ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГРИБА SCLEROTINIA SCLEROTIORUM НА НАКОПЛЕНИЕ БИОМАССЫ И ФИТОТОКСИЧНОСТЬ Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 632.482.16

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГРИБА SCLEROTINIA SCLEROTIORUM НА НАКОПЛЕНИЕ БИОМАССЫ И ФИТОТОКСИЧНОСТЬ

А.П. Дмитриев, Г.В. Митина, Н.П. Шипилова, О.С. Юзихин

Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург

Учитывая возможность использования гриба Sclerotinia sclerotiorum для создания биогербицида против конопли, проведено исследование накопления грибом биомассы, его фитоток-сичности и патогенности. При инкубировании на жидкой соевой среде в глубинных условиях выявлено влияние длительности культивирования на количество мицелия, изменение рH культуральной жидкости. Изучено влияние количества инокулюма, вносимого в колбы, и исходного объема питательной среды на выход биомассы гриба. Из гриба выделены токсины и показано, что они имеют фенольную природу, аналогичны выявленным ранее и описанным в литературе склерину, склеролиду, склеротинину А, склеротинину В, склерону или изосклеро-ну и не играют существенной роли в патогенезе. Для всесторонней оценки фитотоксичности и патогенности гриба предложен набор из 10 видов одно- и двудольных культурных растений.

Ключевые слова: Sclerotinia sclerotiorum, питательные среды, режимы инкубирования, фитотоксичность, патогенность, фитотоксины, биомасса.

Гриб Sclerotinia sclerotiorum (Lib). de Bary - мало специализированный фитопа-тоген, поражает широкий круг двудольных растений, в т.ч. культурных, вызывая белую гниль, то есть загнивание стеблей (Наумов, 1952), и имеет широкое географическое распространение (Adams et al., 1974). Поражение ведет к излому стеблей и увяданию всего растения. Имеются также данные об использовании этого гриба в качестве биогербицида, в т.ч. против бодяка на пастбищах (Bourdot et al., 2006), водного гиацинта (de Jong, de Voogd, 2006) и других растений (Pottinger et al., 2008). В связи с этим данный гриб был выбран как возможный агент для борьбы с наркотическими растениями, в первую очередь с коноп-

Методика

Накопление биомассы мицелия для изучения особенностей роста гриба осуществляли путем ино-кулирования жидких сред следующих составов (г на 1 л воды): - Чапека - NaNO3-2, KH2PO4 - 1, KCl

- 0.5, MgSO4 - 0.5, глюкоза - 20; соево-глюкозной (СГ) - KH2PO4 -2, (NH4)2SO4-1, MgSO4-1, глюкоза-20, соевая мука-10; пептонно-дрожжевой - KH2PO4

- 1, KCl- 0.5, MgSO4- 0.5, пептон - 1, дрожжевой экстракт - 5, глюкоза - 20; картофельно-сахарозной с 2% сахарозы (КС) и картофельно-глюкозной с 2% глюкозы (КГ). Культуры гриба выращивали в глубинных условиях на качалке (частота вращения 220 об/мин) в колбах Эйленмейера. При изучении влияния количества питательной среды на рост биомассы гриба в 100 мл СГ среды вносили 1 или 2 мицелиальных блока, вырезанных буром диаметром 0.9 см из культуры гриба, выращенной на ага-ризованной СГ среде. При изучении влияния количества внесенного в питательную среду инокулюма

лей. Поскольку развитие белой гнили на конопле в природе приурочено к достаточно поздним фазам развития растений, естественные пути заражения могли в текущем сезоне сократить семенную продуктивность и снизить численность растений только в последующем. Учитывая необходимость раннего уничтожения конопли, чтобы воспрепятствовать сбору пыльцы и листовой массы, мы предложили в качестве инокулюма использовать мицелий гриба, нанося его на листья молодых растений. Для разработки технологии создания мицелиаль-ного инокулюма необходимо было изучить особенности роста мицелия гриба на жидких питательных средах, динамики его развития в этих условиях и образования им токсинов.

