CC BY
15УДК 632.51:632.937.14
ПОЛУЧЕНИЕ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИТИКА ЭКСТРАКТОВ ГРИБА ЛБСОСИУТЛ ТиББ1ЬЛОШ1Б - ВОЗБУДИТЕЛЯ ПЯТНИСТОСТИ ЛИСТЬЕВ ОСОТА
ПОЛЕВОГО
А.О. Берестецкий, Е.В. Полуэктова
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург
Гриб Ascochyta ШввИси/тю - возбудитель пятнистости листьев осота полевого - трудноиско-ренимого многолетнего сорного растения. Известно, что грибы рода А5сосИу1а способны образовывать фитотоксины. Эти, как правило, низкомолекулярные соединения, могут служить прообразом новых гербицидных веществ. В задачи работы входило определение подходов для выделения комплекса фитотоксических метаболитов из культурального фильтрата и мицелия А. tussilaginis, полученных при помощи жидкофазной и твердофазной ферментации, соответственно, а также спектра биологической активности экстрактов. Культуральный фильтрат проявил заметную фитотоксическую активность уже на 7 сутки поверхностного роста гриба на среде М-1-Б и на 28 сутки - на модифицированной среде Чапека. В культуральном фильтрате А. tussilaginis обнаружены две группы фитотоксических соединений - гидрофобные и гидрофильные. Выход экстрактивных веществ из мицелия, полученного на зерновых субстратах, был примерно на порядок выше, чем выход экстрактов из культурального фильтрата. При этом фи-тотоксическая активность мицелиальных экстрактов была в 1.5-2 раза выше, чем фитотоксич-ность экстракта культурального фильтрата. Изученные метаболитные комплексы А. tussilaginis не обладали селективностью.
Ключевые слова: Ascochг/ta tussilaginis, экстракты, биологическая активность.
В результате изучения микобиоты растений рода Sonchus на территории Российской Федерации и сопредельных государств обнаружено широкое распространение пикнидиального гриба Ascochyta tussilaginis Oud. - возбудителя пятнистости листьев и стеблей осота полевого (S arvensis L.) (Гасич и др., 1999). Поражение осота этим патогеном наблюдалось в ранние фазы его развития, что в конце сезона могло вызвать усыхание до 50% листовой поверхности. Образование некротических пятен на листьях и стеблях сорняка в результате поражения патогеном может быть результатом действия его фитотоксинов. По литературным данным, грибы рода Ascochyta способны к образованию различных фито-токсинов, весьма разнообразных по химической структуре: поликетиды, гетероциклические соединения, белки и другие (Успенская, Решетников, 1975; Evidente et al., 1996; Strange, 1997).
Изучение токсинов фитопатогенных грибов интересно с нескольких точек зрения. Во-первых, эти вещества могут быть использованы для определения механизмов патогенности их продуцентов;
во-вторых, фитотоксины могут представлять интерес как гербицидные вещества природного происхождения (Берестецкий, 2008; Бауап et а1., 2012). Если фито-патоген рассматривается как потенциальный микогербицид, обязательна токсикологическая характеристика его экстрактов и чистых метаболитов (Hoag1and et а1., 2007).
Наши предварительные эксперименты показали, что культуральный фильтрат гриба обладает фитотоксической активностью (Берестецкий, Пархоменко, 2004). Целью данной работы было разработать методические подходы к выделению фи-тотоксических метаболитов из культу-рального фильтрата и мицелия А. tussгlagгnгs. В задачи исследования входило: 1) подобрать жидкие питательные субстраты и сроки поверхностного культивирования гриба; 2) оптимизировать способ получения фитотоксичных экстрактов из культурального фильтрата; 3) определить выход экстрактов из культуры гриба, полученной на зерновых субстратах; 4) установить спектр биологической активности и специфичность наиболее фитотоксичных экстрактов.
Методика
В работе использован изолят S-112 гриба Ascochyta tussilaginis Oud., который был выделен из листьев осота полевого, пораженных пятнистостью. Определение вида проведено по монографии В.А.Мельника (1977). Гриб хранили в пробирках на скошенном картофельно-глюкозном агаре (КГА) стандартного состава при температуре 5°С. В качестве посевного материала использовали 2-недельную культуру гриба, выращенную на КГА при температуре 24°С.
