CC BY
1928
Вестник защиты растений, 3, 2012
УДК 632.937.14/.15
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ АРАБИНОГАЛАКТАНА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВЫСШИХ ГРИБОВ И МИКРООРГАНИЗМОВ -ПРОДУЦЕНТОВ СРЕДСТВ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ
Г.В. Митина*, С.В. Сокорнова*, Л.Г. Махотина**, А.Г. Кузнецов**, Э.Л. Аким**
*Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург, **Санкт-Петербургский государственный технологический университет растительных полимеров
Показана перспективность использования арабиногалактана (АГ) в качестве источника углерода при выращивании микромицетов и инокулюма высших грибов на агаризованных средах. Скорость роста фитопатогенных микромицетов на среде с АГ была на уровне и выше скорости роста этих грибов на стандартных средах. Использование АГ в качестве источника углерода в два раза увеличивало скорость роста мицелия вешенки. Добавка АГ стимулировала рост бактерий-антагонистов Bacillus subtilis при культивировании на агаризованной среде.
Ключевые слова: арабиногалактан, микробиологический метод защиты растений, биоконверсия, культивирование мицелиальных грибов и бактерий.
Интерес к биологическим средствам защиты растений, направленным на контроль численности насекомых вредителей, сорных растений и болезней, как к наиболее экологически безопасным, неизменно растет. Уже в начале 1990-х гг. препараты на основе бактерий B. thu-ringiensis занимали 1-2% от мирового производства инсектицидов (Baum et al., 1999). Результатом активных исследований последних десятилетий стали препараты на основе микроскопических грибов: 107 наименований микоинсектицидов и микоакарицидов, 79 микофунгицидов и миконематицидов и 15 микогербицидов (Faria, Wraight, 2007; Jackson et al., 2010).
В то же время успешное использование микробиологических средств защиты растений требует поиска новых недорогих субстратов для культивирования микроорганизмов. Известно, что мицели-альные грибы и бактерии способны к усвоению сложных источников углеводов, содержащихся в растительных остатках, участвуя в их биоконверсии. С другой стороны, использование отходов переработки древесины приобретает важное экономическое и экологическое значение. Лиственница является самой распространенной древесной породой в лесосырьевой базе Российской Федерации. На ее долю приходится 51.2% площади хвойных лесов и около 43% всех
запасов хвойной древесины (Лисицкий, 1967). В то же время древесина лиственницы отличается от других хвойных пород высоким содержанием водорастворимых веществ, что ограничивает ее использование в целлюлозно-бумажной промышленности. Среди них около 1012% от веса древесины, а в некоторых образцах до 30%, составляет гидрофильный полисахарид арабиногалактан (АГ) (Антоновский, 1971), обладающий клеящими и другими ценными свойствами, позволяющими использовать АГ в пищевой промышленности и в медицине. Для комплексного использования лиственницы необходимо всестороннее изучение свойств арабиногалактана и других водорастворимых веществ.
Способность высших грибов к активному разложению лигноцеллюлозного комплекса недостаточно широко используется в биоконверсии растительных отходов. Так, в роде ПвигоЫв имеются виды, активно разрушающие древесину хвойных пород, что особенно ценно для утилизации отходов лесного хозяйства и деревообрабатывающей промышленности, а также термофильные виды. Ве-шенка устричная (Р1витоЫз osteatus) является одним из самых удобных для выращивания грибом, широко культивируемым во многих странах на растительных остатках (Билай и др., 1991). В последнее
Вестник защиты растений, 3, 2012 время благодаря уникальным целебным свойствам возрос интерес к культивированию другого съедобного гриба - шии-таке (ЬвпЫпив всОсИвв) (Гарибова и др., 1999).
Поэтому целью данной работы стало изучение возможности использования АГ
в качестве источника углерода в питательных средах для культивирования микроорганизмов (фито- и энтомопато-генные мицелиальные грибы и бактерии) и инокулюма высших съедобных грибов (шии-таке, вешенка).
Методика исследований
В работе использованы типовые культуры микроскопических грибов, патогенов насекомых (Verticillium lecanii, Beauveria bassiana, Metharizium anisopliae, Isaria farinose), патогенов сорных растений (Phomopsis sp, Phoma sp, Sclerotinium sclerotiorum, Fusarium sp.), антагонистов возбудителей болезней растений (Trihoderma viride), бактерий-антагонистов (B, subtilis) и бактерий, патогенов насекомых (B. thuringiensis) из Государственной коллекции микроорганизмов, патогенных для растений и их вредителей (ВИЗР).
Культивирование микроскопических грибов проводилось на стандартной агаризованной среде Чапека, а также на среде Чапека с АГ, которая вместо сахарозы содержала АГ в концентрации 20 г/л. Стерилизация при 0.5 атм 30 мин. Гифомицеты выращивали в чашках Петри в течение 7-14 дней при температуре 24±2°C. Посев проводили блоком в центр чашки Петри 7-дневной посевной культуры диаметром 5 мм.
