CC BY
8
Цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты определяют противоопухолевый иммунный ответ при раке легкого, в том числе при мелкоклеточном раке легкого (МКРЛ). Однако опухоль и ее микроокружение оказывают негативное действие на иммунные клетки. Восстановление утраченных CD8+ Т-лимфоцитов и их свойств рассматривается как одно из направлений клеточной терапии опухоли. Для повышения активности лимфоцитарного звена противоопухолевого ответа нами был предложен подход к репрограмми-рованию CD8+ Т-лимфоцитов, основанный на применении ингибитора MEK1/2 и блокатора контрольной точки PD-1. Избирательная элиминация мишени обеспечивалась предварительным «обучением» CD8+ Т-лимфоцитов анти-ген-презентирующей смесью, содержащей лизат опухолевых клеток и стволовых опухолевых клеток (СОК).
Целью настоящего исследования явилось изучение противоопухолевой активности репрограммированых CD8+ Т-лимфоцитов при раке легкого.
Объектом исследования выступали репрограмми-рованые CD8+ Т-лимфоциты человека (рчТлимф) и мышей линии C57BL/6 (рмТлимф). Эффекты рчТлимф и рмТлимф были оценены в культуре клеток карциномы легкого Льюис (LLC) и культуре опухолевых клеток и СОК пациентов с МКРЛ; а также в условиях целостного организма у мышей линии C57BL/6 на ортотопической модели LLC и модели спонтанного метастазирования LLC. В исследовании использовались морфометрический и гистологический методы, проточная цитометрия, куль-туральные методы, клеточный имиджинг, методы исследования митохондриального дыхания и др.
Репрограммирование увеличивало активность мито-хондриального дыхания и устойчивость к апоптозу CD8+ Т-лимфоцитов в культуре клеток LLC и культуре опухолевых клеток и СОК пациента с МКРЛ. При этом репрограмми-рованые клетки приобретали способность мигрировать в легкие мышей при внутривенном введении. На ортотопи-ческой модели LLC и на модели спонтанного метастазиро-вания LLC рмТлимф и рчТлимф демонстрировали антиметастатическую и противоопухолевую активности. Мишенью рмТлимф и рчТлимф выступали опухолевые клетки и СОК.
Таким образом, репрограммирование CD8+ Т-лимфоцитов ингибированием MAPK/ERK сигналинга через MEK1/2i и блокадой PD-1/PD-L1 сигналинга человеческим моноклональным антителом ниволумабом с целевой направленностью на элиминацию опухолевые клетки и СОК представляет собой перспективный путь повышения эффективности иммунотерапии МКРЛ. Целевым «обучением» CD8+ Т-лимфоцитов опухолевыми клетками и СОК пациента с МКРЛ достигается пер-сонализация лечения. Исследование выполнено за счет гранта Министерства науки и высшего образования Российской Федерации № 075-15-2020-773.
ОСОБЕННОСТИ ПЛАЗМАЛЕММЫ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ МИТОГЕННОЙ СТИМУЛЯЦИИ
Е.А. Сладкова, С.В. Заболотная, Т.А. Михайлик
Белгородский государственный национальный исследовательский университет, Белгород, Россия
e-mail: sladkova@bsu.edu.ru
Ключевые слова: лимфоциты, лейкоз, митогены, плазма-лемм, атомно-силовая микроскопия.
Основной задачей современной медицины является поиск прогностических критериев, позволяющих
выявить ранние признаки активации патологического процесса. Одним из методов, имеющих прогностическое значение при лейкозах, является цитогенетиче-ский анализ, требующий присутствия соответствующих митогенов [1]. Кроме того, реакция бласттрансформа-ции на митогены широко применяется для комплексной оценки иммунного статуса больного. Ввиду чего, целью нашего исследования явилось — изучить особенности плазмалеммы лимфоцитов здоровых доноров и больных острым лимфолейкозом (ОЛЛр) в ремиссии при митоген-ной стимуляции.
Объектом исследования служили лимфоциты больных ОЛЛ в ремиссии, контроль — клетки здоровых доноров. Митогенную стимуляцию осуществляли ФГА. Рельеф клеточной поверхности и её жесткость исследовали на атомно-силовом микроскопе (АСМ).