A. tussilaginis S-112 выращивали в поверхностной культуре на трех жидких синтетических питательных средах и на двух видах твердого зернового субстрата. Состав жидких питательных сред приведен ниже.
Модифицированная среда Чапека (МЧ): глюкоза - 45 г, NaNO3 - 3 г, KH2PO4 - 1 г, MgSO4 47 H2O - 0.5 г, CaCl242 H2O - 0.1 г, H3BO3 - 10 мг, ZnSO447 H2O - 4 мг, FeSO4 - 4 мг, MnCl244 H2O - 4 мг, тиамин - 100 мкг, биотин - 5 мкг, pH=6 (стерилизация при 109°С 20 мин).
Глюкозо-аспарагиновая среда (ГА) (по Лилли, Бар-нетт, 1953): глюкоза - 20 г, аспарагин - 2 г, KH2PO4 - 1 г, MgSO4x7 H2O - 0.5 г, тиамин - 0.1 мг, биотин - 0.005 мг, pH=6 (стерилизация при 109°С 20 мин).
Среда M-1-D (по Pinkerton, Strobel, 1976): Ca(NO3)2x4 H2O - 0.4 г, KNO3 - 0.1 г, KCl - 0.07 г, NaH2PO4412 H2O - 0.02 г, сахароза - 28 г, (CHOHCOONH4)2 - 5 г, FeSO4 - 0.004 г , ZnSO4x7 H2O - 0.004 г, H3BO3 - 0.001 г, KI - 0.001 г, MnCl2x4 H2O - 0.004 г, MgSO4x7 H2O - 3.6 г, pH=6 (стерилизация при 12ГС 20 мин).
Зерновые субстраты (пшено и перловая крупа) готовили следующим способом. В 100-мл конические колбы вносили 20 г крупы и добавляли 12 мл водопроводной воды. Субстрат стерилизовали автокла-вированием в течение 30 мин при температуре 12ГС.
Стерильные субстраты инокулировали двумя ми-целиальными блоками диаметром 5 мм, вырезанными из края растущей посевной культуры гриба.
Для изучения динамики фитотоксической активности культурального фильтрата в зависимости от состава жидкой питательной среды гриб культивировали в конических колбах объемом 250 мл с 50 мл среды (МЧ, ГА и M-1-D) в течение 28 суток при 24°С без встряхивания. Каждые 7 суток из колб отбирали пробы по 1 мл для определения рН и фитотоксической активности. По окончанию ферментации определяли сухую массу мицелия. Опыт проведен в 5 повторностях.
Для оптимизации экстракции токсинов из культу-рального фильтрата гриб культивировали в 2-л матрацах с 300 мл жидкой средой M-1-D при комнатной температуре. Через 3 недели инкубации культураль-ный фильтрат экстрагировали органическими растворителями двумя нижеописанными способами.
Для определения влияния кислотности среды на стабильность и выход фитотоксических метаболитов гриба pH культурального фильтрата доводили до 2, 5.5 и 9 при помощи 1 н растворов гидрок-сида натрия и соляной кислоты. Затем 100 мл КФ различной кислотности и контроль (без изменения рН) экстрагировали тремя порциями по 50 мл эти-лацетата.
С целью определения лучшего растворителя для экстракции фитотоксических веществ культу-
исследований
ральный фильтрат (200 мл) экстрагировали последовательно н-гексаном, диэтиловым эфиром и эти-лацетатом - каждым растворителем тремя порциями по 100 мл.
Остаток воды в экстрактах удаляли при помощи фильтрования через слой безводного сульфата натрия. Растворитель упаривали при 40°С с помощью роторного испарителя. Затем определяли массу сухих остатков и фитотоксическую активность экстрактов.
Часть водной фазы (100 мл), оставшейся после экстракции неподкисленного культурального фильтрата этилацетатом, лиофилизировали. Сухой остаток доводили дистиллированной водой до объема 10 мл, вносили в центрифужную пробирку с фильтром (концентратор центрифужный Amicon Ultra-15 с размером пор 10 кДа, Millipore, США) и подвергли ультрафильтрации при помощи центрифугирования (4 мин, 5000 об/мин). Для проверки термостабильности веществ в высокомолекулярной фракции 100 мкл раствора выдерживали 10 мин при температуре 90°С на водяной бане.