Бактерии B. thuringiensis и B. subtilis выращи-
Результаты
Культивирование фитопатогенных грибов и гриба-антагониста Trichoderma viride на стандартной среде Чапека и среде Чапека, в которой сахароза заменена на АГ, показало, что все грибы проявили способность к росту и усвоению АГ (рис. 1).
Фитопатоген Phomopsis sp. достоверно лучше рос на среде с АГ по сравнению со стандартной средой. Скорость роста на среде с АГ составила 6.1 мм/сут, в то время как на стандартной среде - 3.0 мм/сут. Для видов Fusarium sp., T.viride и S.sclerotiorum не было выявлено достоверных различий между ростом на двух средах. Максимальная скорость радиального роста отмечена для Fusarium sp. - 7.5 мм/сут на обеих средах (рис. 2). При длительном выращивании Phomopsis sp. (более 9 суток) колонии достигали одного размера на обеих средах, что объясняется замедлением роста в связи с уменьшением питательных веществ в среде.
S. sclerotiorum рос медленнее на АГ,
вали на питательной среде следующего состава: пептон 20 г, хлорид натрия 4 г, агар 12 г. В качестве добавки вносили 15 г АГ, pH7.3. Стерилизация при 0.5 атм 30 мин. Посев бактериальной суспензией с титром 5x10е спор/мл осуществляли в лунку диаметром 5 мм в центр чашки Петри с питательной средой. Бактерии выращивали в течение 7 дней при 26±2°C.
Высшие грибы Lentinula edodes (Berk.) Pegler (шии-таке) и Pleurotus ostreatus (Jacq.) P.Kumm. (вешенка) культивировали на агаризованной среде Чапека и среде Чапека с АГ. Скорость роста мицелия макромицетов на агаризованных средах определяли в течение 10 дней при 24±2°C. Посев проводили блоком в центр чашки Петри 7-дневной посевной культуры диаметром 5 мм.
Скорость роста на агаризованных питательных средах во всех случаях определяли по изменению диаметра колоний. Измерение проводили ежедневно, начиная с 3-х суток культивирования грибов.
исследований
мицелий был менее обильный (рис. 1). На двух типах сред склероции образовывались одновременно на 6-е сутки. Но на стандартной среде кольцевая зона мицелия и склероции на ней образовывались при достижении мицелием края чашки Петри. При выращивании на твердой среде Чапека с АГ склероции образовывались на расстоянии 3-4 см от центра колонии и по периферии чашки. Обычно размеры и форма склероциев варьируют в зависимости от условий культивирования (Aytkhozhnina, Kolokolova, 2001) и начало их образования может инициироваться контактом с механическим барьером (Willetts, Wong, 1980). Возможно, добавка АГ и недостаток сахара стимулировали образование склероциев.
Предварительное изучение роста (посев штрихом) энтомопатогенных грибов на агаризованных средах показало, что они очень плохо растут на среде Чапека, в которой сахароза заменена на АГ, за исключением вида
Isaria farinosa, показавшего слабый рост на среде с АГ. Несмотря на то что энтомопатогеные грибы способны к усвоению хитина и сложных источников
Вестник защиты растений, 3, 2012 углерода, возможно, они требуют присутствия дополнительных источников для инициации роста или более высокой концентрации АГ.
Sclerotinia sclerotiorum
Phoma sp. j . Д
1 ± 2 I
Trichoderma viride
Сутки
Рис. 1. Рост микромицетов на агаризованных средах с АГ (слева) и сахарозой (справа) в качестве источника углерода
Рис. 2. Скорость радиального роста микромицетов на агаризованных средах, диаметр колонии, мм. 1- Чапек, 2 - Чапек+АГ
Высшие грибы на агаризованных средах выращивали в тех же условиях, что и микромицеты. С первых суток культивирования вешенка росла значительно быстрее на среде с АГ. Диаметр колоний был больше почти в 2 раза. Шии-таке вначале рос немного медленнее на среде с АГ, а начиная с 7 суток скорость роста на АГ стала
выше, чем (рис. 3, 4).
Развитие макромицетов
на стандартной среде
воздушного мицелия было более обильным на среде с АГ по сравнению со стандартной средой (рис. 3, сверху). В процессе дальнейшего культивирования наблюдалось образование плодовых тел грибов на обеих средах.
Вестник защиты растений, 3, 2012
31
Рис. 3. Вид колоний макромицетов на агаризованных средах шии-таке Ь.всСосСвв (слева) и вешенка Р. овГеаЫв (справа) (среда Чапека с сахарозой снизу, Чапека с АГ сверху)
и
Сутки
Рис. 4. Скорость радиального роста макромицетов на агаризованных средах вешенка Р. овГеаЫв (сверху) и шии-таке Ь.есСоССев (снизу)
Отмечен более быстрый рост бактерий В. зиЪШгв на среде с АГ по сравнению со стандартной средой с пептоном на 3-и, 5-е
Рис. 5. Вид колоний бактерий B. thuringiensis (слева) и B. subtilis (справа) на агаризованных средах (среда с АГ наверху, среда без АГ внизу) на 3-и сутки
и 7-е сутки. Для B. достоверных различий в обнаружено (рис. 5, 6).
