CC BY
13
146
ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 16. БИОЛОГИЯ. 2019. Т. 74. № 2. С. 146-150.
КРАТКОЕ СООБЩЕНИЕ
УДК 61:577.152.344
ВОЗМОЖНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ПРОТЕАЗЫ МИКРОМИЦЕТА ASPERGILLUS OCHRACEUS ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФАКТОРА X В ПЛАЗМЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
А.В. Орехова1, А.А. Осмоловский1*, В.Г. Крейер1, Н.А. Баранова1, Н.С. Егоров2
Кафедра микробиологии, биологический факультет и 2Международный биотехнологический центр, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Россия, 119234, г.
Москва, ул. Ленинские горы д. 1, стр. 12 *e-mail: aosmol@mail.ru
Показано, что активность фактора X, определенная в нормальной плазме с помощью протеазы Aspergillus ochraceus, сравнима с активностью, оцениваемой при использовании коммерческого аналога — протеазы из яда гадюки Рассела (препарат RVV-X®). Выявлено, что протеаза A. ochraceus наряду с препаратом RVV-X® может быть применена для определения концентрации фактора X в плазме с его пониженным содержанием. Исследование активаторной по отношению к фактору X активности протеазы A ochraceus показало, что она несколько выше по сравнению с активностью препарата из яда змеи. Это может сделать протеазу A. ochraceus перспективным заменителем змеиного активатора в диагностикумах для определения содержания фактора X.
Ключевые слова: протеолитические ферменты, активаторы фактора X, диагностика фактора X, препарат RVV-X®, протеазы аспергиллов, патологическая плазма
Фактор X — сериновая эндопротеаза, играющая одну из ключевых ролей в системе гемостаза. В процессе свертывания крови активированный фактор X является одним из компонентов протромбиназы, превращающей протромбин в тромбин [1]. При дефиците фактора X возникают экхимозы, петехиальные кровоизлияния, гематомы, продолжительные кровотечения из слизистых оболочек пищеварительного тракта [2]. В связи с этим стоит необходимость длительного мониторинга концентрации фактора X в плазме крови. Кроме того, динамический контроль уровня фактора X необходим при лечении низкомолекулярными гепаринами тромбоэмболических осложнений, инфарктов и инсультов [3].
Для проведения диагностики содержания фактора X в кровотоке используют специфическую протеазу из яда гадюки Рассела БаЬо1а гшявПи [4]. На ее основе был разработан препарат КУУ^® («РеПарЬагт», Швейцария). Инкубация фактора X с протеазой-активатором из яда Б. гиззвПи приводит в результате ограниченного протеолиза к превращению фактора X в его активную форму — активированный фактор X, который расщепляет специфический хромогенный пептидный субстрат Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA (8-2765) по связи
аргинил-и-нитроанилид. Концентрация отщепившегося в результате реакции и-нитроанили-на (pNA) прямо пропорциональна концентрации фактора X в образце [4].
Исследования последних лет показывают, что в качестве активаторов проферментов системы гемостаза, альтернативных змеиным, могут быть использованы протеазы, образуемые микромице-тами [5]. Так, внеклеточные протеазы Aspergillus ochraceus могут активировать протеин C плазмы крови человека аналогично протеазе южноамериканского щитомордника, используемой в диагностике этого белка. Данные протеазы сопоставимы по активности и сходны по ряду свойств [6]. Наряду с активностью по отношению к протеину C, протеазы микромицета A. ochraceus обладают и активаторной по отношению к фактору X активностью, поэтому большой интерес представляет выявление возможности их применения для определения содержания фактора X в плазме крови наряду с протеазой препарата RVV-X®. Поскольку к настоящему времени неактивный ре-комбинантный фермент из яда гадюки получить не удалось, использование альтернативного фермента-активатора фактора X представляется весьма перспективным.
Материалы и методы
В исследовании были использованы протеазы с активаторной по отношению к фактору X активностью из культуральной жидкости микромицета А. оскгасвш ВКМ Б- 4104 (получены на кафедре микробиологии МГУ имени М.В. Ломоносова) и препарата из яда гадюки Рассела КУУ-Х® («РеМарИагт», Швейцария), а также лиофилизи-рованная плазма крови человека с различными характеристиками (НПО «Ренам», Россия): плазма с параметрами системы гемостаза в пределах нормы, плазма крови человека с искусственно сниженными параметрами системы гемостаза и плазма крови человека, дефицитная по фактору X.