Для экстракции токсинов из зерновых субстратов гриб культивировали на зерновом субстрате 12 суток, встряхивая колбы каждые два дня для предотвращения образования комков. По окончанию ферментации обросший мицелием гриба субстрат (100 г) высыпали тонким слоем на поддоны и сушили 3 суток при комнатной температуре. Сухой биоматериал помещали в 1-л коническую колбу, заливали 500 мл смеси ацетона с 2%-ным раствором хлорида натрия в соотношении 1:1 и встряхивали на орбитальной качалке (180 об/мин) 1 ч. Экстракцию повторяли - биоматериал заливали новой порцией экстрагента и перемешивали на качалке 24 ч. Полученные вытяжки объединяли. После упаривания ацетона, водную фазу фильтровали через бумажный фильтр и экстрагировали этилацетатом (тремя порциями по 250 мл). Экстракты обезвоживали над слоем безводного сульфата натрия. Растворитель упаривали при 40°С. Затем определяли массу сухих остатков и фитотоксическую активность экстрактов.
Для оценки фитотоксической активности куль-турального фильтрата и экстрактов использовали высечки из листьев осота, выращенного в тепличных условиях из отрезков подземных побегов до фазы розетки. Для оценки специфичности фито-токсического действия экстрактов использовали высечки или отрезки листьев растений, принадлежащих к различным семействам: бодяк полевой (Cirsium arvense (L.) Scop.), осот полевой (Sonchus arvensis L.), крестовник (Senecio vulgaris L.), конопля (Cannabis sativa L.), пырей (Elytriga repens (L.) Desv. ex Nevski), капуста (Brassica oleracea var. oleracea L. ), рожь (Secale cereale L. ), картофель (Solanum tuberosum L.).
Фитотоксичность экстрактов оценивали в концентрации 5 мг/мл. Перед проведением биотестов 1 мг экстракта растворяли в 10 мкл 96%-ного этанола и доводили объем водой до 200 мкл. Конечная концентрация этанола составляла 5%, в которой он был нетоксичен. Из листьев среднего яруса 3-5-недельных двудольных растений пробочным сверлом вырезали диски 1 см в диаметре. Листья ржи нарезали на отрезки длиной 5 см. Листовые высеч-
ки и отрезки переносили на увлажненную водой фильтровальную бумагу в прозрачные пластиковые контейнеры. Перед нанесением капли тест-образца в их центре острой иглой делали надкол, повреждая верхний эпидермис. Каплю тестируемого образца (10 мкл), наносили в центр листового диска с верхней стороны. Учет симптомов (диаметр некрозов) проводили через 48 ч инкубирования при температуре 24°С и переменном искусственном освещении (12 ч в день). В контроле использовали стерильные жидкие питательные среды и экстракты субстратов в концентрации 2.5 мг/мл.
Антимикробную активность экстрактов оценивали стандартным методом бумажных дисков в концентрации 200 мкг/диск. В качестве тест-
организмов использовали дрожжевой гриб (Geotri-hum candidum), Грам+ и Грам-бактерии (Bacillus subtilis и Pseudomonas fluorescens, соответственно).
Зоотоксическую активность экстрактов в концентрации 8, 40 и 200 мкг/мл оценивали с помощью стандартного метода определения токсичности грибных метаболитов с использованием в качестве тест-организмов рачков Artemia salina (Harwig, Scott, 1971) как описано у M.Abouzeid c соавторами (2004). В контроле использовали экстракты соответствующих питательных субстратов. Низкотоксичными считали экстракты при гибели рачков до 10%, средне токсичными - на уровне 10-50%, высокотоксичными на уровне более 75% через 24 ч после начала эксперимента.
Результаты исследований
Фитотоксическая активность культу-рального фильтрата проявилась на 7 сутки роста А. Шззйадтгз на всех трех изученных жидких питательных средах. Токсичность фильтрата недельной культуры гриба, выращенной на среде М-1-Ю, была существенно выше, чем фильтрата 7-суточной культуры, полученной на других средах. При этом она достигала своего максимума (диаметр некроза около 1.5 мм), в дальнейшем незначительно снижалась и менялась несущественно.
