CC BY
142
Том 154, кн. 1
Естественные науки
2012
УДК 619:579.831.004.4+575+577.2
ПРИМЕНЕНИЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ ЛИНИЙ КЛЕТОК
Е.Ю. Хамзина, Ю.М. Кириллова, Э.М. Плотникова, Т.Х. Фаизов, А.В. Гильман, Р.Х. Хусаенов
Аннотация
Показана целесообразность комплексного, цитогенетического и молекулярно-гене-тического анализа в установлении видовой принадлежности неидентифицированной линии клеток для сертификации и паспортизации клеточных культур на примере немаркированной монослойной линии, растущей в стандартных условиях (среда Игла МЕМ с добавлением сыворотки крупного рогатого скота). В качестве объектов сравнения использовали перевиваемые линии клеток почек эмбриона коровы (MDBK) и почек африканской зеленой мартышки (Vero).
В результате кариологического анализа были установлены модальное число хромосом и интервал изменчивости. Методом ПЦР и кариологическими исследованиями показана принадлежность немаркированной клеточной культуры к перевиваемой клеточной линии MDBK.
Ключевые слова: хромосомы, кариология, культура клеток, полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Введение
В настоящее время культуры клеток широко применяются в самых разнообразных областях экспериментальной биологии и медицины для изучения и решения кардинальных проблем общей и частной вирусологии, онкологии, биохимии, биотехнологии и т. д. Чистота и точная характеристика используемой модели, которой во многих случаях служат постоянные клеточные линии, являются абсолютно необходимым условием работы и требуют их надежной идентификации [1]. В условиях культивирования клетки разных видов животных морфологически трудно различимы. Кроме того, нередко в результате технических ошибок персонала возможно перекрестное заражение клетками разных линий, что происходит довольно часто [2]. Видовая идентификация является одной из основных процедур сертификации и паспортизации культур клеток при создании банка клеточных культур.
Наиболее распространенным методом определения видовой принадлежности является кариологический анализ, однако высокая кариотипическая изменчивость, которая отражается в изменении модального числа хромосом путем появления маркерных хромосом, усложняет оценку кариотипа. В качестве альтернативного метода для видовой идентификации клеточных культур и выявлении факта возможной контаминации клетками иного видового происхожде-
ния используют молекулярно-генетические методы, и в частности метод поли-меразной цепной реакции (ПЦР).
В настоящей работе показана возможность комплексного цитогенетического и молекулярно-генетического анализа видовой идентификации немаркированной перевиваемой линии клеток криобанка.
Материалы и методы
Объектом исследования служила неидентифицированная линия клеток, растущая монослоем на среде Игла МЕМ с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и антибиотиков (пенициллин, стрептомицин и кана-мицин) по 100 ед/мл. В качестве объектов для сравнения использовали перевиваемые линии клеток MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney Cells, крупный рогатый скот, почка) и Vero (Vero cells line, зеленая мартышка, почка), относящиеся к разным видам животных и хранящиеся в одном контейнере с исследуемой культурой. Для приготовления препаратов использовали суточные культуры клеток исследуемых линий, которые инкубировали в стандартных условиях [3]. Приготовление препаратов осуществлялось по методу Мурхеда [4]. Подсчет числа хромосом в пластинках проводили под иммерсией с помощью микроскопа АУ-12, увеличение ок. 15, об. 90. В ходе работы было подсчитано 100 мета-фазных пластинок.
Для получения образцов ДНК культуры трипсинизировали и ресуспенди-ровали в STE-1 буфере (0.1 М NaCl, 0.1 M трисНС1, 0.001 M EDTA, pH 7.4). Выделение нуклеиновых кислот осуществляли с помощью фенольно-хлоро-формной экстракции [5]. Для дифференциации культуры клеток и индикации использовали произвольный праймер № 29 (3'-CCGGCCTTAC-5'). Полимераз-ная цепная реакция проводилась с использованием 5 нг ДНК в следующей реакционной смеси из расчета на 1 пробу объемом 13.5 мкл: 0.2 мМ dNTP, 1 мкМ праймеров, 1 ед. Taq ДНК-полимеразы в соответствующем 1-кратном буфере (ООО «СибЭнзим», г. Москва), минеральное масло для ПЦР - 20 мкл. ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» (НПФ «ДНК-Технология», Россия) при соответствующих условиях: 94 °C - 30 с, 38 °C -30 с, 72 °C - 40 с, 40 циклов. Продукты ПЦР анализировали в 2%-ном агарозном геле (1ХТВЕ, режим постоянного напряжения 150 В) с последующим окрашиванием этидиум бромидом. В качестве маркера молекулярного веса использовался ДНК-маркер 100bp+ 1.5Kb+3Kb (ООО «СибЭнзим», г. Москва). Результаты электрофореза были визуализированы при 254 нм с помощью цифрового фотоаппарата и обработаны в программе Quantity One 1-D Analysis Software, версия 4.6.3 (BioRad, США).
