CC BY
585. Osnovy promyshlennoj immunobiotekhnologii: ucheb. posobie [Basics of industrial immunobiotechnology: handbook]/ V.M.Bezgin, N.N.Bykova, V.E.Kozlov [et al.]. - Kursk: Izd-vo KGSKHA, 2011 - 288 p.
6. Tzion, R.A. Differencial'naya diagnostika boleznej svinej [Differential diagnosis of pig diseases] / R.A.Tsion. -Leningrad: Kolos, 1970. - 96 p.
7. Ocenka virusvakciny dlya profilaktiki bolezni Aueski svinej [Evaluation of the virus vaccine for the prevention of Aujeszky's disease of pigs]/ A.A.Kolomycev, V.A.Babayan, I.F.Vishnyakov [et al.] // Veterinariya. - 1991. - № 1 - P. 31-33.
8. The Role of Viral and Host MicroRNAs in the Aujeszky's Disease Virus during the Infection Process / O.Timoneda [et al.] // PLoS ONE. - 2014. - № 9 (1). - January. - P. 86-96.
УДК 619:611.018:615.014.41:576.809.33
изучение биологических свойств культуры клеток, подвергнутой длительной криоконсервации
Э.М.Плотникова - доктор ветеринарных наук, зав. лабораторией; И.А.Архарова - соискатель;
А.И.Самсонов - кандидат биологических наук, вед. н.с.; З.Г.Чурина - соискатель.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420075, Россия, г.Казань, Научныйгородок-2, тел. +7(843)239-53-20, e-mail: vnivi@mail.ru).
Поддерживаемые в коллекциях клеточные культуры должны сохранять исходные для популяции свойства и особенности генотипа, указывающего на их чистоту. Целью данного исследования было изучение свойств культуры клеток LEK, подвергнутой длительному криоконсервированию. Установлено, что жизнеспособность культуры клеток после криоконсервации, выращенной на радиодекантаминированной среде, составила 80%. Клетки сохраняли исходные морфологические признаки, степень чувствительности культуры клеток к вирусам после длительного хранения не изменилась, модальный класс хромосомных пластинок соответствовал паспортным требованиям, микробная и микроплазменная контаминация отсутствовала. Индекс жизнеспособности при культивировании клеток на необлученной среде составил 75%. Таким образом, выживаемость перевиваемой линии клеток LEK на облученной среде после разморозки выше, чем на необлученной. При длительном хранении в жидком азоте - 1960С культура клеток сохраняет свои биологические свойства после разморозки, при культивировании соответствует предъявляемым требованиям и может быть использована для наращивания вирусной массы с целью получения вакцинных препаратов для профилактики вирусных заболеваний животных.
клюЧЕВЫЕ слоВА: кариология, культура клеток, репродукция вирусов, сыворотка, ионизирующее облучение.
Культуры клеток все шире используются в каче- которые позволяют контролировать генетическое
стве продуцентов в биотехнологических про- постоянство клеток по набору и характеристике
цессах производства лекарственных препаратов. В хромосом [3]. Известно, что такие факторы культи-
связи с этим своевременной и актуальной является вирования, как нестандартность питательных сред
разработка стандартного подхода к показателям каче- и сывороток, вирусы и микоплазмы, могут явиться
ства клеток-продуцентов [5]. причиной дестабилизации различных клеточных ха-
Поддерживаемые в коллекциях клеточные куль- рактеристик, в том числе и кариологических [6]. Аль-
туры должны сохранять исходные для популяции тернативным методом деконтаминации питательных
свойства и особенности генотипа, указывающего сред и сывороток является метод радиационной
на их чистоту. В этой связи в специализированных стерилизации путем облучения гамма-лучами [2].
лабораториях, имеющих коллекции или криобанк Особыми требованиями, предъявляемыми к
клеточных культур, следует проводить регулярный клеточным линиям, являются гарантия их высокой
контроль видовой принадлежности [9,10]. Исполь- чувствительности к репродукции вирусных анти-
зование клеток с отсутствием идентификационных генов, безопасности, генетической стабильности,
характеристик ставит под сомнение объективность отсутствие контаминантов, постоянство основных
полученных результатов. С этой целью широко ис- показателей в процессе многолетнего производ-
пользуют методы цитогенетических исследований, ства [8]. Одними из основных критериев, с по-
мощью которых можно оценивать биологические свойства культур клеток, являются кариотипиче-ские параметры [4]. Кариологическая техника, давно получившая признание в клеточной биотехнологии, является наиболее приемлемым тестом для определения неизменного кариотипа клеточных культур.
В связи с выше изложенным, целью работы явилось изучение свойств культуры клеток 1_ЕК, подвергнутой длительному криоконсервированию.
Материалы и методы. В работе использовали хранящуюся более 25 лет в криобанке ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» перевиваемую культуру клеток 1_ЕК (происхождение: крупный рогатый скот, легкие эмбриона).
