CC BY
129. Matos, M. Parasite control practices and public perception of parasitic diseases: A survey of dog and cat owners / M. Matos, A.M. Alho, S. P. Owen., T. Nunes, L. Madeira de Carvalho // Preventive Veterinary Medicine. - 2015. -Vol. 122, Issue 1-2.
10. Mueller, R. Update on the diagnosis and treatment of canine demodicosis / R. Mueller, M. Shipstone // Advances in Veterinary Dermatology. - 2017 - Vol. 8. doi.org/10.1002/9781119278368.ch7.4
11. Panigrahi, P.N. Concurrent infestation of Notoedres, Sarcoptic and Psoropticacariosis in rabbit and its management / P.N. Panigrahi, B.N. Mohanty, A.R. Gupta, R.C. Patra, S. Dey // Journal of Parasitic Diseases. - 2016. - Vol. 40, Issue 3. - P. 1091-1093.
12. Pawelczyk, O. The risk of exposure to parasitic mites and insects occurring on pets in Southern Poland / O. Pawelczyk, C. Pajak, K. Solarz // Annals of Parasitology. - 2016. - No. 62 (4). - P. 337-344.
13. Pereira, A. Parasitic zoonoses associated with dogs and cats: a survey of Portuguese pet owners' awereness and deworming practices / A. Pereira, A. Martins, H. Brancal, H. Vilhena, PS ilva, P. Pimenta, D Diz-Lopes, N. Neves, M. Coimbra, AC Alves, L. Cardoso, C. Maia // Parasites & Vectors. - 2016. doi.org/10.1186/s13071-016-1533-2.
14. Short, J. Successful Treatment of Demodex gatoi with 10% Imidacloprid 1% Moxidectin / J. Short, D. Gram // Journal of the American Animal Hospital Association. - 2016. - Vol. 52. - No. 1. - P. 68-72.
15. Sivajothi, S. Notoedrescati in cats and its management / S. Sivajothi, B. Sudhakara Reddy, V.C. Rayulu, C. Sreedevi // Journal of Parasitic Diseases. - 2015. - Vol. 39. - Issue 2. - P. 303-305.
16. Tkacheva, Y. Hematological Changes in Dogs and Cats with Ectoparasitosis in Northern Trans-Urals / Y. Tkacheva, L. Glazunova // International scientific and practical conference "AgroSMART - Smart solutions for agriculture" (Agro SMART 2018). doi.org/10.2991/agrosmart - 18.2018.138
17. Wagner, R. Field efficacy of moxidectin in dogs and rabbits naturally infested with Sarcoptes spp., Demodex spp. and Psoroptes spp. mites / R. Wagner, U. Wendlberger // Veterinary Parasitology. - 2000 -Vol. 93. - Issue 2. - P. 149-158.
УДК619:57.082.26:576.343:577.11 DOI 10.33632/1998-698Х.2019-6-9-14
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК-АНАЛИЗА ДЛЯ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОСТОЯНСТВА ЦИТОКИНСТИМУЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ
Архарова И.А. - заочный аспирант, Плотникова Э.М. - доктор ветеринарных наук, доцент,
хМатвеева Е.Л. - доктор биологических наук
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный городок-2, e-mail: vnivi@mail.ru) :ЧОУ ВО «Казанский инновационный университет имени В.Г. Тимирясова» (420111, г. Казань, ул. Московская д.42, e-mail: ematveeba@mail.ru)
В центре внимания научного поиска остается проблема усовершенствования технологии изготовления и применения противовирусных препаратов. В свою очередь, растущие масштабы производства противовирусных вакцин требует совершенствования технологии культивирования клеток животных in vitro. С этой точки зрения весьма перспективным является добавление в среду ростовых факторов - стимуляторов метаболизма клеток. В связи с этим своевременной и актуальной является разработка стандартного подхода к показателям качества клеток-продуцентов. Целью данного исследования было изучение генетического постоянства цитокинстимулированных клеток животных методом ПЦР. Исследуемое вещество добавляли в среду для культивирования клеток. Проведен цитогенетический анализ клеток линии MDBK при воздействии интерлейкина-6 (IL-6). Для определения модального класса и интервала изменчивости по числу хромосом в перевиваемых линиях клеток проанализировано по 100 метафазных пластинок. Всего было проанализировано 200 метафазных пластинок. В результате кариологических исследований установлено, что модальный класс хромосомных пластинок соответствует паспортным требованиям к исследуемой культуре клеток. В зависимости от разновидности клеток было получено от 10 до 11 паттернов с молекулярной массой от 264 до 1508 пар нуклеотидов. Результаты электрофореза продуктов амплификации ДНК исследуемой культуры (контрольных линий) показывают идентичность цитокинстимулированной культуры и перевиваемой культуры
клеток MDBK, в то же время показаны значительные различия между исследуемой культурой и линией Vero. Таким образом, цитокинстимулированная перевиваемая линия клеток почек крупного рогатого скота MDBK сохранила исходные для популяции свойства и особенности генотипа, указывающие на их чистоту.