Вирусологические исследования по выявлению цитопатического действия (ЦПД) на культуры клеток проводили с использованием вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) вакцинного штамма ТК-А(ВИЭВ)-В2 (ВИЭВ, г. Москва) адаптированного к росту на линии МDВК и реовируса 1-го типа референтного штамма Lang (Великобритания), к которому чувствительна линия Vero. Данное исследование проводилось для подтверждения видовой принадлежности немаркированной линии клеток к культуре МDВК.
20 ц m
Рис. 1. Метафазная пластинка неидентифицированной культуры клеток. Ув. ок. 15, об. 90
Табл. 1
Модальный класс и пределы варьирования числа хромосом
Название Немаркированная линия MDBK Vero
Интервал изменчивости 26-59 40-75 53-60
Модальное число хромосом 36-40 42 53-60
Результаты
При подсчете числа хромосом установлено, что исследуемая клеточная линия характеризовалась модальным числом хромосом в пределах 36-40, при этом предел изменчивости для исследуемой линии составлял от 26 до 59 хромосом (рис. 1).
При сравнении полученных результатов с данными каталога специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных [6] нами было определено, что данная культура по модальному числу хромосом наиболее близка к перевиваемой линии клеток почек эмбриона коровы МБВК (табл. 1).
В результате исследований морфологии клеточного монослоя исследуемой линии показано, что монослой формируется на 3-4-е сутки после пересева и представлен, как и у MDBK, эпителиоподобными клетками, в отличие от фиб-робластоподобного роста клеток Vero (рис. 2).
С помощью ПЦР-амплификации с произвольным праймером № 29 были получены ДНК-профили контрольных образцов и ДНК-профиль исследуемой культуры. В зависимости от разновидности клеток было получено от 10 до 11 паттернов с молекулярной массой от 264 до 1508 пар нуклеотидов (рис. 3).
Согласно полученным результатам ДНК-профиль неизвестной культуры практически идентичен ДНК-профилю перевиваемой культуры клеток MDBK, в то же время ДНК-профиль неидентифицированной культуры значительно отличается от профиля перевиваемой культуры клеток Vero. Так, в результате
Рис. 2. Перевиваемая линия клеток Vero (а), MDBK(6), исследуемая линия (в). Ув. ок. 10, об. 20
электрофореза продуктов ПЦР-амплификации ДНК линии MDBK и исследуемой культуры образуется 11 паттернов молекулярным весом 255, 278, 384, 404, 521, 569, 623, 707, 1085, 1175 и 1508 пар нуклеотидов. В результате ПЦР-анализа ДНК линии Vero образуется 10 паттернов с молекулярным весом 264, 390, 425, 475, 535, 615, 682, 760, 900 и 1083 пары нуклеотидов.
Наличие продуктов амплификации с молекулярным весом в 255, 278, 384, 404, 521, 567, 623, 708, 1084, 1175 и 1508 пар нуклеотидов, полученных в результате ПЦР с ДНК неидентифицированной культуры, служит маркером того, что исследуемая клеточная линия является перевиваемой линией MDBK и, наряду с кариотипированием, подтверждает данное заключение.
По данным вирусологического исследования немаркированная культура оказалась нечувствительной к реовирусу. При внесении в клеточный монослой вируса ИРТ на 48-96-й час после заражения отмечалось его цитопатическое действие, проявляющееся зернистостью, округлением клеток с последующим формированием сферических синцитиев, содержащих по 10-20 ядер.