исследований

в 100 мл соевой среды вносили 1, 2, 4, 6 таких блоков. При изучении влияния количества питательной среды на биомассу гриба в 50, 100, 200, 300, 400 мл соевой среды вносили 1 или 2 блока.

Для определения выхода биомассы высушивали весь объем предварительно отфильтрованной куль-туральной массы. Вначале ее сушили в течение 24 часов при 60°C, а затем подсушивали до постоянного веса при 105°C.

Фитотоксичность культуральной жидкости, выделенных из нее фракций и патогенность S. sclero-tiorum определяли по размеру некроза на дисках диаметром 10 мм, вырезанных из листьев растений. Для определения фитотоксичности в центр предварительно наколотого диска наносили каплю исследуемой жидкости объемом 10 мкл (Yuzikhin et al., 2007). Для определения патогенности гриба на диск наносили каплю воды, в которую микробиологической иглой вносили сгусток мицелия, выращенного на КГА.

Для выделения и очистки фитотоксинов из культурального фильтрата гриба были использованы следующие методы: переэкстракция из одного растворителя в другой, промывка экстрактов, фильтрация, комплекс методов препаративной хроматографии (колоночная хроматография на си-ликагеле, препаративная тонкослойная хроматография). Чистоту выделенных веществ оценивали методом аналитической ТСХ на пластинах с сили-

Результаты

Выявлено влияние питательных сред разного состава на накопление биомассы мицелия S. sclerotiorum при культивировании гриба в глубинных условиях. Наибольшая биомасса мицелия отмечена на полусинтетических средах с достаточным количеством углеводов. Так, на пептонно-дрожжевой среде масса мицелия составила 2.50 г, на соевой 2.81 г, а на среде Чапека только 1.06 г. На картофельно-глюкозной и картофельно-сахароз-ной средах вес мицелия составлял около 2 г. Это совпадает с данными, полученными нами ранее (Шипилова, Дмитриев, 2011), свидетельствующими, что скорость роста гриба на агаризированных средах выше при обогащенном их составе.

На следующем этапе изучили влияние количества внесенного инокулюма на развитие гриба S. sclerotiorum в жидкой культуре в условиях аэрации. Как динамика накопления мицелиальной массы, так и ее конечный вес практически не зависят от количества внесенного инокулюма (рис. 1). Однако, при внесении 6 блоков масса мицелия была несколько ниже, чем в других

кагелем. Для выделения и анализа компонентного состава метаболитных комплексов и первичного выявления активных фракций из биомассы грибов 100 г субстрата обрабатывали дважды при энергичном встряхивании при комнатной температуре равным количеством (по массе) этанола. Суспензи-ию фильтровали, экстракт выпаривали в вакууме досуха. Получали порошки от светло-коричневого до темно-коричневого цвета.

исследований

вариантах. Видимо, большое количество внесенного гриба приводит к быстрому поглощению питательных веществ в среде и ускоряет переход гриба к образованию склероциев, на формирование которых уходит определенная часть массы мицелия. Об этом свидетельствует снижение массы мицелия и в других вариантах опыта на 5 сутки - время образования оформившихся склероциев по краям колб.

Изучено также влияние объема питательной среды на скорость накопления биомассы. Независимо от объема питательной среды гриб имел практически сходное развитие (рис. 2). На 4 сутки роста наблюдалось некоторое увеличение массы мицелия. В этот период уже начинают появляться бугорки (будущие склероции) по краям колб. Начиная с 5 суток наблюдается постепенное уменьшение массы мицелия практически во всех вариантах опыта, так как гриб вступает в следующую стадию развития - образование склероциев, на построение которых уходит часть мицели-альной массы.

