Влияние вируса Эпштейна-Барр на иммунные показатели синовиальной жидкости при ревматоидном артрите Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013

УДК:616.72-002.77-039:578.825.13]-07:616.72-008.8-078.33

В.В.Киреев, А.К. Джапаров, Д.А. Мусаходжаева

ВЛИЯНИЕ ВИРУСА ЭПШТЕЙНА-БАРР НА ИММУННЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ

синовиальной жидкости при ревматоидном артрите

Институт иммунологии АН РУз, 700060, г. Ташкент, Республика Узбекистан

В данной работе показано, что в инфицированной синовиальной жидкости (СЖ) вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) у больных ревматоидным артритом (Ра) повышено относительное количество CD8+, CD16+ и CD20+ по сравнению с аналогичными показателями неинфицированной СЖ и нормой. А в неинфицированной ВЭБ СЖ у больных РА повышено относительное количество CD25+, CD95+, CDHLADR+ и уровень циркулирующих иммунных комплексов. Относительный уровень CD3+, CD4+, IgA, IglVI и IgG и степень снижения комплексов ФАН существенно не отличаются между собой в инфицированной и неинфицированной ВЭБ СЖ.

Ключевые слова: ревматоидный артрит, вирус Эпштейна-Барр, синовиальная жидкость, иммунофенотипы лимфоцитов, иммуноглобулины

V.V. Kireev, A.K. Japarov, D.A. Musahojaeva

POWER OF A VIRUS EPSTEIN-BARR ON IMMUNE INDICATORS SYNOVIAL FLUID BY RHEUMATOID ARTHRITIS

In this study has been shown in infected synovial fluid (SF) of virus Epstein-Barr (VEB) by patients of rheumatoid arthritis (RA) relative indicators CD8+, CD16+ and CD20+ are increase with comparison in similar indicators not infected SF of VEB and control indicators. In not infected SF of VEB by patients of RA relative indications CD25+, CD95+, CDHLADR+ and CIC level with comparison in similar indicators infected SF of VEB and control indicators. Relative indicators CD3+, CD4+, level of immunoglobulin's A, M and G and degree of decrease the FAN essentially do not differ among themselves in infected and not infected VEB SF.

Key words: rheumatoid arthritis, synovial fluid, virus Epstein-Barr, immunophenotypes of lymphocytes, immunoglobulin’s

До настоящего времени этиология ревматоидного артрита (РА) окончательно не установлена и важное значение придается вирусам, в частности вирусу Эпштейна-Барр (ВЭБ). Имеется достаточно много данных, посвященных обнаружению антител (АТ) к ВЭБ и самого вируса в мононуклеарах периферической крови и синовиальной жидкости (СЖ) у больных РА. Роль ВЭБ в развитии РА исследователи обсуждают в течение нескольких последних лет [12, 16]. Однако пока нет убедительных данных, подтверждающих этиологическую значимость ВЭБ при РА. Считают, что хроническое воспаление в синовиальной оболочке при РА может быть связано с нарушением иммунной регуляции, обусловленной ВЭБ и продуцируемых ими вирусных антигенов.

В основе патологического процесса при РА лежит системное аутоиммунное воспаление, более всего затрагивающее синовиальную оболочку [11, 20, 21] суставов, вследствие чего происходят изменения в СЖ [4, 10, 12, 13]. Поэтому особое место занимает изучение уровня СЖ при РА. В норме во всех суставах имеется небольшое количество СЖ - от 0,2 до 2 мл. Но при РА в суставах может образовываться СЖ в количестве до 100 мл и более, отражая активность воспалительного процесса, протекающего в суставном хряще и синовиальной оболочке. В современных руководствах по лабораторной диагностике СЖ описывается крайне скупо и главным образом клинически. Изучение уровня СЖ привлекает внимание исследователей, так как позволяет получать информацию о патологических процессах напрямую в самом суставе. Но работ, посвященных изучению уровня СЖ при различных заболеваниях, в том числе при РА, немного, поскольку изучение этого вопроса весьма затруднено в связи с относительной редкостью суставного выпота и техническими трудностями при его получении. Обычно приводимое количество исследований уровня СЖ в работах не превышает 20 [1, 3, 5-7, 9, 10]. Между тем изучение клеточного состава СЖ позволяет определить степень активности местного суставного процесса, проводить дифференциальную диагностику и прогнозировать заболевание.

