CC BY
175
Оригинальные исследования
29
Сравнительная характеристика иммуномодулирующих свойств мультипотентных мезенхимных стромальных клеток и фибробластов человека
М.М. Зафранская 1, В.Г. Богдан 2, Ю.Е. Демидчик1, Ю.М. Гаин 1, С.С. Багатка 1,
С.Е. Шелкович 1, Г.И. Иванчик1
1 Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск, Беларусь
2 Белорусский государственный медицинский университет, Минск, Беларусь
Comparative characteristic of immunomodulatory properties of human multipotent mesenchymal stromal cells and fibroblasts
M.M. Zafranskaya 1, V.G. Bogdan 2, Yu.E. Demidchik 1, Yu.M. Gain 1, S.S. Bagatka 1, S.E. Shelkovich 1, G.I. Ivanchik 1
1 Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk, Belarus
2 Belarusian State Medical University, Minsk, Belarus
Для использования мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) и фибробластов в «регенеративной медицине», помимо их репаративного потенциала, важное значение имеют иммуномодулирующие свойства, опосредуемые как межклеточными контактами, так и секрецией биологически активных факторов.
Проведен анализ морфофенотипических характеристик, и оценка влияния культур ММСК, выделенных из костного мозга (КМ), жировой ткани (ЖТ), фибробластов кожи человека и постнатальных фибробластов линии Foreskin на митоген-индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов путем аллогенного совместного культивирования с моно-нуклеарами периферической крови доноров с подсчетом коэффициентов супрессии и определением концентрации фактора некроза опухоли-а.
Культуры клеток мезенхимального происхождения обладают морфо-фентотипическим сходством, при этом степень выраженности иммуносупрессивного действия ММСК-КМ и фибробластов линии Foreskin аналогична и достоверно превышала способность ММСК-ЖТ и дермальных фибробластов ингибировать пролиферацию лимфоцитов. Культуры ММСК и фибробластов конститутивно продуцировали фактор некроза опухолей-а на низком уровне. Вместе с тем, ММСК-КТ и фибробласты линии Foreskin ингибировали продукцию фактора некроза опухолей-а активированными мононуклеарами периферической крови, не оказывая при этом влияния на продукцию цитокина нестимулированными клетками, в то время как ММСК-ЖТ достоверно повышали концентрацию цитокина во всех культурах Т-лимфоцитов. Дермальные фибробласты не оказывали достоверного влияния на секреторную активность клеток иммунной системы.
Иммуномодулирующие свойства ММСК-ЖТ человека необходимо принимать во внимание при их использовании в регенеративной медицине.
Ключевые слова: мультипотентные мезенхим-
ные стромальные клетки, фибробласты, пролиферация Т-лимфоцитов, фактор некроза опухолей-а.
Одним из наиболее перспективных и быстроразвивающихся направлений реконструктивно-восстановительной хирургии является разработка и клиническое применение композиционных биологических трансплантатов, состоящих из матрикса-
e-mail: [email protected]
Immunomodulated properties of multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC) and fibroblasts mediated both by soluble factors and cell-cell contacts, as well as their reparative potential, are important for use these cells in «regenerative medicine».
The morphological and phenotypic characteristics and estimation of the bone marrow- and adipose-derived MMSC (bmMMSC and adMMSC), dermal and postnatal fibroblasts (Foreskin line) influence on mitogen-induced T-lymphocytes proliferation following co-cultivation with donor allogenic peripheral blood mononuclear cells with further calculation of index of MMSC suppression and supernatant's tumor necrosis factor-а concentration.
The mesenchymal origin cell cultures have morphophenotypic similarity. The immunosuppressive effect of bone marrow-derived MMSC and Foreskin line's fibroblasts was similar and significantly exceed the ability of adMMSC and dermal fibroblasts to inhibit lymphocyte proliferation. MMSC and fibroblasts constitutively produced low level of tumor necrosis factor-а. However the bone marrow-derived MMSC and Foreskin line's fibroblasts inhibited the tumor necrosis factor-а production by activated peripheral blood mononuclear cells but did not influence on cytokine production by unstimulated cells, whereas the adMMSC significantly increased the cytokine concentrations in all cultures. Dermal fibroblasts did not significantly affect on immune cells secretory activity.
The immunomodulatory properties of human adMMSC should be accounted under their use in regenerative medicine.
Key words: multipotent mesenchymal stromal cells, fibroblasts, proliferation of T-lymphocytes, tumor necrosis factor-а.
носителя и клеток, предварительно культивированных in vitro [1—4]. В качестве клеточного компонента тканеинженерных конструкций могут выступать как мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК), выделенные из различных
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 1, 2013
30
Оригинальные исследования
источников (костный мозг, жировая ткань), так и дифференцированные стромальные клетки — фибробласты, обладающие сходным фенотипом и дифференцировочным потенциалом [5, 6]. Для обоснования выбора клеточной составляющей, помимо репаративного потенциала клеток, важное значение имеют иммуномодулирующие свойства ММСК и фибробластов, опосредуемые как межклеточными контактами, так и секрецией биологически активных факторов [7—11].