Получение внеклеточной протеазы продуцента.
Получение протеазы А. оскгасвш осуществляли в несколько этапов. Сначала проводили осаждение белков из культуральной жидкости сульфатом аммония до 80%-ной степени насыщения на холоду (4°С, 24 ч) с дальнейшим их отделением центрифугированием (15000 4°С, 25 мин) [7]. Затем полученный осадок внеклеточных ферментов перерастворяли в минимальном объеме 0,005М Трис-НС1 буфера (рН 8,2) и диализовали против этого же буфера (4°С, 12 ч). Полученный раствор белков центрифугировали при тех же условиях для удаления нерастворимой части осадка. Далее белки супернатанта подвергали изоэлектрофокусирова-нию в колонке объемом 110 мл («ЬКВ», Швеция) в градиенте плотности сахарозы 0—40% по методу Вестерберга (800 В, 4°С, 36 ч), используя амфо-лины фирмы «ЬКВ» (Швеция) с рН 4—9. Содержимое колонки собирали по фракциям объемом 1,5 мл с помощью коллектора фракций («ЬКВ», Швеция). Фракции с р1 5,7—6,2, содержащие искомую протеазу, были отобраны для дальнейшей работы [8]. С целью подтверждения гомогенности выделенного белка был проведен денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле по методу Лэммли. Очистку протеаз от амфолинов и одновременное концентрирование фракции проводили в мембранных концентраторах М1сгосоп иИгасе1 30 для эппендорфов («МПИроге», США) в соответствии с инструкцией: 500 мкл фракции переносили в мембранные концентраторы и центрифугировали (12400 10 мин). Далее супернатант сливали, а ретентат собирали в новый эппендорф и повторно центрифугировали (1000 1 мин) [6]. В пробе проводили определение белка и актива-торной по отношению к фактору X активности.
Определение белка. Концентрацию белка определяли по поглощению при 280 нм. Раствор белка, имеющий поглощение при данной длине волны в кювете с длиной пути 1 см, равное 1,00, содержал в 1 мл одну оптическую единицу (о.е., А280) [9].
Определение ферментативной активности.
Активность активатора фактора X определяли, проводя прединкубацию 200 мкл пробы белка A. ochraceus или RVV-X® с 50 мкл разведенной в два раза 0,05 М Трис-HCl буфером (рН 8,2) соответствующей плазмы крови в течение 5 мин на термошейкере BioSan TS-100 (Латвия) при температуре 37±0,1°С. Через 5 мин в смесь вносили 100 мкл хромогенного субстрата Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA (S-2765) и продолжали инкубацию еще в течение 5 мин. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл 50%-ной уксусной кислоты. Количество высвободившегося я-нитроанилина измеряли на спектрофотометре «Hitachi 200-20» (Япония) при длине волны 405 нм [10]. За единицу активности (Е) принимали количество мкмоль отщепившегося за 1 мин я-нитроанилина в 1 мл пробы.
Построение калибровочных кривых для определения содержания фактора X в плазме строили в соответствии с протоколом подготовки к работе препарата RVV-X® («Pentapharm», Швейцария).
Эксперименты выполнены в 3 повторностях, полученные результаты приведены как средние величины из трех опытов, для каждой величины даны доверительные интервалы. Статистическую обработку проводили с помощью пакета MS Excel 2013.
Результаты и их обсуждение
Внеклеточная протеаза A. ochraceus является потенциальным компонентом диагностикумов для определения концентрации фактора X. Была проведена сравнительная характеристика актива-торной по отношению к фактору X активности протеазы, выделенной из культуральной жидкости, лиофилизированного препарата и препарата после изоэлектрофокусирования, которая показа-
250
200
а 100 Ш
50
0 - -
Протеаза А. осЬгасеиэ К V V X®1
Рис. 1. Удельная активаторная по отношению к фактору X активность протеазы А. оскгасвш и препарата RVV-X®.
