CC BY
101
СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ХОЗЯЙСТВАХ
ОМСКОЙ ОБЛАСТИ
Плешакова В.И., Лукьянова И. А.
Резюме
В Омской области часто встречаются вирусные заболевания крупного рогатого скота, вызывающие инфекционные процессы в легочной, пищеварительной и репродуктивной системах.
MONITORING OF VIRAL INFECTIONS IN CATTLE REARED IN OMSK REGION
Pleshakova V.I., Lukyanova I.A.
Summary
Viral diseases causing infectious processes in pulmonary, digestive and reproductive systems in cattle are of high incidence in the Omsk region.
УДК 663.053:616.013(018)
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КУЛЬТУР КЛЕТОК
Плотникова Э.М., Гурьянов Н.И., Хамзина Е.Ю., Кириллова Ю.М., Самсонов А.И., Бадрутдинов Н.В., Хусаенов Р.Х., Цыганова В.Г.
ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности
животных», г. Казань
Ключевые слова: культура клеток, репродукция вирусов,
сыворотка, ионизирующее облучение, кариология.
Key words: cell culture, reproduction of viruses, kariology.
Актуальность проблемы. Поддерживаемые в коллекциях клеточные культуры должны сохранять исходные для популяции свойства и особенности генотипа, указывающего на их чистоту относительно контаминации клеточными структурами других видов. В этой связи в специализированных лабораториях, имеющих коллекции или криобанка клеточных культур, следует проводить регулярный контроль видовой принадлежности. С этой целью широко используют методы цитогенетических исследований, которые позволяют контролировать генетическое постоянство клеток по набору и характеристике хромосом (Дьяконов Л.П., 2009). Известно, что такие факторы культивирования, как
нестандартность питательных сред и сывороток, вирусы и микоплазмы, могут явиться причиной дестабилизации различных клеточных характеристик, в том числе и кариологических (Пинаев Г.П., 2008).
Использование клеточных культур в производстве противовирусных вакцин сохраняет актуальность до настоящего времени. На предприятии должны быть созданы гарантированные банки, которые необходимо охарактеризовать и отконтролировать в соответствии с требованиями, предъявляемыми, к производству вакцин. Особыми требованиями, предъявляемыми к клеточным линиям, является гарантия их высокой чувствительности к репродукции вирусных антигенов, безопасности, генетической стабильности, отсутствие контаминантов, постоянство основных показателей в процессе многолетнего производства. Живой материал, консервируемый в криобанках, нуждается в систематизации и паспортизации.
Проблема изменения клеток не менее значима в практической работе, чем контаминация микроорганизмами. При использовании определенных линий в производстве противовирусных препаратов данное явление может привести к непредсказуемым и неконтролируемым изменениям свойств клеточных популяций и, соответственно, к снижению качества изготовляемых препаратов (Юрков С.Г., 1995). Одними из основных критериев, с помощью которых можно оценивать биологические свойства культур клеток, являются кариотипические параметры последних (Мамаева С.Е. и др., 1998). Кариологическая техника, давно получившая признание в клеточной биотехнологии, является, таким образом, наиболее приемлемым тестом на определение неизменного кариотипа клеточных культур.
Цель данной работы состояла в оптимизации условий консервации, рекриоконсервации, осуществлении контроля стерильности и установлении кариотипа культур клеток ЬБК, УБЯО, МББК, ВНК.
Материалы и методы. По поддержанию, расширению банка культур, технологии культивирования реоконсервировали 4 перевиваемые линии клеток: МББК, ЬБК, УБЯО и ВНК, хранившиеся в жидком азоте длительное время. Размораживание ампул с замороженной клеточной суспензией после извлечения из сосудов Дьюара проводили по единой методике Р. Адамса. На нулевом пассаже у всех клеточных линий определяли жизнеспособность клеток. В случае если индекс жизнеспособности был не ниже 75%, концентрацию клеток доводили ростовой средой до 10х104 клеток/мл. Полученную суспензию разливали по 50 мл во флаконы Карреля и 24 ч инкубировали в термостате при 37°С. Для лучшего восстановления морфофизиологических свойств перевиваемых линий клеток в ростовой среде, использовали сыворотку крови плодов коров. Через сутки роста клеток во флаконах проводили смену среды для удаления криопротектора.
В последующем клетки культивировали по общепринятой методике (Р.Адамс, 1983) в стандартных условиях монослойно в термостате при температуре 37° С с 10%-м содержанием сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота в питательной среде. После восстановления морфологических параметров культур проводили кариологические исследования хромосомных пластинок с использованием 0,1%-ного колхицина по методу Мурхеда (1960).
С целью изучения чувствительности культуры (ЬБК, МОВК, УБЯО, ВНК) к вакцинным штаммам ПТК-45/86 вируса парагриппа -3 (ПГ-3) и ТК-А (ВИЭВ) - В-2 вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота проведены 3 последовательных пассажа.
Инфекционную активность вирусов ПГ-3 и ИРТ определяли титрованием их на культуре клеток ЬБК, МЭВК, УБЯО, ВНК с последующей статистической обработкой по методу Рида и Менча.
Для профилактики контаминации грибами при работе с перевиваемыми линиями клеток нами впервые был использован фунгицидный препарат амфотерицин В, который в концентрации 2,5 ед/мл не оказывал токсического действия на клетки и обладал хорошим профилактирующим эффектом.