Ключевые слова: клеточные культуры, цитокины, питательные среды, кариология, полимеразная цепная реакция (ПЦР)
В настоящее время клеточные и тканевые культуры все чаще используют в качестве модельных систем для оценки токсичности и эффективности новых лекарственных средств, а также для производства вакцин и биофармацевтических препаратов [9]. Традиционная технология изготовления противовирусных вакцин на основе клеточных линий с использованием сывороток крови и растительных гидролизатов в качестве стимуляторов роста клеток in vitro уже не может в полной мере обеспечить растущую потребность практической ветеринарии в эффективных, безопасных и экономичных методах и средствах клеточной биотехнологии [8]. Большую роль в этом играет подбор оптимальной среды культивирования, использование кондиционированной клетками среды и наличие различных факторов, влияющих на деление клеток. Для получения требуемого количества клеточного материала необходима экспансия клеток, т.е. размножение в достаточном количестве [4]. С этой точки зрения весьма перспективным является добавление в среду ростовых факторов - стимуляторов метаболизма клеток.
В настоящее время в медицине и ветеринарии нашли широкое применение иммуномодуляторы нового поколения - цитокины. Цитокины оказывают влияние практически на все клетки, воздействуя на большинство процессов, протекающих в организме [1]. Использование цитокинов имеет ряд преимуществ перед другими препаратами (вакцины, сыворотки): во-первых, небольшие дозы цитокинов индуцируют интенсивный иммунный ответ и запускают синтез собственных медиаторов; во-вторых, многие цитокины обладают полифункциональностью (например, ИНФ); в-третьих, применение цитокинов сочетается с другими медиаторами, вакцинами, антибиотиками, сыворотками и т.д. [2,3]. Несмотря на большое количество данных о стимуляции цитокинами культур иммуноком-петентных клеток, до сих пор недостаточно изучен вопрос о влиянии цитокинов на культуры клеток животного происхождения. В связи с этим своевременной и актуальной является разработка стандартного подхода к
показателям качества клеток-продуцентов [7]. Одними из основных критериев, с помощью которых можно оценивать биологические свойства культур клеток, являются кариотипические параметры. В качестве альтернативного метода для выявления генетического постоянства клеточных культур является молекулярно-биологический метод -полимеразная цепная реакция (ПЦР) [6, 11].
В связи с вышеизложенным целью работы явилось изучение генетического постоянства цитокинстимулированных клеток методом ПЦР.
Материал и методы. В работе использовали перевиваемые клеточные линии MDBK (почки эмбриона крупного рогатого скота),VERO (почки зеленой мартышки) из коллекции ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Объектом исследования служила линия клеток MDBK, растущая монослоем на среде Игла МЕМ с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и интерлейкина-6 (IL-6) в концентрации 60 пг/мл. В качестве объектов для сравнения использовали перевиваемые линии клеток MDBK и Vero без добавления цитокина, относящиеся к разным видам животных. Для приготовления препаратов использовали суточные культуры клеток исследуемых линий, которые инкубировали в стандартных условиях [5, 10].
На первом этапе нами был проведен ка-риологический анализ перевиваемой линии клеток МDВК, культивируемой в цитокинсодержащей ростовой среде после стабилизации ее биотехнологических характеристик. После восстановления морфологических параметров культур проводили кариологические исследования хромосомных пластинок с использованием 0,1%-ного колхицина по методу Moorhead P.S. [12], который предусматривает накопление в культуре клеток с помощью колхицина метафазных пластинок, обработку клеток гипотоническим раствором, фиксацию препаратов и их окрашивание. Окраску хромосомных препаратов проводили с использованием готового красителя азур - эозина по Романовскому. Хромосомный анализ выполняли на препаратах с помощью микроскопа
марки Nicon при малом (10^10) и большом (10^100) увеличении. Для определения модального класса и интервала изменчивости по числу хромосом в перевиваемых линиях клеток анализировали по 100 метафазных пластинок.
Метод ПЦР основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифициру-ются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР - процессе длина копируемых ДНК- участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp).