ла (табл. 1), что удельная активаторная активность протеазы после изоэлектрофокусирования в 15,7 раз выше, чем у протеазы, полученной методом лиофилизации, и в 40 раз выше, чем в культураль-ной жидкости продуцента. Далее производили
сравнение активности выделенного фермента по отношению к фактору X с активностью протеазы из яда змеи, входящей в состав препарата RVV-X® (рис. 1). Видно, что удельная активность протеазы A. ochraceus сопоставима с данным показателем
стандартная кривая (А), полученная при использовании в качестве активного компонента диагностического набора препарата RVV-X®, по которой проводят клиническое определение содержания X фактора в плазме крови. График Б на рис. 2 полу-
Таблица 1
Содержание белка и активаторная по отношению к фактору Х активность протеазы Aspergillus ochraceus в культуральной жидкости, лиофилизированном препарате и фракциях после изоэлектрофокусирования
Параметр Культуральная жидкость Лиофилизированный препарат Активная фракция после изоэлектрофоку-сирова-ния
Белок, мкг/мл 1,46+0,10 1,08+0,10 0,31+0,10
Активаторная активность по отношению к фактору Х, Е *10-3 10,7+1,20 20,1 + 1,20 90,4+1,20
Удельная активаторная активность, (Е/мкг белка) х10-3 7,3+1,20 18,6+1,20 291,6+1,20
для змеиного активатора.
С целью проверки возможности применения протеазы A. ochraceus для диагностики фактора X в плазме были построены калибровочные графики с использованием лиофилизированной плазмы крови человека с параметрами системы гемостаза в пределах нормы в различных разведениях, что предписывается существующими протоколами имеющихся диагностикумов. На рис. 2 показана
Рис. 2. Калибровочная кривая с лиофилизированной плазмой крови человека с параметрами системы гемостаза в пределах нормы, полученная с помощью препарата RVV-X® (А) и протеазы A. ochraceus (Б).
чен с использованием в качестве активного компонента протеазы A. ochraceus. Данный график также линеен, но отличается от калибровочного с использованием RVV-X® по своему уравнению. Показано, что активаторная к фактору X активность протеазы A. ochraceus имеет концентраци-онно-зависимый характер.
Следующий этап исследования заключался в проверке применимости построенных калибровочных графиков для выявления содержания фактора X путем проведения соответствующих реакций с плазмами с искусственно сниженным содержанием этого компонента или дефицитных по нему.
Данные по определению активаторной по отношению к фактору X активности протеа-зы A. ochraceus с плазмами крови с разным содержанием фактора X в сравнении с препаратом RVV-X® представлены в табл. 2. Активаторная активность протеазы A. ochraceus сопоставима с активностью к фактору X, определяемой с помощью препарата RVV-X®. Уровень содержания фактора X в использованных плазмах крови (в соответствии с их паспортами) достоверно определяется с помощью как протеазы из яда змеи, так и протеазы A. ochraceus (табл. 2). Полученные данные свидетельствуют о том, что протеаза микромицета может быть применима в составе диагностического набора для определения содержания фактора X в плазме крови пациентов.
Таким образом, активность фактора X, определенная в нормальной плазме по стандартной методике с использованием протеазы A. ochraceus, сопоставима с этим показателем, оцениваемым с помощью коммерческого аналога — препарата RVV-X®. Протеаза A. ochraceus может быть использована для определения X фактора в плаз-
Таблица 2
Активаторная по отношению к фактору Х активность коммерческого диагностикума и протеазы Aspergillus ochraceus, определяемая с плазмами со сниженными параметрами системы гемостаза
Тип плазмы Содержание X фактора, %
В соответствии с паспортом Активатор Х фактора (RVV-X®) Протеаза Aspergillus ochraceus
Нормальная плазма 95 ± 10 95 ± 9 95 ±12
Плазма патологическая (с искусственно сниженными параметрами системы гемостаза) 38 ± 4 36,6 ± 4 37,4 ± 4
Плазма крови человека, дефицитная по факторам II, VII, X Менее 1% Менее 1% Менее 1%
мах с его пониженным содержанием аналогично препарату RVV-X®. Препарат протеаз A. ochraceus может быть рекомендован в качестве нового диагностикума в клинических лабораториях для мониторинга фактора X в плазме крови.
Работа выполнена при поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприя-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Girolami A., Molaro G, De Marco L. Factor X survival and therapeutic factor X levels in the abnormal factor X (factor X Friuli) coagulation disorder // Acta Haematol. 1974. Vol. 52. N 4. P. 223-231.
2. Chatterjee T, Philip J., Nair V., Mallhi R. S, Sharma H, Ganguly P, Biswas A.K. Inherited factor X (Stuart-Prower factor) deficiency and its management // Med. J. Armed Forces India. 2015. Vol. 71. Suppl. 1. P. S184-S186.