Аналогично при росте гриба на среде ГА заметная фитотоксичекая активность культурального фильтрата проявилась через неделю культивирования и в дальнейшем существенно не менялась. Через 7 суток роста на среде МЧ фитотоксиче-ская активность гриба была слабой (диаметр некроза около 0.7 мм). На 14 сутки ферментации фитотоксичность культу-рального фильтрата существенно снизилась. Однако в течение двух последующих недель наблюдали повышение активности гриба. На 28 сутки токсичность 1,6
1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
М-1-D ^
/ ____*— 7*
/ /
/ ' А- ГА ^^
/
/ //
МЧ
у
0 7 14 21 28
Пролжительность ферментации, сутки
А, НСР= 0.2
культурального фильтрата была максимальной, диаметр некроза достигал в среднем 1.5 мм. Все три питательные среды в контроле вызывали слабые некротические реакции на листовых дисках осота. Относительно высокую активность проявила среда М-1-Ю (диаметр некроза около 0.3 мм). Возможно, это связано с высокой концентрацией сахаров и солей, входящих в ее состав. Токсичность других сред была несущественной (рис. 1А).
Наблюдали заметные различия в изменении рН культуральной жидкости в процессе культивирования А. ЫзвИадтв на изученных питательных средах. Так, в ходе поверхностного роста гриба на средах МЧ и ГА происходило подщелачи-вание культуральной жидкости. Причем повышение рН в среде МЧ происходило быстрее (рис. 1Б). При росте гриба на среде М-1-Ю первые две недели значение рН культуральной жидкости постепенно снижалось с 6 до 5. В течение двух последующих недель ее кислотность оставалась практически неизменной (рис. 1Б).
рН 7
- Р ' М-1-D
/ ---- ГА
Jv;—~ ——<>
~ ~ -А- _ _ МЧ
0 7 14 21 28
Продолжительность ферментации, сутки
Б, НСР= 0.3
Рис. 1. Динамика фитотоксической активности (А) и рН (Б) культурального фильтрата при поверхностном культивировании А. tгlssгlagгnгs (штамм 8-112) в зависимости от состава жидкой
питательной среды
9
8
6
5
4
Обнаружена статистически достоверная (р<0.05) корреляция между значением рН культурального фильтрата, полученного на различных средах, и его фи-тотоксичностью. Между фитотоксично-стью культурального фильтрата и рН среды связь была обратная (г= -0.76); для среды ГА и МЧ связь оказалась прямая (г = 0.61 и 0.71 соответственно).
Выход экстрактивных веществ из 28-суточного культурального фильтрата гриба, выращенного на среде М-1-Ю, был почти в два раза выше по сравнению с выходом экстрактивных веществ из культурального фильтрата гриба, выращенного на других средах (табл. 1). Однако максимальную фитотоксичность проявил экстракт, полученный из куль-турального фильтрата гриба, выращенного на среде ГА.
Таблица 1. Выход экстрактивных веществ и фитотоксичность экстрактов культурального фильтрата А. Ыввйадгпгв в зависимости от состава жидкой питательной среды на 28 сутки культивирования
Среды Выход экстрактивных веществ, (мг/л) Фитотоксическая активность экстрактов (некроз, мм)
М-1-Б 42.0 0.8
ГА 20.8 1.5
МЧ 24.4 0.5
НСР.05 5.0 0.2
Токсичность КФ и экстрактов, полученных из них, была различной (рис. 1А, табл. 1). Возможно, это связано с тем, что в органическую фазу переходили не все токсины, находящиеся в культуральной жидкости. Для подтверждения этого предположения сконцентрированную в 10 раз водную фазу подвергли ультрафильтрации. Как низкомолекулярная, так и высокомолекулярная фракции (масса веществ более 10 кДа) обладали фитотоксической активностью (диаметр некротического пятна на листовых дисках осота в обоих случаях достигала 2 мм). Выдерживание раствора, содержащего высокомолекулярные соединения гриба, 10 мин при температуре 90°С не привело к снижению его биологической активности.
Учитывая раннее проявление фито-токсической активности культурального фильтрата и относительно высокий выход экстрактивных веществ, для дальнейших исследований гриб культивировали на среде М-1-Ю. Обнаружен низкий уровень извлечения экстрактивных веществ из 21-суточного культурального фильтрата гриба гексаном и отсутствие фитотоксической активности соответствующих экстрактов. Последующий экстракт водной фазы диэтиловым эфиром (выход около 15 мг/л) обладал максимальной фитотоксичностью по сравнению с другими вариантами экстракции (табл. 2).
Масса экстрактивных веществ, полученных в результате последующей экстракции водной фазы этилацетатом, была примерно в 2 раза выше, чем в эфирном экстракте. Однако активность этила-цетатного экстракта была существенно ниже (табл. 2).