2

4

о о

S &

' 21 II

' (О II

Количество блоков

Рис. 1. Мицелиальная масса гриба S. sclerotiorum в зависимости от количества внесенного инокулюма

3 4 5 6 7 10 Продолжительность культивирования (сутки)

Рис. 2. Влияние объема среды на рост мицелия гриба S. sclerotiorum

3

2

6

На 10 сутки масса мицелия уменьшилась приблизительно на 50% во всех вариантах опыта. Колебания массы мицелия в

варианте с объемом 400 мл свидетельствуют о нарушении эндогенного ритма в развитии гриба. При таком соотношении объе-

Вестник защиты растений, 1, 2012 мов питательной среды и колбы гриб, видимо, плохо аэрируется, тогда как влияние аэрации на рост мицелия весьма значительно. Об этом свидетельствуют данные, представленные на рисунке 3.

Продолителыгаь культивирования (сут.)

Рис. 3. Влияние условий культивирования гриба S. sclerotiorum на прирост биомассы

Показатели развития гриба резко различаются в зависимости от того, культивируется он в условиях аэрации или без нее. На 3 сутки роста в глубинных условиях на качалке биомасса гриба больше в 2 раза, чем при поверхностном культивировании. На 5 сутки массы уравниваются. Но при этом в условиях аэрации она уменьшилась относительно массы, полученной на 3 сутки, вследствие созревания склероциев, а при отсутствии аэрации она повысилась, и здесь склероции только начинают формироваться. На 7 сутки при глубинном культивировании биомасса уже не изменяется, а при поверхностном слегка увеличивается (рис. 3).

Обладая большим набором ферментов, гриб S. sclerotiorum активно усваивает и разлагает сахара питательных сред до кислот, вызывая тем самым изменения pH среды. Эти изменения (подкисление) начинаются уже через сутки роста. В дальнейшем при поверхностном росте гриба кислотность среды практически не изменялась с 3 по 7 сутки культивирования (рН=3.5-3.7), а при глубинном культивировании в эти сроки происходило постепенное уменьшение кислотности с рН=2.60 до 4.10.

Увеличение массы мицелия при поверхностном культивировании на 5 сутки на фоне снижения рИ культуральной жидкости свидетельствует о том, что мицелий еще находится в активной стадии роста. На 9 сутки снижение кислотности среды продолжилось в обоих вариантах, и рИ составило для культуры гриба, инкубированной без аэрации, 5.9, в условиях аэрации - 4.4,

при этом мицелий был практически полностью лизирован. Изучено также действие на культурные растения метаболитов, содержащихся в культуральной жидкости при выращивании мицелия в жидкой среде. Фитотоксичность культуральной жидкости изучали на 8 видах растений из различных семейств. Гриб выращивали на 3 питательных средах с различными источниками углеводов и азота. Наибольший размер некроза выявлен при использовании СГ среды, как наиболее благоприятной для роста и развития гриба. Выявлено, что фитотоксичность минимальна для пшеницы. Культуральная жидкость была слабо токсичной также для редиса и свеклы, но проявила значительную фитотоксическую активность в отношении конопли (размер некроза - 3.8 мм), салата (8.6 мм) и горо-ха(2.9 мм) при выращивании на среде с соей в течение 5 суток (табл. 1). При выращивании гриба на пептоно-дрожжевой среде наибольшая фитотоксичность была обнаружена в отношении салата (3.2 мм) и гороха (2.4-3.2 мм), а на конопле она была невысокой (1.8 мм). Следует отметить, что салат является чувствительной тест-культурой для многих фитотоксинов и используется в качестве модельного двудольного растения для поиска и оценки новых фитотоксинов (Dayan et al., 2000). При этом в средах накапливались токсины, не проявляющие специфичности в отношении растений, относящихся к определенному семейству. В целом фитотоксичность отмечена для растений из всех изученных семейств. Однако, тот факт, что в разных условиях культуральная жидкость была фитотоксичной к конопле и не являлась таковой к редису и наоборот, например, на средах 3 и 2 (5 сутки) позволяет предполагать существование в среде не одного, а нескольких фитотоксинов.