3. Tsevrenis H, Mandalaki T, Symvoulidis A., Philips H. Fluctuations and relations of the Quick time and the heparin tolerance test and the X factor during anticoagulant treatment with coumarins // Arch. Inst. Pasteur Hell. 1961. Vol. 7. P. 49-58.
4. Sajevic T, Leonardi A, KrizajI. Haemostatically active proteins in snake venoms // Toxicon. 2011. Vol. 57. N 5. P. 627-645.
5. Бобровская А. А., Осмоловский А. А., Звона-рева Е. С., Крейер В. Г., Кураков АВ. Протеиназы микромицетов с активностями ферментов системы гемостаза человека // Усп. мед. микол. 2015. Т. 14. № 14. С. 414-416.
6. Osmolovskiy AA., Orekhova A.V., Kreyer V.G., Baranova N.A., Egorov N.S. Possibility of application of extracellular proteases of the micromycete Aspergillus ochraceus VKM F-4104D for determination of the
тий в научно-технической сфере (Соглашение № 9107ГУ/2015).
Исследования выполнены без использования животных и без привлечения людей в качестве испытуемых. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
protein C content in human blood plasma // Biochem. (Moscow) Suppl. Ser. B. Biomed. Chem. 2018. Vol. 12. N 2. P. 164-166.
7. Osmolovsky A.A., Kreier V.G, Baranova N.A., Kurakov A.V., Egorov N.S. Production of extracellular proteinases — protein C activators of blood plasma — by the micromycete Aspergillus ochraceus during submerged and solid-state fermentation // Appl. Biochem. Microbiol. 2013. Vol. 49. N 6. P. 581—586.
8. Barranco-Medina S., Murphy M., Pelc L, Chen Z, Di Cera E, Pozzi N. Rational design of protein C activators // Sci. Rep. 2017. Vol. 7: 44596.
9. Gertler A., Trop M. The elastase-like enzymes from Strep tomyces griseus (pronase). Isolation and partial characterization // Eur. J. Biochem. 1971. Vol. 19. N 1. P. 90—96.
10. Osmolovskiy A.A., Kreier V.G., Kurakov A.V., Baranova N.A., Egorov N.S. Aspergillus ochraceus micromycetes — producers of extracellular proteinases — protein C activators of blood plasma // Appl. Biochem. Microbiol. 2012. Vol. 48. N 5. P. 488—492.
Поступила в редакцию 11.02.2019 г. После доработки 07.04.2019 г. Принята в печать 15.04.2019 г.
SHORT COMMUNICATION
POSSIBILITY OF APPLICATION OF EXTRACELLULAR PROTEASE OF MICROMYCET ASPERGILLUS OCHRACEUS FOR DETERMINATION OF FACTOR X CONTENT IN HUMAN BLOOD PLASMA
A.V. Orekhova1, A.A. Osmolovskiy1*, V.G. Kreyer1, N.A. Baranova1, N.S. Egorov2
Biological Faculty and 2International Biotechnology Center, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1—12, Moscow, 119234, Russia *e-mail: aosmol@mail.ru
It has been shown that activity of factor X activity determined in normal plasma using Aspergillus ochraceus protease is comparable with the activity of a commercial analogue, a protease from Russell's viper venom (RVV-X®). It was revealed that the protease of A. ochraceus along with the RVV-X® preparation can be used to determine the content of factor X in the plasma with its reduced content. A study of the protease activity of A. ochraceus, an activator to factor X, showed that it is slightly higher compared to the snake venom preparation, which can make A. ochraceus protease a promising substitute for the snake activator in diagnostics for determining the content of factor X.
Keywords: proteolytic enzymes, activators of factor X, diagnostics of factor X, RVV-X®, aspergilli protease, pathological plasma
Сведения об авторах
Орехова Анастасия Владимировна — вед. инженер кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: stasya77@list.ru
Осмоловский Александр Андреевич — канд. биол. наук, ст. преп. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: aosmol@mail.ru
Крейер Валериана Георгиевна — канд. биол. наук, науч. сотр. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: vkreyer@yandex.ru
Баранова Нина Андреевна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: vkreyer@yandex.ru
Егоров Николай Сергеевич — докт. биол. наук, проф. Международного биотехнологического центра МГУ. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: nsegorov21@mail.ru