Таблица 2. Влияние полярности растворителя на выход экстрактивных веществ и их фито-_токсическую активность_
Выход экс- Фитотоксическая
Раствори- трактивных активность экс-
тели веществ, трактов (некроз,
мг/л мм)
Гексан 4.5 0
Диэтиловый 14.5 1.2
эфир
Этилацетат 26.5 0.5
НСР.05 4.1 0.2
Выявлен значительный эффект рН культурального фильтрата на выход экстрактивных веществ и фитотоксичность соответствующих этилацетатных экстрактов (табл. 3).
Таблица 3. Влияние значения рН среды на выход экстрактивных веществ и их фитотоксическую активность
рН Выход экстрактивных веществ, мг/л Фитотоксическая активность экстрактов (некроз, мм)
2 56.2 2.7
5 44.4 1.3
9 40.5 0.9
Контроль 32.1 1.0
(рН5.5)
НСР.05 3.5 0.4
Максимальную относительно других способов экстракции фитотоксическую активность проявил этилацетатный экстракт культурального фильтрата, подкисленного до pH2. При этом выход экстрактивных веществ в этом варианте также был максимальным (около 56 мг/л). Подщелачивание культурального фильтрата приводило к снижению выхода экстрактивных веществ, а также к понижению фитотоксической активности экстрактов. В контроле экстракт культурального фильтрата (рН5.5 без модификации) проявил низкую токсичность (табл. 3). Возможно, фитотоксичные низкомолекулярные метаболиты A. tussi-laginis обладают кислотными свойствами. Так, типичный метаболит грибов рода Ascochyta - аскохитин - обладает слабокислыми свойствами и хорошо извлекается из подкисленного до рН3 культурального фильтрата (Marcinkowska et al., 1991; Beed et al., 1994).
Твердые субстраты часто используются для культивирования грибов с целью получения биологически активных соединений (Robinson et al., 2001; Бере-стецкий, 2008). Мицелий A. tussilaginis хорошо рос на используемых в эксперименте зерновых субстратах - пшене и перловой крупе. В первую неделю культивирования гриб образовывал белый пушистый мицелий; в дальнейшем на субстрате обильно формировались мик-росклероции.
Выход экстрактивных веществ из мицелия A. tussilaginis вместе с колонизированным твердым субстратом составил около 900 мг/кг. Существенных различий по выходу и активности экстрактивных веществ из биоматериала, полученного на пшене и перловой крупе, не выявлено (табл. 4). В контроле фитотоксической активности не обнаружено.
Селективность действия комплекса метаболитов наиболее активных экстрактов (этилацетатный экстракт из культу-рального фильтрата, подкисленного до рН2, и экстракт из мицелия A. tussilaginis, выращенного на перловой крупе) была оценена на листовых высечках 8 видов растений различных семейств.
Таблица 4. Выход экстрактивных веществ и фитотоксическая активность экстрактов в зависимости от вида зернового субстрата
Субстраты Выход экстрактивных веществ, мг/кг Фитотоксическая активность экстрактов (некроз, мм)
Перловая 855.0±45.22 3.4±0.87
крупа
Пшено 972.5±33.56 2.5±0.37
Все испытанные тест-растения, за исключением конопли, были чувствительны к экстрактам, полученным обоими указанными способами. Сильное развитие некрозов отметили на листовых высечках осота и листовых отрезках ржи. Следовательно, эти растения могут в дальнейшем быть использованы как индикаторные для выделения индивидуальных фитотоксических соединений. В целом, экстракт из подкисленного КФ был значительно менее активным, чем экстракт мицелия, полученного при помощи твердофазной ферментации (рис. 2). Экстракты из питательных субстратов фитотоксической активности не проявили.