С целью выбора оптимального режима выделения и очистки токсина была предложена схема, по которой путем одной или нескольких последовательных экстракций его выделяют из культуральной жидкости гриба S. sclerotiorum с последующей очисткой экстракта на колонке с силикагелем. Для реализации этой схемы необходимо было установить природу извлекаемых веществ или, конкретнее, их полярность и растворимость в некоторых органических растворителях.

Таблица 1. Фитотоксичность культуральной жидкости гриба Sclerotinia вс1егоиогит, выращенного на различных питательных средах Диаметр некроза (мм) по вариантам

Тест-растения 1*(3**) 1 (5) 2 (3) 2 (5) 3 (3) 3 (5)

Конопля 0 0 0.5±0.2 0 1.8+0.2 3.8+1.4

Редис 0 0 1.7±0.3 2.9+0.1 1.1+0.1 0.9+0.3

Свекла 0.9+0.1 0.5±0.2 2.0±0.2 2.0+0.4 2.0+0.2 1.5+0.4

Салат 1.0±0.2 0.5±0.3 3.2±0.5 3.2+0.4 1.2+0.3 8.6+0.9

Горох 0 0 2.4+0.1 3.2+0.2 2.0+0.4 3.6+1.2

Огурец 0 0 0.2+0.1 1.5+0.3 1.2+0.3 2.1+0.6

Томат 1.3±0.3 0.5±0.2 2.0+1.0 2.0+0.6 3.5+0.6 2.6+0.2

Пшеница 0.2±0.2 0 2.2+0.2 0.8+0.4 1.6+0.4 1.8+0.2

*Среды: 1- среда Чапека с глюкозой; 2- пептоно-дрожжевая; 3-ния гриба

соевая; **Сутки культивирова-

Проведен поиск токсинов, которые способны вызывать некротизацию тканей растения и способствовать проникновению гриба в вегетативные органы. Для этого 600 мл предварительно отфильтрованной через фильтр "Красная лента" культуральной жидкости промывали последовательно в делительной воронке объемом 1000 мл несколькими органическими растворителями (3 раза по 200 мл каждым), увеличивая полярность промывок в следующем ряду: гексан, диэтиловый эфир, хлористый метилен и эти-лацетат.

После удаления растворителей было получено соответственно: из гексанового экстракта - 23 мг сухого остатка, из эфирного - 57 мг, из метиленхлоридного - 17 мг, из этилацетатного - 105 мг. Полученные экстракты изучены на фитотоксичность к вышеприведенным видам культурных растений (табл. 2).

Наилучшие результаты получены для этилацетатного экстракта, который оказал токсическое действие на всех тест-растениях. Причем для конопли слабое действие было обнаружено только для эти-лацетатного экстракта. Полученные результаты позволили сделать предположения относительно строения выделенных фитотоксинов.

Извлечение их в полярную этилацетат-ную фракцию, а также хроматографиче-ское поведение свидетельствуют о том, что мы имеем дело с полярными соединениями. Спектры ПМР и 13С данных соединений указывают на наличие в структуре ароматического кольца. В связи с этим можно сделать предположение, что выделенные соединения (рис. 4) имеют фенольную природу и близки по строению или аналогичны

выделенным ранее и описанным в литературе (Pedras, Ahiahonu, 2004) склерину (1), склеролиду, склеротинину А, склеротинину В, склерону (2) или изосклерону. Таблица 2. Фитотоксичность экстрактов из куль-туральной жидкости гриба S. sclerotiorum Диаметр некроза (мм) на тест-Тест- растениях по вариантам экстрагента

растение гексан диэт. эфир хлор. метилен этила-цетат контроль

Конопля 0 0 0 1.0+0.3 0

Огурец 0 0 0 1.2+0.4 0

Редис 0 0.6+0.4 0 4.2+0.7 0

Салат 0 0.6+0.2 0 3.6+0.4 0

Горох 0 0 0 2.6+0.9 0

Свекла 0.8+0.4 1.0+0.6 0.4+0.2 3.0+0.6 0

Томат 0 2.4+0.4 0 4.8+0.7 0.4+0.2

Пшеница 0 0.8+0.2 0 2.0+0.5 0

Нельзя не отметить, что токсичность выделенных веществ к конопле была невысокой или вовсе отсутствовала. Наивысшую реакцию показали такие чувствительные к микотоксинам растения как салат и томат. В связи с этим роль токсинов склеротинии в патогенезе остается неясной. Возможно, они не являются ведущим фактором в ходе проникновения и заражения конопли грибом. Исследования в этом направлении следует продолжать.