Для получения образцов ДНК культуры трипсинизировали и ресуспендировали в STE-1 буфере (0.1 M NaCl, 0.1 М трисНС1, 0,001 М EDTA, рН 7.4). Выделение нуклеиновых кислот осуществляли с помощью фе-нольно-хлороформной экстракции. Для дифференциации культуры клеток и индикации использовали произвольный праймер № 29 (3'-CCGGCCTTAC-5'). Полимеразная цепная реакция проводилась с использованием 5нг ДНК в следующей реакционной смеси из расчета на 1 пробу объемом 13,5 мкл: 0,2 мМ dNTP, 1 мкМ праймеров, 1 ед. Taq ДНК-
полимеразы в соответствующем 1-кратном буфере (ООО «Сиб Энзим», г. Москва), минеральное масло для ПЦР - 20 мкл. ДНК вносилась в последнюю очередь под слой минерального масла. Амплификацию прово -дили на приборе с активным регулированием «Терцик» (НПФ «ДНК-Технология», Россия). Реакция ПЦР была выполнена для 40 циклов при соответствующих условиях: 94°С - 30 с, 38 °С - 30 с, 72 °С - 40 с, 40 циклов. Детекцию результатов амплификации проводили методом электрофореза на агарозном геле. ПЦР -продукт анализировали в 2 %-ном агарозном геле, окрашенным этидиум бромидом. В качестве маркера молекулярного веса использовался ДНК-маркер 100Ьр+1.5КЬ+ЗКЬ (ООО «СибЭнзим», г. Москва). Результаты электрофореза были визуализированы при 254 нм с помощью цифрового фотоаппарата. Контроль на стерильность исследуемой культуры клеток проводился путем высева клеточной суспензии на МПА, МПБ, среды Сабуро, Чапека, Китта-Тарроци.
Результаты исследований. Методом культивирования цитокинстимулированной перевиваемой линии культуры клеток MDBK изучали морфологические, цитогенетические свойства.
Результаты кариологического анализа, проведенного по стандартной методике, определяли путем подсчета хромосом в 100 метафазных пластинках (рис.1). Всего было проанализировано 200 метафазных пластинок.
Рисунок 1 - Распределение хромосом в метафазных пластинках культуры клеток MDBK.
Из рисунка 1 видно, что число хромосом в клетках, выращенных в цитокинсодержа-щей среде, колеблется от 36 - 75. Полученные данные показывают, что модальный класс метафазных пластинок клеток MDBK,
выращенных в присутствии сыворотки крови крупного рогатого скота (СККРС), составил 46 - 50 хромосом, а содержание метафазных пластинок с этим модальным классом - 34%. Модальный класс метафазных пластинок кле-
ток-MDBK, выращенных на цитокинсодержа-щей среде, также составил 46 - 50 хромосом, а содержание метафазных пластинок с этим модальным классом - 36% (^-6).В результате подсчета установлено, что модальное число
хромосом равно 46-50, а пределы изменчивости по числу хромосом 36-75.
Одна из метафазных пластинок культуры клеток MDBK представлена на рисунке 2.
V
i
t >
Рисунок 2 - Метафазная пластинка цитокинстимулированной культуры клеток MDBK.
Ув.ок. 15, об.90
С помощью ПЦР-амплификации с произвольным праймером № 29 были получены ДНК-профили контрольных образцов и ДНК-профиль исследуемой культуры. В зависимости от разновидности клеток было получено от 10 до 11 паттернов с молекулярной массой от 264 до 1508 пар нуклеотидов. Результаты представлены на рисунке 3. Так, в результате электрофореза продуктов ПЦР-ам-плификации ДНК линии MDBK и исследуемой культуры образуется 11 паттернов молекулярным весом 255, 278, 384, 404, 521, 569, 623, 707, 1085, 1175 и 1508 пар нуклеотидов. В результате ПЦР-анализа ДНК линии Vero образуется 10 паттернов с молекулярным весом 264, 390, 425, 475, 535, 615, 682, 760, 900 и 1083 пары нуклеотидов. Наличие продуктов
амплификации с молекулярным весом в 255, 278, 384, 404, 521, 567, 623, 708, 1084, 1175 и 1508 пар нуклеотидов, полученных в результате ПЦР с ДНК исследуемой культуры, служит маркером того, что исследуемая клеточная линия является перевиваемой линией MDBK и, наряду с карио-типированием, подтверждает данное заключение. Результаты электрофореза продуктов амплификации ДНК исследуемой культуры (контрольных линий) показывают идентичность цитокинстимулированной культуры и перевиваемой культуры клеток MDBK, в то же время показаны значительные различия между исследуемой культурой и линией Vero. Молекулярная масса паттернов и их количество представлены в таблице.