Изучение количества субпопуляций лимфоцитов в СЖ у здоровых людей современными методами практически не-

возможно из-за трудности получения СЖ в объеме, достаточном для исследования. Встречаются лишь единичные работы, посвященные определению вирусов в СЖ при РА [15, 16]. В связи с этим выявление ВЭБ в СЖ и его влияние на состав иммунофенотипов лимфоцитов СЖ требует дальнейшего изучения.

Цель нашего исследования - изучение влияния ВЭБ на иммунологические показатели в СЖ у больных РА.

Материалы и методы. Обследованы 22 образца СЖ, полученной в асептических условиях путем пункции коленного сустава у больных РА, имевших II-III степень активности заболевания. Диагноз РА устанавливали согласно критериям Американской ревматологической ассоциации 1987 г. и рабочей классификации, предложенной Ассоциацией ревматологов России (2003). ВЭБ в СЖ выявляли методом полимеразно-цепной реакции. Иммунологические исследования проводили, изучая количество лимфоцитов с фенотипом CD3, CD4, CD8, СD16, CD20, CD25, CD95, CDHLADR с помощью моноклональных АТ серии LT (ТОО «Сорбент», Россия). Содержание иммуноглобулинов определяли методом радиальной иммунодиффузии по Манчини с применением моноспецифических антисывороток против IgA, IgG, IgM. Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли по методу Naskova и соавт., используя тест-набор ташкентского предприятия «Нихол».

В настоящее время изучение количества субпопуляций Т-лимфоцитов в СЖ у здоровых людей современными методами практически невозможно. Это связано с малым количеством СЖ в полости сустава здорового человека (не более 2 мл даже в самом крупном - коленном суставе, которая равномерно распределена по всей суставной полости) и ее высокой вязкостью, что исключает ее аспирацию у здорового человека. Поэтому исследователи вынуждены сравнивать полученные данные либо с показателями периферической крови здоровых лиц, либо с показателями крови при данном заболевании, или же с уровнем СЖ при других заболеваниях, сопровождающихся синовиальным выпотом (остеоартрит с реактивным синовитом, системная красная волчанка, реактивные артриты, анкилозирующий спондилоартрит), что

- 265 -

ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2013

Таблица 1

Теоретические нормативы содержания субпопуляций лимфоцитов в сЖ (математический расчет)

Показатель СЖ Периферическая кровь

Лимфоциты, % 0,77 30,1 ± 1,1

Лимфоциты, абс. 16 2043 ± 147

CD3+, % 0,48 57,5 ± 1,6

CD3+, абс. 10 1189± 89

CD20+, % 0,3 22,3 ± 0,6

CD20+, абс. 6 449 ± 37

CD4+, % 0,48 36,2 ± 1,03

CD4+, абс. 10 752 ± 61

CD8+, % 0,48 22,4 ± 1,2

CD8+, абс. 6 475 ± 42

CD16+, % 0,16 11,9 ± 0,8

CD16+, абс. 3-4 286 ± 27

CD25+, % 0,27 20,1 ± 0,7

CD95+, % 0,37 28 ± 1,1

CDHLADR+, % 0,23 17,3 ± 0,8

обусловливает противоречивость полученных данных. Но такая методика не совсем корректна, так как не позволяет оценить характер изменений в патологической СЖ. Поэтому мы разработали методику теоретического расчета количества субпопуляций лимфоцитов в нормальной СЖ.

В основу этой методики положено нормальное содержание лейкоцитов в СЖ (до 200 в 1 мкл), а уровень лимфоцитов около 30% всего клеточного состава, т. е. абсолютное количество лимфоцитов в СЖ в норме составляет 60 клеток в 1 мкл [2, 4].

По данным того же источника, количество лимфоцитов периферической крови составляет 4500 клеток в 1 мкл. Определяем соотношение количества лимфоцитов в периферической крови и СЖ: 4500 : 60 = 75. Следовательно, в СЖ количество лимфоцитов в 75 раз меньше, чем в крови. На основании этой разницы мы рассчитывали количество субпопуляций лимфоцитов в СЖ у здорового человека (теоретическая норма). Полученные данные позволяют оценивать характер изменений в СЖ при различных заболеваниях, сопровождающихся синовиальным выпотом. Полученные результаты приведены в табл. 1.