1.5
& 1
0.5
■HI
1 2 3 4 5 6 7 8
Рис. 2. Оценка специфичности различных экстрактов, полученных при культивировании А. Ыввйадгпгв на перловой крупе и М-1-О рН2. 1- осот, 2- крестовник, 3- бодяк, 4-капуста, 5- картофель, 6- конопля, 7- пырей, 8- рожь (НСР05=0,5)
Оба экстракта не проявили активности в отношении О. сапс!гс1ит и Р. /¡ио-тевсепв, однако Грам+ бактерия - В. виЪ-иЫв была слабочувствительна (диаметр зоны отсутствия роста 4±0.1 мм) к экстракту мицелия, полученного на твердом
2
субстрате, и умеренно чувствительна (диаметр зоны отсутствия роста 5.5±0.2 мм) к экстракту КФ. У грибов рода Asco-chyta известны метаболиты с антимикробной активностью. Так, аскохитин обладал широким спектром антимикробной активности. Причем, B. subtilus относился к одному из наиболее чувствительных к нему организмов (Oku, Nakanishi, 1963). Из гриба A. salicorniae был выделен алкалоид с умеренной активностью против B. megaterium (Osterhage et al., 2000).
Экстракт КФ не проявил зоотоксиче-ской активности в изученных концентрациях. Слабая активность экстракта мицелия (гибель около 25% личинок), достоверно отличающаяся от контроля, была заметна при концентрации 8 мкг/мл. При концентрации 200 мкг/мл через 24 ч погибло около 50% личинок A. salina (рис. 3). Действие микотоксинов на рачков проявляется в концентрации 0.1-10 мкг/мл (Harwig, Scott, 1971). Можно предположить, что метаболитный комплекс гриба содер-
Вестник защиты растений, 3, 2012 жит зоотоксичный компонент.
0 8 мкг/мл 40 200
Рис. 3. Зоотоксичность экстракта мицелия A. tussilaginis S-112, полученного при культивировании на перловой крупе, для Artemia salina через 24 ч после обработки (НСР.о5=16.1)
Таким образом, экстракт, полученный из мицелия A. tussilaginis S-112, обладал средней степенью зоотоксичности, что должно учитываться как при выделении метаболитов этого гриба, так и при его дальнейшей токсикологической характеристике как потенциального микогербицида.
Выводы
Высокий уровень токсичности куль-турального фильтрата при культивировании А. tussilaginis на среде М-1-Ю отмечен уже на 7 сутки роста.
На среде М-1-Ю гриб образовывал две группы фитотоксических соединений: липофильные с кислотными свойствами и термостабильные гидрофильные.
Для извлечения первой группы веществ предлагается подкисление куль-турального фильтрата и экстракция ди-этиловым эфиром или этилацетатом. Для выделения веществ второй группы водную фазу, оставшуюся после экстракции веществ первой группы, следует концентрировать и подвергнуть ультрафильтрации.
Выход экстрактивных веществ из мицелия гриба, выращенного на твердых зерновых субстратах, был на порядок
выше, чем выход экстрактивных веществ из КФ при оптимизированном способе экстракции.
Фитотоксическая активность экстрактов из биоматериала, полученного при помощи твердофазной ферментации, была в 1.5-2 раза выше, чем экстрактов из КФ.
Фитотоксичные экстракты не обладали специфичностью. Они проявили слабую антибактериальную активность в отношении B. subtilis. Экстракт из мицелия A. tussilaginis проявил также умеренную зоотоксическую активность в отношении Artemia salina.
Учитывая сравнительно высокий выход экстрактивных веществ из мицелия гриба, дальнейшее выделение и очистка фитотоксинов A. tussilaginis представляется перспективным делом.
Литература
Берестецкий АО. Фитотоксины грибов: от фундаменталь- ратуры, освещения и источников питания на морфолого-ных исследований - к практическому использованию (Обзор) // культуральные свойства А$соеку1а tussilaginis // Миколо-Прикладная биохимия и микробиология, 2008, 44, 5, с. 501-514. гия и фитопатология, 2004, 38, 2, ^ 78-88.
Берестецкий А.О., Пархоменко Н.В. Влияние темпе- Методы экспериментальной микологии. Билай В.И.
(ред.). Справочник. Киев: Наукова думка, 1982. 550 с.
Гасич Е.Л., Титова Ю.А., Берестецкий А.О., Жаров В.Р. Микобиота сорных растений европейской части России: итоги исследований 1993-1998 гг. ВИЗР, СПб, 1999. 84 с.
Лилли В., БарнеттГ. Физиология грибов. М., 1953, 531 с.
Мельник В. А. Определитель грибов рода Ascochyta Lib. Л., Наука, 1977, 246 с.
Успенская Г.Д., Решетников И.А. О токсинах сфероп-сидальных грибов // Микология и фитопатология, 1975, 9, 4, с. 355-357.