Для выращивания культуры клеток применяли питательные среды: 199, Игла МЕМ, ДМЕМ, ГЛА при добавлении в них сывороток крови, как взрослого крупного рогатого скота, так и плодов коров в концентрации 10%,антибиотиков (бензилпеницил-лина натриевой соли, стрептомицина сульфата, канамицина сульфата, амфотерицин В по 100 Ед/ мл) и глутамина. Для снятия клеток со стекла при их пересевах использовали раствор трипсин-вер-сена (1:3). Для лучшего восстановления морфо-физиологических свойств перевиваемых линий клеток в ростовой среде использовали сыворотку крови плодов коров и сухой гидролизат лакталь-бумина, который подвергался гамма облучению в дозе от 0,1 до 1х104 Гр на гамма-установке «Исследователь». Культуральные питательные среды и растворы, а также сыворотки крови животных готовили в лаборатории нашего Центра. Сыворотка крупного рогатого скота, полученная из крови, взятой на Елабужском мясокомбинате для научной исследовательской работы в ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», исследована по физико-биохимическим показателям по причине ее низкой биологической активности на культурах клеток.
Контроль на стерильность исследуемой культуры клеток проводился путем высева клеточной суспензии на МПА, МПБ, среды Сабуро, Чапека, Китта-Тарроци, ТПС-агар и ТПС-бульон. Для изучения общей морфологии и кариологии клеточной культуры _ЕК использовался микроскоп МкопТуре 120.
Размораживание ампул с замороженной клеточной суспензией после извлечения из криобанка проводили по единой методике Л.П. Дьяконова [3]. В последующем клетки культивировали по общепринятой методике Р.Адамса [1] в стандартных условиях монослойно в термостате при температуре 370С с посевной концентрацией 40-80 тыс.кл/мл. На нуле-
вом пассаже у данной клеточной линии определяли жизнеспособность клеток с использованием 1%-ного водного раствора трипанового синего в камере Горяева путем подсчета количества живых клеток. Полученную суспензию разливали по 50 мл во флаконы Карреля и 24 ч инкубировали в термостате при 370С. Через сутки роста клеток во флаконах проводили смену среды для удаления криопротектора.
После восстановления морфологических параметров культур проводили кариологические исследования хромосомных пластинок с использованием 0,1%-ного колхицина по методу Мурхеда [11].
С целью изучения чувствительности культуры клеток легких эмбриона коровы (1_ЕК) к вакцинным штаммам ПТК-45/86 вируса парагриппа -3 (ПГ-3) и ТК-А (ВИЭВ) - В-2 вируса инфекционного ринотра-хеита (ИРТ) крупного рогатого скота проведены 6 последовательных пассажей. Инфекционную активность вирусов ПГ-3 и ИРТ определяли титрованием их на культуре клеток 1_ЕК с последующей статистической обработкой по методу Рида и Менча.
Результаты исследований. Для устранения возможной микробной контаминации дрожжевого экстракта и гидролизата лактальбумина проведен радиомикробиологический подбор оптимальных доз их облучения в диапазоне от 0,1 до 1х104 Гр на установке «Исследователь». В результате радиомикробиологического подбора оптимальных доз облучения гидролизата лактальбумина на установке «Исследователь» наилучший результат был достигнут при Y - стерилизации сред при 1х104 Гр.
Физико-биохимические показатели сыворотки, из крови крупного рогатого скота, оказались следующими: оптическая плотность, ед. опт. пл. 0,223±0,004; рН 7,73±0,01, общий белок, г/л 58,01 ±0,2, свободный гемоглобин, г/л 0,87±0,02, общие липиды, г/л 2,94±0,02, холестерин, Ммоль/л, 3,82±0,05.
В результате проведенных исследований на выше перечисленных бактериальных средах было установлено, что культура клеток _ЕК оказалась стерильной. Для профилактики контаминации грибами при работе с перевиваемыми линиями клеток нами впервые был использован фунги-цидный препарат амфотерицин В, который в концентрации 2,5 ед/мл не оказывал токсического действия на клетки и обладал хорошим профилак-тирующим эффектом.
Восстановленные после консервации в жидком азоте перевиваемые линии клеток сохраняли исходные морфологические признаки. После образования монослоя под микроскопом просматривались клетки эллипсоидной формы с прозрачной цитоплазмой, без включений и зернистости (рис.1).
Рис.1. Культура клеток ЛЭК через 48 ч роста. Ок. 10* об.10.
Результаты определения жизнеспособности клеток _ЕК на нулевом пассаже показали, что она составляла около 75% на не облученной среде и 80% на радиодеконтаминированной среде. Индекс пролиферации клеток варьировал от 5,31 до 5,69. На среде с облученным гидролизатом лактальбумина - от 5,55 до 6,01. Монослой клеток формировался на 3-4 сут, т.е.
