CC BY
22
regulation of the functions of HRV are shown: scatter (parasympatotonia) and concentration (sympathotonia). Under physiological conditions, it was established: in the arab, latin-american, and russian groups, at both stages and at the first stage, the stabilization function of HRV prevailed in the indian group; in the african group at both stages and in the indian at the second - the function of the spread of HRV in the values of RRNN. According to the SDNN values, only the african group at the 1st stage was dominated by the scatter function of HRV, while for the other groups, the function of its stabilization prevailed. In terms of the RMSSD parameter, all groups were dominated by the spread function of HRV, most pronounced at the 1st stage by the indian, african, and latin-fmerican groups, and the stabilization function of HRV was detected only at the 2nd stage by the latin- american and russian groups. According to pNN50%, the stabilization function of the HRV was found in the arabic and russian groups at both stages and in the latin- american at the first stage, the scatter function of the HRV in the indian and african groups at both stages, and in the latin-american at the second.
DOI 10.31588/2413-4201-1883-239-3-22-26 УДК 619:611.018:615.014.41:576. 809.33
ВЛИЯНИЕ ЦИТОКИНОВ НА КАРИОЛОГИЧЕСКУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ
КУЛЬТУР КЛЕТОК
Архарова И.А. -мл. науч. сотр.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»
Ключевые слова: кариология, культура клеток, хромосомные аберрации, цитокины, питательные среды.
Keywords: caryology, cell culture, chromosomal aberrations, cytokkens, cultures medium
Растущие масштабы производства диагностических и лечебно-профилактических препаратов требуют совершенствования технологии культивирования клеток. Клеточная культура - один из основных инструментов, используемый в разнообразных биомедицинских исследованиях. Для получения требуемого количества клеточного материала необходима экспансия клеток, т.е. размножение в достаточном количестве [2]. Большую роль в этом играет подбор оптимальной среды культивирования, использование кондиционированной клетками среды и наличие различных факторов, влияющих на деление клеток. С этой точки зрения весьма привлекательным выглядит добавление в среду ростовых факторов в т.ч. цитокинов.
Согласно данным ряда исследователей [1] цитокины представляют собой регуляторные пептиды, которые продуцируются почти всеми эукариотически-ми клетками. Цитокины оказывают влияние практически на все клетки, воздейст-
вуя на большинство процессов, протекающих в организме [6].
Общий термин «цитокин» охватывает ряд определенных полипептидов. Последние представляют собой систему информации клеток, как в качестве сигнальных молекул, так и в качестве факторов роста и ингибирования, а также эти молекулы взаимодействуют с клетками с помощью специальных рецепторов.
Цитокины - это ключевые молекулы клеточного контроля. В результате многочисленных исследований к настоящему времени обнаружен ряд биологических эффектов цитокинов: иммуностимулирующий, противовирусный, антибактериальный и др. Поддерживаемые в коллекциях клеточные культуры должны сохранять исходные для популяции свойства и особенности генотипа, которые указывают на их чистоту [4, 5]. Использование клеток с отсутствием идентификационных характеристик ставит под сомнение объективность полученных результатов.
С этой целью широко используются методы цитогенетических исследований, позволяющие контролировать генетическое постоянство клеток по характеристике и набору хромосом [1]. С учетом актуальности проблемы, целью работы явилось изучение кариологических свойств культуры клеток MDBK, BHK-21-13/02, выращенных на цитокинсодержащей среде.
Материал и методы исследований. Для проведения исследований в качестве тест-культур клеток использовали перевиваемые клеточные линии MDBK, BHK-21-13/02 из коллекции ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». В качестве потенциальных стимуляторов роста культивируемых клеток in vitro оценивали различные концентрации препаратов цитоки-нов (IL-6, G-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), Санкт-Петербург)). Перевиваемые линии культур клеток культивировали по общепринятой методике в стандартных условиях [3]. Для выращивания культуры клеток применяли питательные среды: 199, Игла МЕМ, ДМЕМ, ГЛА с добавлением в них сывороток крови, как взрослого крупного рогатого скота, так и плодов коров в концентрации 10%, антибиотиков (бензил-
Из данных рисунка 1 видно, что число хромосом в клетках, выращенных в цитокинсодержащей среде, колеблется от 36-75. Полученные данные показывают, что модальный класс метафазных пласти-
пенициллина натриевой соли, стрептомицина сульфата, канамицина сульфата, ам-фотерицина В по 100 Ед/мл) и глутамина. Для снятия клеток со стекла при их пересевах применяли раствор трипсинверсена (1:3). Клетки инкубировали в культураль-ных флаконах (матрасах) при 37°С в атмосфере 5% СО2. Согласно общепринятой в микробиологии методике. Препараты для рутинного цитогенетического исследования перевиваемых линий клеток готовили по общепринятой методике [7]. Для цитологического (кариологического) анализа хромосомные препараты готовили стандартным колхициновым методом с последующей окраской 2%-ным водным раствором Гимза. Для определения модального класса и интервала изменчивости по числу хромосом в перевиваемых линиях клеток анализировали по 100 метафазных пластинок на уровне 15 пассажа.