В лейкосуспензиях здоровых доноров при стимуляции ФГА наблюдали появление субпопуляций микро-цитов, нормоцитов и бластов. В состоянии ремиссии у больных ОЛЛ под влиянием ФГА микроцитов не обнаружено. Для нормоцитов больных ОЛЛр характерно снижение жесткости клеточной поверхности на 27% (р<0,05) по сравнению с контролем. Рельеф поверхности нормоцитов представлен глобулами и инвагинациями. Высота и ширина глобулярных выступов нормоци-тов больных ОЛЛр снизились на 39% и 85% (р<0,05) по сравнению с клетками доноров. Жесткость плаз-малеммы лимфобластов в группе пациентов с ОЛЛр снижена на 45% (р<0,05). На поверхности клеток наблюдали мелкие остроконечные глобулярные выступы, высота и количество которых снизились на 37% и 23% (р<0,05) по сравнению с бластами доноров.
Установленное в нашем исследовании разнонаправленное влияние ФГА на морфологию и жесткость лимфоцитов, вероятно, связано с разной специфичностью ре-цепторных комплексов на поверхности клеток здоровых доноров и больных ОЛЛ в ремиссии. Преобразования клеточной поверхности лимфоцитов больных ОЛЛр на фоне снижения её жесткости по сравнению с контролем при воздействии ФГА указывает на различия в работе актиновых и тубулиновых сетей цитоскелета [2].
Полученные результаты расширяют имеющиеся научные данные о морфофизиологических особенностях трансформированных лимфоцитов и наводят на мысль о необходимости дальнейшего изучения влияния митогенов на лимфоциты здоровых доноров и больных лимфопролиферативными заболеваниями с целью получить надежные данные прогностического значения о регенеративных возможностях в процессе лимфопоэза.
Литература:
1. Panagiotis B., Blanca E., Mellink C. et al. HemeSpere. J. 2022.
V. 6. P. 707.
2. Ymazaki D. Cancer Sci. 2005. V. 96. P. 379-386.
ВЛИЯНИЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ММСК И ФУКОКСАНТИНА НА ФИБРОЗ ПЕЧЕНИ
В.Н. Слаутин1, Д.Ю. Гребнев1 2, И.Ю. Маклакова1, 2, К.В. Конышев1, 2
1 ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России, Екатеринбург, Россия
2 ГАУЗ СО ИМКТ, Екатеринбург, Россия e-mail: dr-grebnev77@mail.ru
Ключевые слова: фиброз печени, фукоксантин, ММСК.
Риски осложнений, высокие показатели смертности от терминальной стадии фиброза печени побуждают к поиску эффективных способов лечения фиброза печени [1, 2].
Эксперименты проведены на 40 мышах. Фиброз печени моделировали путем внутрибрюшинного введения CCl4 в количестве 2 мкл/г веса животного в растворе оливкового масла (1:4). Инъекции проводили в течение 6 недель дважды в неделю.
Животные с фиброзом печени были разделены на 4 группы.
1-я группа — вводили 0,2 мл PBS в хвостовую вену.
2-я группа — вводили 1 млн ММСК в хвостовую вену.
3-я группа — фукоксантин per os в количестве 10 мг/кг мыши.
4 -я группа — вводили ММСК и фукоксантин.
ММСК были выделены из хориона плаценты мышей. Для оценки эффективности терапии производилось определение количества клеток, позитивных по MMP-9, MMP-13, TIMP-1, a-SMA на 1 мм2 гистологического препарата. Методом ИФА определялось содержание HGF, TGF-ß в гомогенате печени. Также оценивалось содержание соединительной ткани с использованием окраски срезов Sirius red и программного обеспечения SIAMS. Количество соединительной ткани выражали в процентах по отношению к общей площади среза.
Установлено, что во 2 и 3 группах произошло снижение содержания соединительной ткани на 31,4% и 19,1% соответственно. При этом сочетанное введение ММСК и фукоксантина (4 группа) приводит к уменьшению данного показателя на 48,3%. При анализе количества a-SMA положительных клеток установлено их снижение во 2-4 группах. Механизм этих изменений обусловлен повышением экспрессии HGF после введения ММСК и снижением уровня TGF-ß после введения фукоксантина. Количество клеток MMP-9 и MMP-13 после трансплантации ММСК (во 2 и 3 группах) увеличилось на 35,3% и 24,3% соответственно. Введение фукоксантина не сопровождалось изменением уровня металлопротеиназ. Активность TIMP-1 была ингибирована как после введения фукоксантина, так и после трансплантации ММСК.