Состав иммуноглобулинов, полученный на раннем посмертном материале (до 2 ч), изучен зарубежными авторами (Нтмг z., Tichy M., Salavec M., vavina J., 1972). По данным этих авторов, в СЖ содержание IgG 262,04 мг%, IgA 84,36 мг%, IgM 13,78 мг% [8]. Эти данные мы взяли нами за норму.

В связи с тем, что в доступной литературе не найдено работ, посвященных определению ФАН и уровня ЦИК в СЖ здорового человека, мы их вынужденно сравниваем с показателями периферической крови здоровых лиц.

Статистическая обработка выполнена при помощи пакета программ Exel. Достоверность результатов определяли, используя /-критерий Стьюдента и критерий Вилкинсона в модификации Манна-Уитни. Достоверным считали р < 0,05.

Результаты и обсуждение. У 22 больных РА СЖ получена в объеме, достаточном для исследования ВЭБ. У 11 больных ВЭБ обнаружили, у остальных 11 он не выявлялся. Полученные данные приведены в табл. 2, из которой видно, что относительное количество CD3+ в инфицированной ВЭБ СЖ повышено в 87,69 раза, а в неинфицированной СЖ - в 87,12 раза по сравнению с нормой. Относительный уровень CD20+ в инфицированной ВЭБ СЖ повышен в 77,86 раза, в неинфицированной СЖ - в 74,83 раза; относительное

Таблица 2

Иммунологические показатели инфицированной и неинфицированной вЭБ сЖ у больных рА

Показатель Инфицированная ВЭБ СЖ (п = 11) Неинфицированная ВЭБ СЖ (п = 11) Норма

CD3+, % 42,09 ± 1,25 41,82 ± 2,68 0,48 ± 0,02

CD20+, % 23,36 ± 1,81 22,45 ± 1,76 0,3 ± 0,01

CD4+, % 29,36 ± 0,72 29,82 ± 1,69 0,48 ± 0,01

CD8+, % 26,82 ± 1,20 24,0 ± 1,99 0,48 ± 0,02

CD4/CD8 1,19 ± 0,06 1,37 ± 0,19 1,00 ± 0,5

CD16+, % 23,64 ± 1,34 19,54 ± 1,91 0,16 ± 0,01

CD25+, % 20,0 ± 1,49 21,18 ± 1,82 0,27 ± 0,01

CD95+, % 19,64 ± 2,29 21,91 ± 2,42 0,37 ± 0,01

CDHLADR+, % 19,50 ± 1,53 23,44 ± 2,75 0,23 ± 0,01

IgG, мг% 894,45 ± 70,12 946,80 ± 105,47 262,04

IgM, мг% 91,18 ± 8,26 86,0 ± 11,18 13,78

IgA, мг% 119,73 ± 16,36 131,70 ± 13,13 84,36

ФАН, % 43,67 ± 4,18 44,50 ± 4,19 59,3 ± 1,2

ЦИК, ед. 62,58 ± 11,97 81,55 ± 15,47 37,4 ± 1,8

содержание cD4+ в инфицированной ВЭБ СЖ повышено в 61,16 раза, а в неинфицированной СЖ - в 62,46 раза по сравнению с нормой. Относительное количество cD8+ повышено в инфицированной ВЭБ СЖ в 55,87 раза, а в неинфицированной СЖ - в 50 раз; относительный уровень CD16+ повышен в инфицированной ВЭБ СЖ в 147,75 раза, а в неинфицированной СЖ - лишь в 122,12 раза по сравнению с нормой. Относительное содержание cD25+ повышено в инфицированной ВЭБ СЖ в 74 раза, а в неинфицированной СЖ - в 78,44 раза по сравнению с нормой. Относительный уровень cD95+ был выше в 53,08 раза в инфицированной ВЭБ СЖ, а в неинфицированной СЖ - в 59,22 раза по сравнению с нормой. Относительное количество CDHLADR+ в инфицированной ВЭБ СЖ повышено в 84,78 раза, а в неинфицированной СЖ - в 101,92 раза по сравнению с нормой.