1
30СН! JOCHÍ
LI п'р
ISDO
jigo ш flÉflff шшшт*
274 214
255 255
Рис. 3. Результаты электрофоретического разделения продуктов амплификации образцов ДНК. Треки 1, 5 - маркеры молекулярного веса, трек 2 - линия VERO, трек 3 - исследуемая культура, трек 4 - линия MDBK
Обсуждение результатов
По характеру роста клеток в монослое и результатам кариологического анализа нами было установлено сходство неидентифицированной линии клеток с перевиваемой линией MDBK. Неточное соответствие модального числа хромосом MDBK (42) и исследуемой культуры (36-40) может быть связано с высокой наследственной изменчивостью перевиваемых линий клеток, которая наблюдается при длительном их культивировании под действием меняющихся условий внешней среды: питательные среды, рН, сыворотка, биологически активные добавки [7].
Результаты электрофореза продуктов амплификации ДНК исследуемой культуры (контрольных линий) показывают идентичность неизвестной культуры и перевиваемой культуры клеток MDBK, в то же время показаны значительные различия между исследуемой культурой и линией Vero.
По результатам анализа данных электрофореза с помощью программы Quantity One 1-D Analysis Software (версия 4.6.3) построена дендрограмма, дающая четкое определение сходства ДНК-профилей перевиваемой культуры клеток МДБК и немаркированной культуры. Степень совпадения составляет 97%, что фактически означает идентичность линий (рис. 4).
2
3
4
5
Рис. 4. Дендрограмма, построенная на основании анализа электрофореграммы продуктов амплификации с произвольным праймером № 29 программой Quantity One 1-D Analysis Software (версия 4.6.3). Числами обозначена степень сходства при шкале от 0 до 1, где 1 - идентичность
Результаты вирусологических исследований подтверждают данные карио-логического анализа и ПЦР об идентификации немаркированной культуры как перевиваемой линии клеток MDBK.
Таким образом, комплексный кариологический и молекулярно-генетический анализ позволяет определять видовую принадлежность перевиваемых культур клеточных линий, что подтверждается результатами вирусологических исследований. Данный подход может быть реализован для определения видовой идентификации, сертификации и паспортизации перевиваемых клеточных линий.
Summary
E.Yu. Khamzina, Yu.M. Kirillova, E.M. Plotnikova, T.Kh. Faizov, A.V. Gilman, R.Kh. Khusaenov. Application of Cytogenetic and Molecular-Genetic Methods for Specific Identification of Finite Cell Lines.
This article shows the necessity of an integrated cytogenetic and molecular-genetic analysis in specific identification of a non-identified cell line for certification of cell cultures on the example of a non-tagged monolayer line growing in standard conditions (Eagle's MEM with cattle serum). Finite MDBK and Vero cell lines were used for comparison. As a result of karyological analysis, modal chromosome number and variability interval were determined. Karyological research and PCR analysis showed that the non-tagged cell culture belongs to the finite MDBK cell line.
Key words: chromosome, karyology, cell culture, PCR.
Литература
1. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. - М.: Мир, 1983. - 264 с.
2. Клеточные культуры. Информ. бюл. / Отв. ред. М.С. Богданова. - СПб.: Изд-во Политехн. ун-та, 2010. - Вып. 26. - 61 с.
3. Куляшов К.В. Определение видовой принадлежности культур клеток методами мо-лекулярно-генетического анализа. Дис. ... канд. биол. наук. - Щелково, 2009. - 150 с.
4. Moorhead P.S., Nowell P.S., Mellman W.I. Chromosome preparations of leucocytes cultured from human peripheral blood // Exper. Cell Res. - 1960. - V. 20. - P. 613-616.
5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Пер. с англ. - М.: Мир, 1984. - 480 с.
6. Специализированная коллекция перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных промысловых животных РККК(П), (СХЖ РАСХН): Каталог / Л.П. Дьяконов и др. - М., 2006. - 115 с.
7. Методы культивирования клеток / Под ред. Г.П. Пинаева, М.С. Богдановой. - СПб.: Изд-во Политехн. ун-та, 2008. - 278 с.
Поступила в редакцию 25.10.11
Хамзина Елена Юрьевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань.
E-mail: lenahamzina@yandex.ru
Кириллова Юлия Марсельевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань.
Плотникова Эдия Миначетдиновна - доктор ветеринарных наук, доцент ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань.
Фаизов Тагир Хадиевич - доктор ветеринарных наук, профессор ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань.
Гильман Агнесса Вячеславовна - младший научный сотрудник ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань.
Хусаенов Рим Халимович - младший научный сотрудник ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань.