Abouzeid M. A., Boari A., Zonno M. C., Vurro M., Evidente A. Toxicity profiles of potential biocontrol agents of Orobanche ramosa // Weed Science, 2004, 52, p. 326-332.
Beed F. D., Strange R. N., Onfroy C., Tivoli B. Virulence for faba bean and production of ascochitine by Ascochyta fa-bae // Plant Pathol., 1994, 43, p. 987-997.
Dayan F.E., Owens D.K., Duke S.O. Rationale for a natural products approach to herbicide discovery // Pest Manag.Sci., 2012, 68, 4, p. 519-528.
Evidente A., Capasso R., Motta A., Andolfi A., Vurro M., Zonno M. C., Bottalico A. Toxic metabolites from phytopathogenic Ascochyta species // Boll. Chim. Farm., 1996, 135, 9, p. 552-555.
Harwig J., Scott P.M. Brine shrimp (Artemia salina L.) larvae as a screening system for fungal toxins. Appl. Microbi-ol., 1971, 21, 6, p. 1011-1016.
Hoagland R. E., Boyette C. D., Weaver M. A., Abbas H. K. Bioherbicides: research and risks // Toxin Reviews, 2007, 26, p. 313-342.
Marcinkowska J., Klos B., Shcherbakova A. Ascochitine production by fungi responsible for Ascochyta diseases of pea // J. Phytopathol., 1991, 131, p. 253-258.
Oku H., Nakanishi Т. A toxic metabolite from Ascocliyta fabae having antibiotic activity // J. Phytopathol., 1963, 53, p. 1321-1325.
Osterhage C., Kaminsky R., Konig G. M., Wright A. D. Ascosalipyrrolidinone A, an antimicrobial alkaloid, from the obligate marine fungus Ascochyta salicorniae // J. Org. Chem., 2000, 65, p. 6412-6417.
Pinkerton F., Strobel G.A. Serinol as an activator of toxin production in attenuate cultures of Helminthosporium saccha-ri // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1976, 73, p. 4007-4011.
Robinson T, Singh D, Nigam P. Solid-state fermentation:a promising microbial technology for secondary metabolite production // Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, 55, 3, p. 284-289.
Strange R.N. Phytotoxins associated with Ascochyta species // Toxins in plant disease development and evolving biotechnology. Editors: Upadhyay, R.K. and Mukerji, K.G. Oxford and IBN Publishing Co. Pvt. Ltd. 1997, p. 167-181.
Strange R.N. Phytotoxins produced by microbial plant pathogens // Nat. Prod. Rep., 2007, 24, 1, p. 127-144.
Благодарим сотрудников ВИЗР В.В.Долгих и Г.Р.Леднева, студента СПбГАУ П.А.Прокофьева за помощь в выполнении работы.
Работа выполнена при поддержке Государственного контракта 16.518.11.7068.
PRODUCTION AND BIOLOGICAL CHARACTERISTIC OF EXTRACTS OF ASCOCHYTA TUSSILAGINIS - ACTIVATOR OF LEAF SPOT OF SOW THISTLE
A.O.Berestetskii, E.V.Poluektova The fungus Ascochyta tussilaginis is a causal agent of leaf spot of Sonchus arvensis (perennial sow thistle). It is well known that the fungi of this genus are capable of producing phytotoxins. These, commonly low molecular weight compounds, could be templates for the synthesis of new herbicides. The research was focused on determination of approaches for isolation of phytotoxins from culture filtrate and mycelia of A. tussilaginis produced in liquid and solid cultures, as well as on bioactivity of extracts. Selection of different liquid media showed moderate phytotoxicity of culture filtrate obtained on the 7th day of growth on M-1-D medium and on the 28th day of growth on a modified Czapek medium. When grown on M-1-D medium, A. tussilaginis was found to produce both lipophilic and hydrophilic crude phytotoxic compounds. Their isolation techniques were described. When the fungus was cultured on solid media, its extract yield was about ten-fold higher than the yield of extract matter from culture filtrate. At the same time the phytotoxic activity of extracts from solid cultures of the fungus was 1.5-2 times higher than that of extracts produced from culture filtrate. Phytotoxic extracts did not possess selectivity to the most of studied plants and showed weak antibiotic activity.
Keywords: Ascochyta tussilaginis, extracts, phytotoxins.
А.О.Берестецкий, к.б.н., aberestetski@yahoo.com Е.В.Полуэктова, аспирант, catcatwow@mail.ru