Таблица - Характеристика паттернов образовавшихся в результате ПЦР с праймером N29
Культура клеток Количество паттернов Молекулярная масса паттернов, п.н.
VERO 10 264, 390, 425, 475, 535, 615, 682, 760, 900 и 1083
MDBK 11 255, 278, 384, 404, 521, 569, 623, 707, 1085, 1175 и 1508
MDBK (цитокинстимулированная) 11 255, 278, 384, 404, 521, 567, 623, 708, 1084, 1175 и 1508
По результатам анализа полиморфизма отметить, что ДНК-профиль исследуемой
длин амплифицированных фрагментов можно культуры практически идентичен ДНК-про-
филю перевиваемой культуры клеток MDBK, в то же время ДНК-профиль исследуемой культуры значительно отличается от профиля перевиваемой культуры клеток Уего.В результате проведенных исследований на выше перечисленных бактериальных средах было установлено, что культуры клеток оказались стерильными.
Заключение. В результате кариоло-гических исследований установлено, что модальный класс хромосомных пластинок соответствует паспортным требованиям к исследуемым культурам клеток. По результа-
там анализа продуктов амплификации ДНК исследуемой культуры (контрольных линий), показана идентичность цитокинстимулирован-ной культуры и перевиваемой культуры клеток MDBK, в то же время показаны значительные различия между исследуемой культурой и линией Vero. Таким образом, цитокин-стимулированная перевиваемая линия клеток почек крупного рогатого скота MDBK сохранила исходные для популяции морфологические признаки, свойства и особенности генотипа, указывающие на их чистоту.
Литература
1. Авдеева, Ж.И. Цитокины и вакцины / Ж.И. Авдеева и др. // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2009. - №3. - С.22-27.
2. Ада, Г. Вакцины, вакцинация и иммунный ответ / Г. Ада, А. Рамсей: пер. с англ. - М.: Медицина, 2002. - 344 с.
3. Белецкий, С.О. Выявление антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в сухих образцах в сыворотке крови, полученных на пористых мембранных носителях нового формата / С.О. Белецкий, И.Г. Каримуллина, А.Ф. Авзалова и др. // Ветеринарный врач. - 2016. - №2. - С. 14-18.
4. Данлыбаева, Г.А. Влияние антиоксидантов и витаминов на функциональную активность клеток человека в условиях in vitro / Г.А. Данлыбаева, Ж.Т. Ахмадеева // Биотехнология. Теория и практика. - 2016. - №1. - С.4-13.
5. Дьяконов, Л.П. Животная клетка в культуре / Л.П. Дьяконов, В.И. Ситьков. - М.: Компания Спутник+, 2009. - 656 с.
6. Иванов, А.В. Использование экстрактов из тканей органов плодов коров при культивировании перевиваемых клеток / А.В. Иванов, Э.М. Плотникова, Н.И. Гурьянов и др. // Ветеринарный врач. -2010. - №2. - С. 23-27.
7. Орлов, А.П. Вопросы стандартизации клеток-продуцентов для биотехнологии / А.П. Орлов и др. // Биотехнология. - 2017. - Т. 33. - № 3. - С. 81-87.
8. Плотникова, Э.М. Влияние апифитоэкстракта на биологические свойства перевиваемых линий клеток MDBK, LEK и VERO / Э.М. Плотникова // Труды федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир: 2018. - Т. XVI . - С. 413-421.
9. Трухан, И.С. Питательная среда как ключевой фактор культивирования клеток млекопитающих / И.С.Трухан // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2018. -Т.12. - №1. - С.165-172.
10. Фрешни, Р.Я. Культура животных клеток: практ. руководство / Р.Я.Фрешни; пер. с англ. Ю.Н. Хомяков - 4-е изд. испр. и доп. - М: Лаборатория знаний, 2018 - 791 с.
11. Шалунова, Н.В. Микоплазмы-контаминанты клеточных культур / Н.В. Шалунова и др. // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. - 2016. - Т.16. - №3. - С.151-159.
12. Moorhead, P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains / P.S. Moorhead // Exp. Cell Res. -1960. - P. 585-621.
