al., 2015).
1з дослiджених нами антисептиюв найкраще дiяв на бактери у бiоплiвках «Дюксизоль-Дарнивд» - кшьюсть життездатних мжробних клпин зменшувалася до lg 2,9 ± 1,6 на см2 пло-щi бюптвки. Бар'ерну функцiю екзошолiсахаридного матриксу щодо антисептиюв, зокрема, перекису водню, описано у до-слiдженнях (Elkins et al., 1999; Hassett et al., 1999), яю вказу-ють, що планктонт клiтини гинули за концентраци 50 мкМ, а бактери у бютшвщ ефективно захищенi, оскiлъки доза, яка доходила до клпин бютшвки, була нижчою бактерицидного рiвня. Це дае змогу стверджувати, що саме здатнють бактерш, видшених зi слизово! оболонки ХАТ, формувати бютшвку ви-соко! щiлъностi ускладнюе ефективнють шротимiкробноi тера-шii хвороби та визначае хрончний характер ii перебну. Тому, з метою обгрунтування ефективносп лжування ХАТ за допомо-гою внутршньотканинного електрофорезу з дiоксизолем, ми вивчали вплив рiзноl сили струму на бактери у бюпшвках i деградацiю бiоплiвки.
За до електрофорезу силою струму 0,025-0,100 мА/см2 пищ вщбулося руйнування матриксу бiоплiвки та його щ^нють зменшувалася з високо! до низько!. Однак за до сили струму 0,025 мА/см2 птещ бiоплiвки та дюксидину ще видшялися життездатнi клiтини з бiоплiвки, що вказуе на часткове руйнування матриксу. Шдвищення сили струму до 0,05-0,10 мА/см2 площ бiоплiвки спричиняло загибель клiтин бактерш. Деградация матриксу бiоплiвки електрофорезом позбавляе мжробт клпини захисту, а застосування препарату «Дкжсизоль-Дар-ниця» забезпечуе бактерицидний ефект. Del Pozo et al. (2009) також вказують на ефективнiсть i шерсшективнiсть використання фiзичних методов для боротьби з бактерiями, як перебувають у бiоплiвцi. Електричнi поля низько! напруги пгдвищували ефек-тивнiсть антисептикв, !х бактерицидна концентраца на бюпшв-ковi форми бактерш нижча, нж мiнiмалъна бактерицидна кон-центрацiя для планктонних форм. Дослщники (Huang et al., 1996) продемонстрували ефективнiсть ультразвуку щодо бюпль вок P. aeruginosa - обробка пгдвищувала дю гентамшину вщ-носно тих самих бюпшвок. Таким чином, лабораторнi мжробю-лопчт дослiдження вказують, що використання електрофорезу з дюксизолем для лiкування ХАТ перспективне та актуальне.
BHCHOBKH
13 XAT BHginaroTbca yM0BH0-naT0reHHi 6aKTepii, nnaHKToHHi $opMH aKHx ^ymnBi go aHTHÖioTHKiB ne^anocnopHHiB III-IV no-Konimia Ta ^TopxiHonoHiB (66,7-100,0%). ^ymnBicTb niei MiK-po^nopH go aHTHcenTHKiB gioKcngnHy Ta 6eragnHy craHoBHna 60,0-100,0%, a go aHTHcenTHKiB oKTHHicerny, geKacaHy Ta xnop-reKcngHHy - 33,7-83,3%. EionniBKoBi 4>opMH öaKTepift, BHgineHi 3 XAT, cTTHKimi go aHTHÖioTHKiB i aHTHcenTHKiB, Hi® ix nraHKToHHi ^opMH. 13 gocnigxeHHx aHTHÖioTHKiB HaflKpa^e giaB Ha 6aKTepii y öionniBKax raTH^roKcannH, nicna floro BnrHBy Ha 6ionniBKH P. aeruginosa Ta E. feacalis KmbKicn> KriTHH He nepe-BnrnyBana lg 1,5 ± 0,02 KyO/cM2 3MHBy, a 6aKTepii S. aureus i E. coli noBHiciro iHaKTHBoBaHi. I3 n'aTH gocnigxeHHx aHTHcenTHKiB Hafle^eKTHBHime giaB Ha 6aKTepii y 6ionniBni gioKcngHH. nicra floro BnrHBy KirbKicit MiKpoÖHHx kuhhh He nepeBH^yBana lg 2,9 ± 1,7 KyO/cM2 nno^i 6ionniBKH.