Bacillus subtilis
thuringiensis росте не
Bvcittus thuringiensis
Рис. 6. Скорость радиального роста бактерий (прирост, мм) на среде 1- без АГ и 2- с АГ
В результате работы было установлено, что арабиногалактан используется фитопатогенными грибами (Phomopsis sp., Fusarium sp., Trihoderma viride, Phoma sp. и Sclerotinia sclerotiorum) в качестве единственного источника углерода на агаризованных средах.
АГ может быть использован высшими грибами (шии-таке, вешенка) при получении посевного материала. Добавка АГ стимулировала рост мицелия
Вестник защиты растений, 3, 2012 вешенки на агаризованной среде Чапека и не оказывала существенного влияния на рост мицелия шии-таке, причем начиная с 7 суток скорость роста на АГ была выше, чем на стандартной среде. Кроме того, внесение в среду АГ стимулировало рост бактерий-
антагонистов В. subtilis при культивировании на агаризованной среде.
В дальнейшем необходимо изучить возможность использования арабино-галактана в промышленных субстратах.
Литература
Антоновский С.Д., Кулакова В.Н., Чочиева А.Ф. Получение и переработка водорастворимых геми-целлюлоз древесины лиственницы // Химия древесины, 1971, 8, с.147-153.
Лисицкий К.Б. Лес - национальное богатство советского народа. М., 1967, с. 30.
Гарибова Л.В., Завьялова Л.А., Александрова Е.А., Никитина В.Е. Биология Lentinus edodes. 1. Морфолого-культуральные и физиолого-
биохимические особенности // Микология и фитопатология, 1999, 33, 2, с. 107-110.
Билай В.Т., Бисько Н.А., Володина Е.П., Дудка И.А. Разработка научных основ поверхностного культивирования грибов рода вешенка // Проблемы культивирования съедобных грибов в СССР. Пущино, 1991, с. 34-35.
Aytkhozhnina N.A., Kolokolova N.K. Characteristics of Kaszakhstan isolate of Sclerotinium sclerotiorum. Proc. of Sclerotinia // The XI Int. Sclerotinia
workshop, 2001, p. 21- 22.
Baum J.A., Johnson T.B., Carlton B.C. B. thurin-giensis. Natural and recombinant bioinsecticide products // Biopesticides. Use and Delivery, Hall F.R. and Menn J.J., Eds., Humana Press, Totowa, NJ, 1999, p. 189-209.
Faria M., Wraight S.P. Mycoinsecticides and My-coacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types // Biological Control, 2007, 43, p. 237-256.
Jackson M.A., Dunlap C.A., Jaronski S. Ecological considerations in producing and formulating fungal entomopathogens for use in insect biocontrol // Biological Control. 2010, 55, 1, p. 129-145.
Willetts H.J., Wong J.A.L. The biology of Sclerotinium sclerotiorum. S.trifoliorum and S.minor with emphasis on specific nomenclature // The Botanical review. 1980, 46, 2, p. 165.
Работа проводилась в рамках выполнения комплексного проекта "Разработка инновационной технологии комплексной переработки древесины лиственницы (с выводом на мировые рынки нового вида товарной целлюлозы)". Инициатором проекта «Лиственница» выступило ОАО «Группа «Илим» совместно с Санкт-Петербургским государственным технологическим университетом растительных полимеров. Проект осуществляется при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ.
THE PERSPECTIVES OF ARABINOGALAKTAN FOR CULTIVATION MICROBIOLOGICAL CONTROL AGENTS AND MUSHROOMS G.V.Mitina, S.V.Sokornova, L.G.Mahotina, A.G.Kuznetsov, E.L.Akim The possibility of using of arabinogalaktan (AG) as a carbon source for cultivation of microorganisms and inoculum of mushrooms on agar media is shown. The rate of growth of phytopathogenic micromycetes was equal or higher on the AG-media in comparing with the growth on the standard media. The rate of growth of mycelium of Pleurotus ostreatus was higher in two times on the AG-media. The growth of antagonists Bacillus subtilis was stimulated too by adding AG into agar media.
Keywords: arabinogalaktan, microbiological control, bioconversion, cultivation of micromycetes and bacteria.
Г.В.Митина, к.б.н., [email protected] С.В.Сокорнова, к.б.н., [email protected] Л.Г.Махотина, д.т.н., профессор, [email protected] А.Г.Кузнецов, аспирант , [email protected] Э.Л.Аким, д.т.н., профессор, [email protected]