THE USE OF DNA-ANALYSIS TO ASSESS THE GENETIC CONSTANCY OF CYTOKINESTIMULATED ANIMAL CELLS
Arkharova I.A. - Extramural Postgraduate Student, Plotnikova E.M. - Doctor of Veterinary Sciences,
:Matveeva E.L. - Doctor of Biological Sciences
FSBSI «Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety» (420075 Kazan, Nauchniy gorodok-2, e-mail: vnivi@mail.ru) :PEI HE Kazan Innovation University named after V.G. Timiryasov (420111 Kazan, 42 Moskovskaya st., e-mail: ematveeba@mail.ru)
The issue of the development ofproduction and application of antiviral drugs is the focus of active scientific enquiry. The growing production of antiviral vaccines requires in turn the improvement of animal cell culture technology in vitro. Viewed in this way, the addition of cell metabolism stimulants shows great potential in the growth factors environment. The development of standard approach to quality factor of cell-producers is therefore extremely timely and topical. The aim of the study was to analyze the genetic constancy of cytokine-stimulated animal cells by PCR. The environment for cell cultivation includes the studied substance. Cytogenetic analysis of MDBK cellshas been developed when exposed to the effects ofmterleukin-6 (IL-6). The study examined 100 metaphase plates to determine the modal class and the interval of variability by the number of chromosomes in the continuous cell lines. In total, 200 metaphase plates were analyzed. Karyological studies resulted that the modal class of chromosomal plates corresponds to the passport requirements for the studied cell cultures. Depending on the cell variety, 10 to 11 patterns with a molecular weight of 264 to 1508 nucleotide pairs were obtainedduring the study. The results of electrophoresis of DNA amplification products of the studied culture (control lines) show the identity of the cytokine-stimulated culture and the subinoculated culture of MDBK cells, and reveals significant differences between the studied culture and the Vero line. Thus, the cytokine-stimulated subinoculated line of bovine kidney MDBK cells retained the original population properties and genotype characteristics indicating their purity.
Keywords: cell culture, cytokine, medium, karyology, polymerase chain reaction (PCR)
References
1. Avdeeva, Zh.I. Cytokines and vaccines / Zh.I. Avdeeva et al. // Pacific medical journal. - 2009. - № 3. -P. 22-27.
2. Ada, G. Vaccines, vaccination and immune response / G.Ada, A.Ramsey: trans. with eng. - M.: Medicine, 2002. - 344 p.
3. Beletsky, S.O. Detection of antibodies against infectious bovine rhinotracheitis virus in dried serum samples on the porous membrane carrier of a new format / S.O. Beletsky, I.G. Karimullina, A.F. Avzalova et.al. // Veterinarian. - 2016. - №. 2. - P. 14-18.
4. Danlybaeva, G.A. The effect of antioxidants and vitamins on the functional activity of human cells in vitro / G.A. Danlybaeva, J.T. Ahmadeeva // Biotechnology. Theory and practice. - 2016. - № 1.- P. 4-13.
5. Dyakonov, L.P. Animal cells in culture / L.P. Dyakonov, V.I. Shitikov. - M: Sputnik + Company, 2009. - 656 p.
6. Freshney, R.I. Culture of animal cells: pract. Guide / R.Y. Freshney; trans. with eng. Y.N. Khomyakov - 4th ed. cor. and additional - M: Knowledge Laboratory, 2018 - 791 p.
7. Ivanov, A.V. Use of extracts from the tissue of cows fetus of cultivating intertwined cells / A.V. Ivanov, E. M. Plotnikova, N. I. Guryanov et al. // Veterinarian. - 2010. - No. 2. - Pp. 23-27.
8. Moorhead, P.S. Serial cultivation of human diploid cell strains / P.S. Moorhead // Exp. Cell Research -1960. - P. 585-621.
9. Orlov, A.P. Questions of standardization of cells-producer for biotechnology / A.P. Orlov et al. // Biotechnology. - 2017. - Vol. 33. - № 3. - P. 81-87.
10. Plotnikova, E.M. Influence of apiphyto extract on biological properties of transplanted MDBK, LEK and VERO cell lines / E.M. Plotnikova // Proceedings of the Federal center for animal health. - Vladimir: 2018. - Volume XVI. - P. 413-421.
11. Shalunova, N.V. Mycoplasma-contaminants of cell cultures / N.V. Shalunova et al. // Biopreparations. Prevention, diagnosis, treatment. - 2016. - Vol. 16. - № 3. - P. 151-159.
12. Truhan, I.S. Nutrient medium as a key factor in mammalian cell culture / I.S. Truhan // International journal of applied and fundamental research. - 2018. - Vol. 12. - № 1. - P. 165-172.