3a gii eneKTpo^ope3y cHnoro cTpyMy 0,05 mA/cm2 rno^i Öio-nriBKH ix ^inbHicTb 3MeHmyBanaca b cepegm>oMy b 1,6-2,0 pa3a, a 3a gii cHnoro 0,1 mA/cm2 nno^i b 2,4-2,8 pa3a, ^o BKa3ye Ha 3HaMHy gerpaganiro öionniBKH. 3aBgaKH 3acTocyBaHHro eneKTpo-$ope3y cHnoro cTpyMy 0,05-0,10 mA/cm2 nno^i ÖionniBKH 3 gi-oKcHgHHoM BigöyBaeitca pyflHyBaHHa ÖionniBKH Ta npoaB öaKie-pHnHgHoi gii aHTHcenTHKa. BpaxoByronn oTpHMaHi gaHi, y KoMn-neKcHoMy niKyBaHHi XAT peKoMeHgoBaHo npoBogHTH BHyTpim-HLoTKaHHHHnfl eneKTpo^ope3 cHnoro cTpyMy 0,05-0,10 mA/cm2 3 aHTHcenTHKoM i npn3HaHaTH aHTn6aKTepianbHy Tepaniro, none-pegHbo BH3HaMHBmH ^yTnnBicTb go aHTHÖioTHKiB i aHTHcenTHKiB, BHgineHHx i3 Tpi^HHH MjKpoopraHi3MiB.
References
Atkinson, S., & Williams, P. (2009). Quorum sensing and social networking in the
microbial world. Journal of the Royal Society Interface, 6, 959-978. Banin, E., Hughes, D., & Kuipers, O. P. (2017). Bacterial pathogens, antibiotics
and antibiotic resistance. FEMS Microbiology Reviews, 41(3), 450-452. Bessa, L. J., Fazii, P., Di Giulio, M., & Cellini, L. (2015). Bacterial isolates from infected wounds and their antibiotic susceptibility pattern: Some remarks about wound infection. International Wound Journal, 12(1), 47-52. Brooun, A., Liu, S., & Lewis, K. (2000). A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 44(3), 640-646. Castillo, E., & Margolin, D. A. (2004). Anal fissures: Diagnosis and management.
Techniques in Gastrointestinal Endoscopy, 6(1), 12-16. Cooper, R. A., Bjarnsholt, T., & Alhede, M. (2014). Biofilms in wounds: A
review of present knowledge. Journal of Wound Care, 23(11), 570-582. Cucarella, C., Tormo, M. A., Ubeda, C., Trotonda, M. P., Monzon, M., Peris, C., Amorena, B., Lasa, I., & Penades, J. R. (2004). Role of biofilm-associated protein bap in the pathogenesis of bovine Staphylococcus aureus. Infection and Immunity, 72(4), 2177-2185. Del Pozo, J. L., Rouse, M. S., Mandrekar, J. N., Sampedro, M. F., Steckelberg, J. M., & Patel, R. (2009). Effect of electrical current on the activities of antimicrobial agents against Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Staphylococcus epidermidis biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 53(1), 35-40. Ebinger, S. M., Hardt, J., Warschkow, R., Schmied, B. M., Herold, A., Post, S., & Marti, L. (2017). Operative and medical treatment of chronic anal fissures -A review and network meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of Gastroenterology, 52(6), 663-676. Elkins, J. G., Hassett, D. J., Stewart, P. S., Schweizer, H. P., & McDermott, T. R. (1999). Protective role of catalase in Pseudomonas aeruginosa biofilm resistance to hydrogen peroxide. Applied and Environmental Microbiology, 65(10), 4594-4600.
Flemming, H. C., & Wingender, J. (2010). The biofilm matrix. Nature Reviews
Microbiology, 8(9), 623-633. Fuente-Nunez, C., Reffuveille, F., Fernandez, L., & Hancock, R. E. (2013). Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: Antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology, 16(5), 580-589.
Gostev, V. V., & Sidorenko, S. V. (2010). Bakterial'nye bioplenki i infekcii [Bacterial biofilms and infections]. Zhurnal Infektologii, 2(3), 4-15 (in Russian). Hall-Stoodley, L., & Stoodley, P. (2009). Evolving concepts in biofilm infections. Cellular Microbiology, 11(7), 1034-1043.
Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., & Stoodley, P. (2004). Bacterial biofilms: From tie natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology, 2(2), 95-108.
Hassett, D. J., Ma, J. F., Elkins, J. G., McDermott, T. R., Ochsner, U. A., West, S. E., Huang, C. T., Fredericks, J., Burnett, S., Stewart, P. S., McFeters, G., Passador, L., & Iglewski, B. H. (1999). Quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa controls expression of catalase and superoxide dismutase genes and mediates biofilm susceptibility to hydrogen peroxide. Molecular Microbiology, 34(5), 1082-1093.
Hidijatov, I. I., Adiev, R. F., Strizhkov, A. E., Kazakov, M. V., & Nurimanov, R. Z. (2012). Rezul'taty kompleksnogo obsledovanija i hirurgicheskogo lechenija bol'nyh s hronicheskoj anal'noj treshhinoj [The results of complex examination and surgical treatment of patients with chronic anal fissure]. Astrahan-skij Medicinskij Zhurnal, 7(4), 256-259 (in Russian).
Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., & Ciofu, O. (2010). Antibiotic resistance of bacterial biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents, 35(4), 322-332.