сн 3 сн•

OH

OH

12 „

oh о о

Рис. 4. Возможная структура токсинов, обнаруженных у S. sclerotiorum 1- склерина, 2- склерона

H3C

H зС

Данные, полученные при изучении па-тогенности и фитотоксичности S scleroti-orum, свидетельствуют, что для регистрации этих свойств у данного и других видов грибов, продуцентов биогербицидов, целесообразно предложить список видов культурных растений, достаточно широко представляющих их ботаническое разнообразие, учитывающий экономическую значимость культуры, возможность быстрого проведения лабораторных тестов и ее чувствительность к грибным токсинам. Мы считаем, что в этот рекомендуемый список должны входить - пшеница (как наиболее значимая зерновая культура), ячмень (как экономически значимый и наиболее чувствительный к внешним воздействием вид среди зерновых культур), кукуруза (как экономически значимый вид с особым - С-4 - типом фотосинтеза, способным влиять на чувствительность к грибным токсинам), подсолнечник (как экономически значимый вид семейства сложноцветных), горох (как экономически значимый вид семейства бобовых), свекла (как экономически значимый вид семейства амарантовых), редис (как представитель семейства крестоцветных), томат (как представитель семейства пасленовых), огурец (как представитель семейства тыквенных и вид, чувствительный к грибным токсинам), салат (как вид, чувствительный (Dayan et al., 2000) к грибным токсинам).

Проверка патогенности гриба S. scleroti-orum показала, что из испытанных 10 видов культурных растений пораженными оказались все виды двудольных, а однодольные растения оказались устойчивыми к грибу (табл. 3). Только на листьях ячменя было отмечено небольшое количество нерасширяющихся точечных некрозов. Реакция предложенных видов на воздействие суспензией грибных зачатков или культу-ральной жидкостью в настоящее время является составной частью фитотоксикологи-ческого паспорта штамма гриба, который специально разработан для характеристики грибов, продуцентов биогербицидов. Паспорт утвержден и рекомендован к использованию Межведомственной комисси-

ей РАСХН по микробиологическим средствам защиты растений и биоудобрениям.

Таблица 3. Патогенность S. sclerotiorum для листовых дисков растений различных семейств

Семейства Вид растения Диаметр некроза (мм) на 3 сутки

Poaceae Triticum aestivum 0

Hordeum vulgare 0.5

Zea mays 0

Asteraceae Helianthus annuus 8

Fabaceae Pisum sativum 10

Betulaceae Beta vulgaris 10

Brassicaceae Raphanus sativus 10

Solanaceae Lycopersicon escu- 10

lentum

Cucurbita- Cucumis sativus 10

ceae

Asteraceae Lactuca sativa 10

Таким образом, в процессе исследований выявлено, что максимальная биомасса мицелия в жидкой среде накапливается на богатых средах, и ее конечное количество мало зависит от объема среды и внесенного инокулюма. По мере роста гриба среда за-кисляется, а после достижения максимальной массы гриба и начала образования склероциев кислотность среды снижается. Гриб S. sclerotiorum непатогенен, а его метаболиты слабо токсичны для основных зерновых культур, но оказывают неблагоприятное действие на широкий спектр двудольных видов культурных растений. Показано, что S. sclerotiorum вероятнее всего обладает как минимум несколькими неспецифическими экзотоксинами, аналогичными выявленным ранее у этого гриба и описанным в литературе склерину, склеро-лиду, склеротинину А, склеротинину В, склерону или изосклерону.