Уровень IgG в инфицированной ВЭБ СЖ был выше нормы в 3,42 раза, а в неинфицированной СЖ - в 3,6 раза; уровень IgM в инфицированной ВЭБ СЖ был выше в 6,62 раза, а в неинфицированной СЖ - в 6,24 раза, чем в норме; уровень IgA в инфицированной ВЭБ СЖ повышен в 1,42 раза, а в неинфицированной СЖ - в 1,56 раза по сравнению с нормой. Степень ФАН была достоверно снижена в инфицированной ВЭБ СЖ в 1, 36 раза, а в неинфицированной СЖ - в 1,33 раза по сравнению с нормой. Уровень ЦИК в инфицированной ВЭБ СЖ повышен в 1,67 раза, а в неинфицированной СЖ - в 2,18 раза по сравнению с нормой.

Большая степень повышения относительного количества CD8+ и CD16+ в инфицированной ВЭБ СЖ обусловлено компенсаторной реакцией иммунной системы, направленной на элиминацию вируса в очаге поражения, а повышение относительного уровня cD20+ связано с прямым стимулирующим действием ВЭБ на В-клетки [17, 18]. Снижение относительного количества CD25+, CD95+ и CDHLADR+ в инфицированной ВЭБ СЖ, возможно, обусловлено угнетающим действием ВЭБ или его метаболитов на апоптоз и его регуляторные механизмы [20, 21]. Снижение уровня ЦИК в инфицированной ВЭБ СЖ, вероятно, можно объяснить барьерными свойствами синовиальной оболочки, затрудняющей переход ЦИК из крови в СЖ [19].

Таким образом, в инфицированной ВЭБ СЖ в большей степени, чем в неинфицированной СЖ повышено относительное количество CD8+, CD16+ и CD20+, и, наоборот, в меньшей степени, чем в неинфицированной СЖ, относительный уровень cD25+, cD95+, cDHLADR+ и ЦИК по сравне-

- 266 -

ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ

нию с нормой. Степень повышения содержания CD3+, CD4+ и IgA, IgM и IgG и степень снижения ФАН существенно не отличались между собой у инфицированных и неинфицированных ВЭБ больных.

Выводы. 1. В инфицированной ВЭБ СЖ у больных РА повышено относительное количество cD8+, cD16+ и cD20+ по сравнению с таковым при неинфицированной СЖ и норме. 2. В неинфицированной ВЭБ СЖ у больных РА повышено относительное содержание cD25+, cD95+, cDHLADR+ и ЦИК по сравнению с аналогичными показателями неинфицированной СЖ и нормой. 3. У больных РА относительное количество cD3+, cD4+, уровень IgA, IgМ и IgG и степень снижения ФАН существенно не отличаются между собой в инфицированной и неинфицированной ВЭБ СЖ по сравнению с нормой.

ЛИТЕРАТУРА

1. Коваленко В.Н., Гавриш А.С., Гавриленко Т.И., Киндзерская

О.Л., Якушко Л.В. Клеточные и гуморальные факторы рецидивирующего течения ревматоидного артрита. Украшський ревматолопчний журнал. 2007; 1 (27): 47-54.

2. Кишкун А.А. Руководство по лабораторным методам диагностики. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2007: 55; 125.

3. Логинова Т.К. Характеристика ранних форм подагрического, ревматоидного и псориатического артритов с использованием алгоритмов вычислительной диагностики: Дис. ... д-ра мед. наук. М.; 2006.

4. Насонов Е.Л, Насонова В.А. Ревматология: Национальное руководство. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2008: 62.

5. Синяченко О.В. Современные аспекты анализа синовиальной жидкости. Украшський ревматолопчний журнал. 2008; 2 (32): 30-9.

6. Burns C.M., Tsai V., Zvaifler N.J. High percentage of CD8+, Leu-7+ cells in rheumatoid arthritis synovial fluid. Arthr. and Rheum. 1992; 35 (8): 865-73.

7. Dabloug J.H., Forre O., Kvien T.K., Egeland T., Degre M. Natural killer (NK) cell activity of peripheral blood, synovial fluid, and synovial tissue lymphocytes from patients with rheumatoid arthritis and juvenile rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 1982; 41: 490-4.

8. Hrncir Z., Tichy M., Salavec M., Vavrina J. Immunoglobulins A, G, and M in synovial fluid in rheumatoid arthritis. (Reactive synovitis of local origin and in post mortem synovial fluid). Ann. Rheum. Dis. 1972; 31: 325-9.

9. Mottonen M., Heikkinen J., Mustonen L., Isomaki P., Luukkainen

R. , Lassila O. CD4+ CD25+ T cells with the phenotypic and functional characteristics of regulatory T cells are enriched in the synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis. Clin. Exp. Immunol. 2005; 140 (2): 360-7.