Huang, C. T., James, G., Pitt, W. G., & Stewart, P. S. (1996). Effects of ultrasonic treatment on the efficacy of gentamicin against established Pseudomonas ae-ruginosa biofilms. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 6(4-5), 235-242.
ftodij, A. G., Kozlovska, I. M., Olenovich, O. A., Bilik, O. V., & Brodovskij S. P. (2014). Vpliv mikroflori kishechniku na patogenez perebigu hronichnih us-kladnenih anal'nih trishhin [Influence of intestinal microflora on 1he pathogenesis of chronic complicated anal fissures]. Bukovinskij Medichnij Visnik, 18(3), 78-82 (in Ukrainian).
Kukhtyn, M., Berhilevych, O., Kravcheniuk, K., Shynkaruk, O., Horyuk, Y., & Semaniuk, N. (2017). Formation of biofilms on dairy equipment and the influence of disinfectants on them. Eastern-European Journal of Enterprise Technologies, 5(11), 26-33.
Kukhtyn, M., Berhilevych, O., Kravcheniuk, K., Shynkaruk, O., Horyuk, Y., & Semaniuk, N. (2017). The influence of disinfectants on microbial biofilms of dairy equipment. Eureka: Life Sciences, 5, 11-17.
Lewis, K. (2001). Riddle of biofilm resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45(4), 999-1007.
Mah, T. F. C., & O'Toole, G. A. (2001). Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in Microbiology, 9(1), 34-39.
Manavathu, E. K., Vager, D. L., & Vazquez, J. A. (2014). Development and antimicrobial susceptibility studies of in vitro monomicrobial and polymicrobial biofilm models with Aspergillus fumigatus and Pseudomonas aeruginosa. BMC Microbiology, 14(1), 53.
Nedashkivska, V. V., Dronova, M. L., & Vrinchanu, N. O. (2016). Bioplivki ta jih rol' v infekcijnyh zahvorjuvanniah [Biofilms and their role in infectious diseases]. Ukrajins'kij Naukovo-Medychnij Molodizhnyj Zhurnal, 98, 10-19 (in Ukrainian).
Penesyan, A., Gillings, M., & Paulsen, I. T. (2015). Antibiotic discovery: Combatting bacterial resistance in cells and in biofilm communities. Molecules, 20(4), 5286-5298.
Percival, S. L., Hill, K. E., Williams, D. W., Hooper, S. J., Thomas, D. W., & Cos-terton, J. W. (2012). A review of the scientific evidence for biofilms in wounds. Wound Repair and Regeneration, 20(5), 647-657.
Sanchez, C. J., Mende, K., Beckius, M. L., Akers, K. S., Romano, D. R., Wenke, J. C., & Murray, C. K. (2013). Biofilm formation by clinical isolates and the implications in chronic infections. BMC Infectious Diseases, 13(1), 47.
Sanchez-Vizuete, P., Orgaz, B., Aymerich, S., Le Coq, D., & Briandet, R. (2015). Pathogens protection against the action of disinfectants in multispecies biofilms. Frontiers in Microbiology, 6, 1-12.
Soto, S. M. (2013). Role of efflux pumps in the antibiotic resistance of bacteria embedded in a biofilm. Virulence, 4(3), 223-229.
Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., & Svabic-Vlahovic, M. (2000). A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. Journal of Microbiological Methods, 40(2), 175-179.
Stewart Sr, D. B., Gaertner, W., Glasgow, S., Migaly, J., Feingold, D., & Steele, S. R. (2017). Clinical practice guideline for the management of anal fissures. Diseases of the Colon and Rectum, 60(1), 7-14.
Van Acker, H., Van Dijck, P., & Coenye, T. (2014). Molecular mechanisms of antimicrobial tolerance and resistance in bacterial and fungal biofilms. Trends in Microbiology, 22(6), 326-333.
Vorobey, E. S., Voronkova, O. S., & Vinnikov, A. I. (2017). Korekcija dysbiozu pihvy myshej, vyklykanogo plivkotvirnym shtamom Staphylococcus aureus, za dopomogoju bakteriofagiv i probiotykiv [Correction of vaginal dysbiosis in mice caused by a filmforming strain Staphylococcus aureus, using bacteriophages and probiotics]. Regulatory Mechanisms in Biosystems, 8(2), 252-258 (in Ukrainian).
Vos, P., Garrity, G., Jones, D., Krieg, N. R., Ludwig, W., Rainey, F. A., & Whitman, W. (Eds.). (2011). Bergey's manual of systematic bacteriology. Vol. 3: The Firmicutes. Springer Science & Business Media.
Weigel, L. M., Donlan, R. M., Shin, D. H., Jensen, B., Clark, N. C., McDougal, L. K., Zhu, W., Musser, K. A., Thompson, J., Kohlerschmidt, D., Dumas, N., Limberger, R. J., & Patel, J. B. (2007). High-level vancomycin-resistant Staphylococcus aureus isolates associated with a polymicrobial biofilm. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 51(1), 231-238.
Wienert, V., Raulf, F., & Mlitz, H. (2017). Anal fissure: Symptoms, diagnosis and therapies. Springer.
Zhao, G., Usui, M. L., Lippman, S. I., James, G. A., Stewart, P. S., Fleckman, P., & Olerud, J. E. (2013). Biofilms and inflammation in chronic wounds. Advances in Wound Care, 2(7), 389-399.