Однако роль этих токсинов в патогенезе, видимо, незначительна. Полученные при изучении фитотоксичности и патоген-ности S. sclerotiorum данные позволяют для полноценной оценки этих свойств рекомендовать 10 видов культурных дву- и однодольных растений.

Литература

Наумов Н.А. Болезни сельскохозяйственных расте- Шипилова Н.П., Дмитриев А.П. Биологические осо-

ний. М-Л. 1952, 664 с. бенности гриба Sclerotinia .sclerotiorum, выделенного из

конопли // Вестник защиты растений, 2011, 1, с. 20-26.

Adams P.B.. Lumsden R.D.. Tate C.J. Galinsoga parviflo-ra: a new host for Whetzelinia sclerotiorum // Plant dis. reprt., 1974, 58, 8. p.700-701.

Bourdot G W., Hurell G. A., Saville D. J., Leathwick D. M. Impacts of applied Sclerotinia sclerotiorum on the dynamics of a Cirsium arvense population // Weed Research, 2006, 46, p. 61-72/

Dayan F.E., Romagni J.G., Duke S.O. Investigation the mode of action of natural phytotoxins // Journal of Chemical Ecology, 2000, 26, 9, p. 2079-2093.

Jong de M. D., Voogd de W. B. Novel mycoherbicides for biological control of aquatic weeds such as Water Hyacinth and Water Lettuce: Patent Disclosure // Annals of Plant

Protection Sciences, 2006, 14, 1, p. 97.

Pedras M.S.C., Ahiahonu P.W.K. Phytotoxin production and phytoalexin elicitation by the phytopathogenic fungus Sclerotinia .sclerotiorum // Journal of Chemical Ecology, 2004, 30, 11, р. 2163-2179.

Pottinger B.M., Ridgway H.J.,. Bourdôt G.W, Stewart A. The potential use of ascospores as the active ingredient for a Sclerotinia sclerotiorum-based mycoherbicide//Australasian Plant Pathology, 2008, 37, 5, p. 443-447.

Yuzikhin O., Mitina G., Berestetskiy A. Herbicidal Potential of Stagonolide, a New Phytotoxic Nonenolide from Stagonospora cirsi //J. Agric. FoodChem., 2007, 55, 19, p.7707-7711.

Работа выполнена при поддержке Госконтракта 1295/13.

THE INFLUENCE OF SCLEROTINIA SCLEROTIORUMCULTIVATION CONDITIONS ON THE BIOMASS ACCUMULATION AND ITS PHYTOTOXICITY

A.P.Dmitriev, G.V.Mitina, N.P.Shipilova, O.S.Yuzikhin Sclerotinia sclerotiorum is a possible bioherbicide against hemp; therefore, investigation of the fungus biomass accumulation, its phytotoxicity and pathogenicity was carried out. The influence of cultivation duration on mycelium biomass and pH change of the cultural liquids is demonstrated at the fungus cultivation on liquid soya medium in conditions of aeration. The influence of the initial fungus quantity brought in flasks and of initial volume of nutrient medium on the fungus biomass is investigated. It is shown that toxins of Sclerotinia sclerotiorum have a phenolic nature, are similar to revealed and described earlier sclerin, sclerolide, sclerotinin A, sclerotinin B, sclerone, isosclerone, and do not play an essential role in pathogenesis. The set of 10 species of mono- and dicotyledonous cultivated plants is offered for the fungus phytotoxicity and pathogenicity estimation.

Keywords: Sclerotinia sclerotiorum, artificial medium, cultivation conditions, sclero-tium, phytotoxicity, pathogenicity.

A.n.^MMTpweB, g.6.H., dandrep@mail.ru r.B.MMTMHa, K.6.H., galmit@rambler.ru H.n.mwnM^OBa. K.6.H., (812) 361-88-46 O.C.ro3MXMH, k.6.h. yuzikhin@mail.ru