Результаты исследований. Результаты определения жизнеспособности клеток на нулевом пассаже у всех клеточных линий показали, что она составляла около 80%. Индекс пролиферации клеток варьировал от 5,31 до 5,69. Монослой клеток формировался на 3-4 сутки, т.е. размороженные клетки формировали монослой в те же сроки, что и до замораживания.
Восстановленные после консервации в жидком азоте перевиваемые линии клеток сохраняли исходные морфологические признаки. В результате кариологических исследований установлено, что модальный класс хромосомных пластинок соответствует паспортным требованиям к исследуемым культурам клеток, а именно: для МЭВК 41-45, ЬБК 58-60, ВНК-21 26-80 и УБЯО 57-58 хромосомам.
Степень чувствительности культур к вирусам после длительного хранения в жидком азоте практически не изменилась.
Чувствительность культуры клеток ЬБК проведено 3 пассажа, определяли к вирусам шт. ПТК-45/86, ПГ-3 - 5,75 ^ ТЦД50 см3; ИРТ - 6,0 ^ ТЦД50 см3 .
Чувствительность культуры клеток МДВК определяли к вирусам: ПГ-3 - 5,5 ^ ТЦД50 см3 и РТ - 6,25 ^ ТЦД50 см3 .
Оценки чувствительности в культурах клеток ВНК-21, вирус достигает титра 4,5-5,25 ^ ТЦД50 лишь к 72 ч инкубации.
А
Б
В
1. Метафазные пластинки культур клеток ЬБК (А), МБВК (Б), УБЯО (В)
Перевиваемая линия клеток ВНК 21/13-02, окрашенная флуоресцентным красителем акридиновым оранжевым, представлена на рисунке 2. Цитоплазма и ядро не имеют посторонних включений и вакуолей. Ядро четко очерчено и имеет 1-2 ядрышка. Контуры клеток ровные, монослой не полный, что характерно для суточной культуры. Таким образом, патологических отклонений от нормы не выявлено.
2. Культура клеток ВНК 21/13-02 (флуоресцентное окрашивание)
Методом культивирования рекриоконсервированных после заморожения и длительно хранившихся 4-х перевиваемых линий культур изучали морфологические, цитогенетические свойства, выживаемость и чувствительность к вакцинным штаммам вируса парагриппа-3 и вируса инфекционного ринотрахеита ТК-А (ВИЭВ-2) - В-2.
Установлено, что жизнеспособность рекриоконсервированных клеток составила 80%, они сохраняли исходные морфологические признаки, степень чувствительности культур клеток к вирусам после длительного хранения не изменилась, модальный класс хромосомных пластинок соответствовал паспортным требованиям, микробная и микроплазменная контаминация отсутствовала.
Проведенные бакпосевы реоконсервированных культур на МПА, МПБ, среды Сабуро и Чапека, Китта-Тарроци, не выявили микробной и микоплазменной контаминации клеточных линий.
Таким образом, криоконсервированные перевиваемые линии клеток ЬБК,УБКО, МБВК и ВНК-21 при длительном хранении в жидком азоте -1960С сохраняют свои биологические свойства после рекриоконсервации. При культивировании в стандартных условиях могут быть использованы для наращивания вирусной массы с целью получения вакцинных препаратов для профилактики вирусных заболеваний животных.
Результаты проведенных исследований легли в основу разработанных нами лабораторных регламентов, актов комиссионной проверки перевиваемых линий клеток, паспортов, ходатайств о
депонировании перевиваемых культур клеток по использованию культур клеток LEK,VERO, MDBK и ВНК-21 для вирусологических и диагностических целей.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Дьяконов, Л.П. Животная клетка в культуре / Л.П. Дьяконов, В.И. Ситьков // Под общ. ред. проф. Дьяконова Л.П. - М.: «Компания Спутник+». - 2009. - 656 с. 2. Плотникова, Э.М. Определение фракционного состава белков экстрактов плодов коров, полученных на основе раствора Хэнкса / Э.М. Плотникова, Н.И. Гурьянов, Е.Ю. Хамзина, Р.Х. Хусаенов // Междунар. научно-практ. конф. посвящ. 50-летию ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и биологич. безопасность Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность. - Казань. - 2010. - С.450-455. 3. Методы культуры клеток для биохимиков / R. Adams. - М.: «Мир». - 1983. - 313 с. 4. Плотникова Э.М. Сборник материалов научная программа тезисы / Э.М. Плотникова, Е.Ю. Хамзина, Ю.М. Кириллова, Р.Х. Хусаенов // VII Международная конференция «Молекулярная медицина и безопасность». - М. - 2010, С.146-147,196.
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА КУЛЬТУР КЛЕТОК
Плотникова Э.М., Гурьянов Н.И., Хамзина Е.Ю., Кириллова Ю.М.,
Самсонов А.И., Бадрутдинов Н.В., Хусаенов Р.Х., Цыганова В.Г.
Резюме
Изучено влияние криоконсервации на биологические свойства культур клеток. Установлено, что длительная криоконсервация влияет на цитогенетические свойства MDBK, LEK, VERO, BHK и чувствительность этих культур к вирусам.
STUDYING OF INFLUENCE ON BIOLOGICAL PROPERTIES OF CULTURES OF
CELLS
Plotnikova E.M., Guryanov N.I., Khamzina E.Y., Kirillova Y.M., Samsonov A.I., Badrutdinov N.V., Khusaenov R.K., Tsyganova V.G.
Summary
The effects of cryopreservation on biological properties of cell cultures were studied. It was shown that morphology and cytology properties of MDBK, LEK, VERO, BHK and sensitive of this cell cultures to viruses did not depend on long cryopreservation.