10. Ospelt C., Neidhart M., Gay R.E., Gay S. Synovial activation in rheumatoid arthritis. Front. Biosci. 2004; 9: 2323-34.

11. Panayi G.S. В-cells - fundamental role in pathogens RA. Rheumatology (Oxford). 2005; 44 (Suppl. 2): 3-7

12. StahlH.-D., Hubner B., SeidlB., Liebert U.G., van der Heijden

I.M., Wilbrink B. et al. Detection of multiple viral DNA species in synovial tissue and fluid of patients with early arthritis.Ann. Rheum. Dis. 2000; 59: 342-6.

13. Stanczyk J., Ospelt C., Gay R.E., Gay S. Synovial cell activation. Curr. Opin. Rheumatol. 2006; 18 (3): 262-7.

14. Takemura S., Klimiuk P.A., Braun A., Goronzy J.J., Weyand C.M. T cell activation in rheumatoid synovium is B cell dependent. J. Immunol. 2001; 16: 4710-8.

15. Takeda T., Mizugaki Y., Matsubara L., Imai S., Koike T., Takada K. Lytic Epstein-Barr virus infection in the synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis. Arthr. and Rheum. 2000; 43: 1218-25.

16. Takei M., Mitamura K., Fujiwara S. Detection of Epstein-Barr virus-encoded small RNA 1 and latent membrane protein 1 in synovial lining cells from rheumatoid arthritis patients. Int. Immunol. 1997; 9: 739-43.

17. Tan L.C., Mowat A.G., Fazou C., Rostron T., Roskell H., Rod Dunbar P. et al. Specificity of T cells in synovial fluid: high frequencies of CD8+ T cells that are specific for certain viral epitopes. Arthr. Res. 2000; 2 (2): 154-64.

18. Toussirot E., Roudier J. Pathophysiological links between rheumatoid arthritis and the Epstein-Barr virus: an update. Joint Bone Spine. 2007; 74 (5): 418-26.

19. Watson F., Robinson J.J., Phelan M., Bucknall R.C., Edwards

S. W. Receptor expression in synovial fluid neutrophils from patients with rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 1993; 52: 354-9.

20. Weyand C.M., Goronzy J.J., Seisuke Takemura, Kurtin P.J. Cellcell interactions in synovitis: Interactions between T cells and B cells in rheumatoid arthritis. Arthr. Res. 2000; 2 (6): 457-63.

21. Weyand C.M., Goronzy J.J. Ectopic germinal center formation in rheumatoid synovitis. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003; 987: 140-9.

Поступила 07.02.13

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013

УДК 616.379-008.64-092:612.015.3]-078.33

И.В. Кологривова, Т.Е. Суслова, О.А. Кошельская, И.В. Винницкая, О.А. Трубачева

ВЛИЯНИЕ ГЛЮКОЗЫ И ИНСУЛИНА НА СЕКРЕЦИЮ ЦИТОКИНОВ МОНОНУКЛЕАРАМИ пЕРИфЕРИЧЕсКОй КРОВИ IN vITRO

ФГБУ Научно-исследовательский институт кардиологии СО РАМН, 634012, г. Томск

Целью настоящего исследования стало изучение влияния разной концентрации инсулина и глюкозы на секрецию цитокинов с различными биологическими эффектами у здоровых лиц и пациентов с сахарным диабетом (СД) 2-го типа (СД-2). Мы показали, что для пациентов с СД-2 характерно повышение содержания интерлейкина IL-4, IL-6, IL-10, фактора некроза опухоли a (TNFa) и IL-17A в сыворотке периферической крови. У здоровых лиц при высоком содержании глюкозы in vitro увеличивалась секреция IL-23, трансформирующего фактора роста в (TGFP) и TNFa мононуклеарами. У пациентов с СД-2 повышение концентрации глюкозы в среде не оказывало влияния на секрецию цитокинов. При добавлении инсулина в физиологической концентрации в среду культивирования с глюкозой у здоровых лиц снижалась секреция IL-23, IL-6 и TGFP мононуклеарами, в то время как клетки пациентов с СД-2 оказались инертными к воздействию инсулина.

Ключевые слова: цитокины, сахарный диабет 2-го типа, глюкоза, инсулин

- 267 -