размороженные клетки формировали монослой в те же сроки, что и до замораживания.
В ходе работы было подсчитано 100 метафазных пластинок. В результате подсчета установлено, что модальное число хромосом равно 40, а пределы изменчивости по числу хромосом 55-58. Одна из метафазных пластинок культуры клеток 1_ЕК представлена на рисунке 2.
Рис.2. Метафазная пластинка культуры клеток ЬЕК.
Степень чувствительности культур к вирусам после длительного хранения в жидком азоте практически не изменилась. Вирусологическими исследованиями установлено, что цитопатическое действие вируса ИРТ в культуре клеток 1_ЕК выявлялось через 18-24 ч после заражения и характеризовалось округлением клеток, разрыхлением и разрушением мо-
нослоя с последующим отторжением клеток от стекла рисунок 3. Морфологические изменения в зараженной культуре клеток характеризовались: маргинаци-ей хроматина в ядрах, а затем через 24-30 ч - формированием внутриядерных включений характерных для вируса ИРТ. Полное деструктивное изменение монослоя клеток наступало к 48 часам.
Рис. 3. Культура клеток ЛЭК до и после заражения вирусом ИРТ.
ЦПД вируса парагриппа-3 на культуре клеток 1_ЕК обнаруживалось через 48 ч после заражения, и завершалось к 96 часам. Изменение в инфицированной культуре клеток характеризовалось появлением многомерных клеток (симпластов) и постепенным разрушением монослоя через 72-96 часов. В цитоплазме
клеток и симпластов наблюдали окрашенные в розовый цвет цитоплазматические включения разной величины. Иногда они занимали почти всю цитоплазму. Через 96 ч после внесения вируса в культуру мелкие розовые включения, окруженные светлой зоной, выявляли в ядрах клеток.
рис. 4. культура клеток лэк до и после заражения вирусом пг-3.
Инфекционная активность вирусов в течение 6 последовательных пассажей была стабильной и
достигала уровня 6,5±0,2 1д ТЦД50/мл к вирусу ИРТ и 6,25±0,15 1д ТЦД50/мл к вирусу ПГ-3 крупного рогатого скота (рис.4).
Методом культивирования рекриоконсервиро-ванной после заморожения и длительно хранившейся перевиваемой линии культуры клеток 1_ЕК изучали морфологические, цитогенетические свойства, выживаемость и чувствительность к вакцинным и вирулентным штаммам ПТК-45/86 вируса парагриппа - 3 (ПГ-3) и вируса инфекционного ринотрахеита ТК-А (ВИЭВ-2)- В-2.
заключение. Установлено, что жизнеспособность культуры клеток после криоконсервации, выращенной на радиодекантаминированной среде, составила 80%. Клетки сохраняли исходные морфологические признаки, степень чувствительности культуры клеток к вирусам после длительного хранения не изменилась,
модальный класс хромосомных пластинок соответствовал паспортным требованиям, микробная и микроплазменная контаминация отсутствовала. Индекс жизнеспособности при культивировании клеток на не-облученной среде составил 75%. В результате карио-логических исследований установлено, что модальный класс хромосомных пластинок соответствует паспортным требованиям к исследуемым культурам клеток, а именно: 1_ЕК 55-58 хромосомам.
Таким образом, криоконсервированная перевиваемая линия клеток 1_ЕК при длительном хранении в жидком азоте - 1960С сохраняет свои биологические свойства после рекриоконсервации.
Перевиваемая линия клеток 1_ЕК соответствует предъявляемым к ней требованиям и может использоваться в исследовательской и диагностической работе для наращивания вирусной массы с целью получения вакцинных препаратов для профилактики вирусных заболеваний животных.
Литература
1. Адамс, Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Р.Адамс; пер. с англ. М.А.Панов; ред. В.Ю.Поляков. -М.: Мир, 1983. - 313 с.
2. Булдакова, Л.А. Радиационное воздействие на организм - положительные эффекты / Л.А.Булдакова, В.С.Калистратова. - М.: Информ-Атом, 2005. - 246 с.
3. Дьяконов, Л.П. Животная клетка в культуре / Л.П.Дьяконов, В.И.Ситьков. - М.: Компания Спутник+, 2009.
- 656 с.
4. Мамаева, С.Е. Закономерности кариотипической эволюции клеток в культуре / С.Е.Мамаева // Цитология.
- 1996. - Т. 38, № 8. - С. 787-814.
5. Вопросы стандартизации клеток-продуцентов для биотехнологии / А.П.Орлов [и др.] // Биотехнология. -2017. - Т. 33, № 3. - С. 81-87.
6. Пинаев, Г.П. Методы культивирования клеток / Г.П.Пинаев, М.С.Богданова. - М.: Изд-во Политехнического ун-та, 2008. - 228 с.