Полученные данные свидетельствуют о различных механизмах действия фукоксантина и ММСК на регресс фиброза печени, снижение количества a-SMA-положительных клеток. ММСК оказывают свое действие через повышение экспрессии матриксных металлопро-теиназ, выработку HGF. Фукоксантин вызывает уменьшение количества соединительной ткани преимущественно через снижение уровня TGF-ß. Таким образом, для лечения фиброза печени перспективно использовать комбинацию ММСК и препарата фукоксантин.
Литература:
1. Roehlen N., Crouchet E., Baumert T. Cells. J. 2020. V.9(4). P.
875.
2. Parola M., Pinzani M. Molecular Aspects of Medicine. J. 2019.
V65. P.37-55.
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПЛАЗМИДНЫХ КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ ПОЯСНО-КОНЕЧНОСТНЫХ МЫШЕЧНЫХ ДИСТРОФИЙ R1 И R9
Я.С. Слесаренко1, И.А. Яковлев1, 2, Р.В. Деев2, 3, А.А. Исаев2
1 ООО Генотаргет, Москва. Россия
2 ПАО ИСКЧ, Москва, Россия
3 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: slesarenko@genotarget.com
Ключевые слова: поясно-конечностная мышечная дистрофия, ПКМД, ПКМД R1, ПКМД R9, CAPN3, FKRP, генная терапия.
Поясно-конечностные мышечные дистрофии (ПКМД) — группы мышечных дистрофий, которые поражают мышцы тазобедренного и плечевого пояса. Эта группа включает более 20 различных подтипов, каждый из которых возникает вследствие мутации различных генов [1]. ПКМД R1 (кальпанопатия) является наиболее частой формой и составляет ~ 30% всех случаев ПКМД. Причина ПКМД R1 — мутация в гене CAPN3. Белок CAPN3 является специфичным для скелетных мышц, модулирует активность внутриклеточных киназ, фосфатаз, фосфолипаз, факторов транскрипции и цитоскелетных белков [2]. Другая форма ПКМД — R9, распространённость составляет 6-38% в разных популяциях. ПКМД R9 возникает из-за мутаций в гене FKRP, в результате нарушается гликозилирование а-дистрокликана. Это приводит к потере целостности клеточной мембраны, разрушению волокон и прогрессирующей мышечной дегенерации [3].
Целью нашей работы была оценка эффективности плазмид, содержащих трансгены CAPN3 и FKRP, с промоторами CMV (П1) и мышцеспецифичным промотором (П2) в линиях Expi293F и С2С12 для дальнейшей разработки генной терапии.
Для подбора условий трансфекции клетки трас-фицировали плазмидой pEGFP-Жс использованием Lipofectamine ™ 3000 (Invitrogen, США). Эффективность трансфекции оценивали на проточном цитометре NovoCyte (ACEA Biosciences, США) с использованием ПО NovoExpress (ACEA Biosciences, США). После выбора условий выполняли трансфекцию с плазмидами, содержащими CAPN3 и FKRP под управлением П1 или П2 (GenScript, США). Транскрипцию трансгенов и наличие трансгенного белка анализировали через 48 часов после начала трансфекции с помощью ПЦР-РВ на CFX96 (BioRad, США) с готовой смесью для ПЦР qPCRmix-HS (Евроген, Россия), вестерн-блоттинга.
Мы подтвердили наработку белков CAPN3 и FKRP в трансфицированных клетках. В Expi293F большее количество белков содержалось при использовании промотора П1 . Следовое количество — при использовании промотора П2. Это согласуется с более ранними публикациями других научных групп. Для С2С12 показана более высокая экспрессия обоих трансгенов при использовании тканеспецифичного промотора П2. Следующим этапом работы является верификация плазмид в модельных клеточных линиях и сборка конструкций на основе AAB для разработки генно-терапевтических препаратов.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ, соглашение № 075-15-2021-1346.