Результаты исследований. Карио-логический анализ, проводили путем подсчета хромосом в 100 метафазных пластинках. Всего было проанализировано 600 метафазных пластинок. Результаты проведенного по стандартной методике кариологического анализа представлены на рисунке 1 и 2.
метафазных пластинках культуры клеток
нок клеток MDBK, выращенных в присутствии сыворотки крови крупного рогатого скота, составил 46-50 хромосом, а содержание метафазных пластинок с этим модальным классом - 34%. Модальный класс
н
я
40
■л
I 3 35
30 Й о 25
9120
3 Ц 15
щ
н « 10
4 Г
s § 5
^ 0
1 л
1 1 .
1 ■ 1 1 1
1 1 П ■
L II 11 1
1П1 Я.
■ г 1 j ь
IL-6
G-CSF
СККРС
36-40 41-45 46-50 51-55 56-60 61-65 66-70 71-75 распределение хромосом в метафазных пластинках
Рисунок 1 - Распределение хромосом в
MDBK
метафазных пластинок клеток MDBK, выращенных на цитокинсодержащей среде, также составил 46-50 хромосом, а содержание метафазных пластинок с этим модальным классом -36% (ГЬ-6) и 32% CSF).
В следующей серии опытов изучали изменения на хромосомном уровне культуры клеток ВНК-21-13/02, выращенных на среде Игла МЕМ с добавлением цитокинов (IL-6, G-CSF) результаты исследований представлены на рисунке 2.
}исунок 2 - Распределение хромосом в метафазных пластинках культуры клеток ВНК-21-13/02
Из рисунка 2 видно, что количественный разброс хромосом в метафазных пластинках клеток ВНК-21-13/02, выращенных на цитокин-содержащей среде, колеблется от 36-70. Модальный класс метафазных пластинок клеток BHK-21-13/02, MDBK выращенных в присутствии сыворотки крови крупного рогатого скота, составил 41-45 хромосом при количестве метафазных пластинок с этим модальным классом - 40%. Модальный класс мета-фазных пластинок клеток, выращенных на цитокинсодержащей среде, составил также 41-45 хромосом, а содержание метафазных пластинок с этим модальным классом 39% (ГЬ-6) и 41% (G-CSF).
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что модальный класс хромосомных пластинок соответствует паспортным характеристикам перевиваемых культур клеток MDBK, ВНК-21-13/02 и они сохраняют высокий уровень кариологической стабильности в процессе длительного культивирования. В последующем течение 35 последовательных пассажей культуры сохранили свои основные цитомор-фологические характеристики и ростовые свойства. Монослой
состоял из эпителиоподобных, плотно прилегающих друг к другу клеток, пролонгированной формы без зернистости цитоплазмы. Клетки при пересеве с коэффициентом 1 : 2 -1 : 3 формировали конфлю-энтный монослой на 3-4 сутки культивирования. В результате проведенных исследований на вышеперечисленных бактериальных средах было установлено, что культуры клеток MDBK, ВНК-21-13/02 оказались стабильными.
Заключение. Ростовые, цитомор-фологические свойства и кариологические характеристики клеток линий MDBK, ВНК-21-13/02 на протяжении не менее 35 непрерывных циклов стационарного культивирования при отработанных технологических режимах являются стабильными. Перевиваемая линия клеток MDBK, ВНК-21-13/02 соответствуют предъявляемым к ней требованиям и может использоваться в исследовательской и диагностической работе для наращивания вирусной массы с целью получения вакцинных препаратов для профилактики вирусных заболеваний животных.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Адамс, Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Р. Адамс; пер. с англ. М.А. Пановым; ред. В.Ю. Поляков // М.: Мир. - 1983. - 313с.
2. Данлыбаева, Г.А. Влияние анти-оксидантов и витаминов на функциональную активность клеток человека в условиях in vitro / Г.А. Данлыбаева // Биотехнология. Теория и практика. - 2016. - №1. -С.4-13.
3. Дьяконов, Л.П. Животная клетка в культуре / Л.П. Дьяконов, В.И. Ситьков // М.: «Компания Спутник+», 2009. - 656 с.
4. Орлов, А.П. Вопросы стандартизации клеток-продуцентов для биотехнологии / А.П. Орлов, Т.М. Каргина, Е.И.
Саканян и др. // Биотехнология. - 2017. -Т. 33. - № 3. - С. 81-87.
5. Lallinger, G. Cold storage and cry-opreservation of tick cell lines / G. Lallinger et al. // Parasites & Vectors. - 2010. - Vol. 37. - № 3. - P.1-5.
6. Mehrabani, D. Establishment, characterization and cryopreservation of Fars native goat fetal fibroblast cell lines / D. Mehrabani, M. Tajedini, A. Tamadon et al. // Asian Pacific Journal of Reproduction. -2016. - Vol. 5. - № 3. - P. 247-251.