7. Плотникова, Э.М. Культура клеток тканей из паренхиматозных органов плода коровы / Э.М.Плотникова, В.Г.Гумеров, И.М.Ганиев // Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность: тез. докл. Междунар. науч.-практ. конф, посвящ. 50-летию ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». - Казань, 2010. - С.447-450.
8. Основы биотехнологии: культивирование клеток человека и животных: учебно-методическое пособие / В.Ж.Цыренов; ВСГТУ. - Улан-Удэ, 2005. - 48 с.
9. Cold storage and cryopreservation of tick cell lines / G.Lallinger [et al.] // Parasites & Vectors. - 2010. - Vol. 37, № 3. - P. 1-5.
10. Establishment, characterization and cryopreservation of Fars native goat fetal fibroblast cell lines / D.Mehrabani [et al.] // Asian Pacific Journal of Reproduction. - 2016. - Vol. 5, № 3. - P. 247-251.
11. Moorhead, P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains / P.S.Moorhead // Exp. Cell Res. - 1960. -№ 5. - P. 585-621.
the biological properties of cell cultures after long-term cryopreservation
Plotnikova E.M. - Doctor of Veterinary Sciences; Arkharova I.A. - external postgraduate student;
Samsonov A.I. - Candidate of Biological Sciences, Churina Z.G. - external postgraduate student.
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: vnivi@mail.ru).
Cell cultures in collections must preserve their original properties and genotypical characteristics, indicating their purity. The aim of this work was to study the properties of LEK cell cultures after long-term cryopreservation. It is established that the viability of cell cultures after cryopreservation, cultured on radio-decontaminated environment was 80%. The cells retained their original morphological features, the degree of sensitivity to viruses in the cell cultures did not change after long-term storage, the modal class of chromosome plates meets the passport requirements, and microplasma microbial contamination was absent. The viability index for cells cultured in non-irradiated medium was 75%. Thus, the survival of passed LEK cell line in irradiated medium after defrosting was higher than that of the non-irradiated meduim. During the long-term storage in liquid nitrogen - 196°C the cell culture retains its biological properties after defrosting, if the cultivation corresponds to the requirements and can be used for production of vaccines to prevent animal viral diseases.
KEYWORDS: cryopreservation, cell culture, reproduction of viruses, serum, ionizing irradiation.
References
1. Adams, R. Metodyi kulturyi kletok dlya biohimikov [Methods cell culture for biochemists] / R.Adams; per. s angl. M.A. Panovyim; red. B.Yu.Polyakov. - Moscow: Mir, 1983. - 313 p.
2. Buldakova, L.A. Radiatsionnoe vozdeystvie na organizm - polozhitelnyie effektyi [Radiation effects on the body positive effects] / L.A.Buldakova, V.S.Kalistratova.- Moscow: Inform - Atom, 2005. - 246 p.
3. Dyakonov, L.P. Zhivotnaya kletka v culture [Animal cells in culture] / L.P.Dyakonov, V.I.Sitkov. - M.: «Kompaniya Sputnik », 2009. - 656 p.
4. Mamaeva, S.E. Zakonomernosti kariotipicheskoy evolyutsii kletok v culture [Patterns of karyotypic evolution of cells in culture] / S.E. Mamaeva // Tsitologiya. - 1996. - Vol. 38, № 8. - P. 787-814.
5. Orlov, A.P Voprosyi standartizatsii kletok-produtsentov dlya biotehnologii [Standartization of Producer Cells in Biotechnology] / A.P.Orlov [et al.] // Biotehnologiya. - 2017. - Vol. 33, № 3. -P. 81-87.
6. Pinaev, G.P. Metodyi kultivirovaniya kletok [Methods of cell cultivation] / G.P.Pinaev, M.S.Bogdanova. - Moscow: Izd-vo Politeh. Un-ta, 2008. - P. 228-230.
7. Plotnikova, E.M. Kultura kletok tkaney iz parenhimatoznyih organov ploda korovyi [Cell culture tissues from parenchymatous organs of the fetus cows] / E.M.Plotnikova, V.G.Gumerov, I.M.Ganiev, V.G.Tsyiganova, R.R.Sharafieva // Biotehnologiya: toksikologicheskaya, radiatsionnaya i biologicheskaya bezopasnost - Biotechnology: toxicological, radiation, and biological safety: proceedings from Int.scientific and practical conf.dedicated to the 50th anniversary of FTRSA-ARRVI. - Kazan, 2010. - P.447-450.
8. Tsyirenov, V.Zh. Osnovyi biotehnologii: kultivirovanie kletok cheloveka i zhivotnyih: uchebno-metodicheskoe posobie / V.Zh.Tsyirenov; VSGTU. - Ulan-Ude, 2005. - 48 p.