7. Moorhead, P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains / P.S. Moorhead // Exp. Cell Res. - 1960. - P. 585621.
ВЛИЯНИЕ ЦИТОКИНОВ НА КАРИОЛОГИЧЕСКУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ
КУЛЬТУР КЛЕТОК
Архарова И.А.
Резюме
Поддерживаемые в коллекциях клеточные культуры должны сохранять исходные для популяции свойства и особенности генотипа, которые указывают на их чистоту. Целью данного исследования было изучение кариологических свойств культуры клеток MDBK, ВНК-21-13/02. Установлено, что клетки сохраняли исходные морфологические признаки после длительного культивирования, модальный класс хромосомных пластинок соответствовал паспортным требованиям, микробная и микроплазменная контаминация отсутствовала. Ростовые, цитоморфологические свойства и кариологическая характеристика перевиваемых линий на протяжении не менее 35 непрерывных циклов стационарного культивирования явля-
^_____о
ются стабильными. При длительном хранении в жидком азоте - 196 С культура клеток сохраняет свои биологические свойства после разморозки, при культивировании соответствует предъявляемым требованиям и может быть использована для наращивания вирусной массы с целью получения вакцинных препаратов для профилактики вирусных заболеваний животных.
THE INFLUENCE OF CYTOKINES ON KARYOLOGICAL STABILITY
OF CELL CULTURES
Arkharova I.A.
Summary
Cell cultures in collections must preserve their original properties and genotypical characteristics, indicating their purity. The aim of this work was to study the properties of cell lines culture after long-term cryopreservation. The cells retained their original morphological features, the modal class of chromosome plates meets the passport requirements, and microplasma microbial contamination was absent. Growth, cytomorphological properties and caryological characteristics of the MDBK, ВНК-21-13/02 cell lines during at least 35 continuous cycles of stationary cultivation are
о
stable. During the long-term storage in liquid nitrogen - 196 С the cell culture retains its biological
properties after defrosting, if the cultivation corresponds to the requirements and can be used for production of vaccines to prevent animal viral diseases.
DOI 10.31588/2413-4201-1883-239-3-26-28 УДК: 636. 082
НАСЛЕДСТВЕННОЕ ВЛИЯНИЕ МАТЕРЕЙ ПЕСЦА НА СРОКИ И ХАРАКТЕР
ЭСТРУСА ДОЧЕРЕЙ
*Баранов В.А. - к.в.н., доцент, Халилова Г.Х. - магистрант
*ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины
имени Н.Э. Баумана» ФГОБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И.Скрябина»
Ключевые слова: желательный срок, звероводство, эструс, целевой отбор Keywords: desired period, fur farming, estrus, purposive selection
Промышленное разведение песцов обусловлено улучшением воспроизво-ди-тельной способности животных для получения сырья в соответствии с требуемыми сроками. Целью соблюдения сроков гона, является получение шкурок максимально возможных размеров и для этого требуется синхронный приход самок племенной группы в охоту до 30 марта, именно это позволит потомству получить необходимый период развития для их роста. Для этих целей используют ряд зоотехнических мероприятий. Концентрация лучших зверей в племенной группе проводится с целью получения от них молодняка с хорошими генетическими и фенотипиче-скими качест-вами. Выявление лучших зверей и отбор их на ремонт племенного стада, ведётся путём зоотехнического учёта и племенной работы. Важным фактором, для отбора зверей являются характер и сроки эструса, так как срок прихода самок в охоту, определяет качество помёта и дальнейшее развитие щенков. Ранние сроки охоты у самок, способствуют более продолжительному развитию щенков, что влияет на получение от них шкурок больших размеров. Кроме того сроки и характер эструса, согласно литературным данным имеют свойство наследоваться, что позволяет вести избирательный отбор по данному признаку. Для определения требуемых признаков, необходимо знать разграничение самок по срокам эструса. Эст-
рус в зависимости от сроков отклонения от даты первого спаривания второго репродуктивного периода подразделяют на три вида:
Статичный эструс, в случае наступления охоты в одни и те же сроки в течение репродуктивной жизни самки. Максимальные отклонения от сроков даты первого спаривания второго периода размножения до пяти дней.
Стабильный эструс определяется отклонениями на протяжении репро-дук-тивной жизни от даты первого спаривания второго репродуктивного сезона до 10 дней в ту или иную сторону.
Динамичный эструс от первого спаривания второго репродуктивного сезо-на имеет вариацию от даты первого спаривания вплоть до 30 дней, что является экономически невыгодным в производственных условиях, из-за невозможности планирования прихода самки в охоту и увеличения количества ссаживаний зверей во время гона. Сроки прихода в охоту разделяют на:ранние, когда самка приходит в охоту до 13 марта; средние определяются в случае прихода самки в охоту до 30 марта; поздние сроки, если самка покрывается вплоть до 10 апреля.
Материал и методы исследований. Изучение и анализ показателей воспроизводства песцов проводили по результатам щенения 11 матерей и 25 дочерей в условиях ЗАО «Бирюли» Высокогорского