Одним из факторов, который может служить диагностическим показателем для оценки степени приживления трансплантата и прогнозирования посттрансплантационных осложнений является фактор некроза опухолей-а (TNF-а). TNF-a вырабатывается активированными Т-клетками, моноцитами, макрофагами, фибробластами и эндотелиоцитами и обладает довольно широким спектром биологической активности [12]. Он инициирует миграцию клеток крови в очаг повреждения, что подтверждается увеличением соотношения мононуклеаров и грануло-цитов, стимулирует кислородный метаболизм и фагоцитоз, способствуя санации раневой поверхности от гнойно-некротических масс и ускорению наступления фазы регенерации. С другой стороны, TNF-a участвует в регуляции ремоделирования соединительных тканей. Цитокин активирует пролиферацию фибробластов [12, 14] и продукцию профиброгенных факторов (ИЛ-1р, фактора роста фибробластов) [15], компонентов внеклеточного матрикса (коллагена и фибронектина) [13]. В то же время, TNF-a стимулирует секрецию матриксных металлопротеиназ, в частности коллагеназы, стромелизина, желатина-зы, снижает синтез тканевых ингибиторов металлопротеиназ, участвуя в механизмах подавления избыточного разрастания соединительной ткани, оказывая по механизму обратной связи прямое супрессорное влияние на экспрессию индуктора фиброза трансформирующего ростового фактора р1 (TGF-P1), накопление которого способствует быстрому развитию фибропластических процессов [13—15].
В последние годы ММСК являются центральным объектом исследования вследствие мультилинейного дифференцировочного потенциала, а также иммунорегуляторного действия, направленного на различные эффекторные клетки иммунной системы. Показано, что ММСК оказывают влияние на диффе-ренцировку всех типов иммунных клеток и способны модулировать иммунный ответ, взаимодействуя с иммунной системой на нескольких уровнях: с одной стороны — подавляя пролиферацию Т-лимфоцитов путем усиления ингибиторов клеточного цикла или посредством действия биологически активных факторов, а с другой стороны — активируя популяцию регуляторных Т-клеток [7, 16, 17].
ММСК мигрируют в очаги поражений, что позволяет предположить их способность реагировать на локальное микроокружение, в котором они могут участвовать в функциональном восстановлении. Способность пересекать базальную мембрану регулируется металлопротеиназами, которые секрети-руются ММСК под влиянием воспалительных цитокинов, таких как TNF-a, TGF-P1 и ИЛ-1р. Показано, что ингибирование пролиферации лимфоцитов требует взаимодействия ММСК с иммунными клетками, которое приводит к продукции воспалительных цитокинов, таких как уИФН и ИЛ-1р. Эти результаты
позволяют предположить, что функциональный ответ трансплантированных МСК in vivo может являться следствием влияния локального микроокружения в результате тканевого повреждения (воспаление и гипоксия) [18, 19].
Таким образом, иммуномодулирующие свойства клеток мезенхимального происхождения в сочетании с иммунологической «привилегированностью» и низкой токсичностью могут послужить дополнительным критерием, обосновывающим выбор клеточной составляющей тканеинженерных трансплантатов, позитивно влияя как на структуризацию и ремоделирование формирующейся соединительной ткани, так и регулируя воспалительный процесс в раневой зоне.
Одной из проблем применения ММСК при различных заболеваниях является отсутствие универсального in vitro метода определения потенциального in vivo терапевтического эффекта клеток. Оценка иммуномодулирующих свойств определенной культуры ММСК может быть проведена in vitro на модели со-культивирования ММСК и лимфоцитов с последующей оценкой влияния клеточных культур на пролиферацию активированных лимфоцитов и продукцию ими регуляторных молекул [20].
В связи с вышеизложенным, целью данной работы явилась оценка способности ММСК человека и фибробластов, выделенных из различных источников, ингибировать in vitro пролиферацию активированных лимфоцитов периферической крови и регулировать продукцию TNF-a.
Материал и методы
Получение ММСК из костного мозга
Стромальные клетки костного мозга человека были выделены из эксплантатов путем центрифугирования на градиенте плотности Histopaque-1077 (Sigma, Германия) в течение 30 мин. при 1500 об/мин. Полученные клетки ресуспендиро-вали в среде йМЕМ с пониженным содержанием глюкозы 1000 мг/мл (Gibco, Великобритания), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Hyclone, Германия), 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigm», Германия), 2 mM L-глутамина (Sigma, Германия) и засевали в культуральные чашки диаметром 60 мм. По достижении клетками 75% конфлюэнтности их снимали с поверхности культурального пластика с помощью 0,25% раствора трипсина/ЭДТА (Gibco, Великобритании) и пересевали на следующий пассаж в концентрации 1х104 клеток на см2.
Получение ММСК из жировой ткани
ММСК были выделены из жировой ткани ферментативным расщеплением в присутствии 0,075% коллагеназы в течение 45 мин. Полученные клетки отмывали 2 раза центрифугированием, клеточный осадок высевали в культуральные чашки в среде йМЕМ с пониженным содержанием глюкозы 1000 мг/мл (Gibco, Великобритания) с добавлением 10% ЭТС, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, Германия), 2 mM L-глутамина (Sigma, Германия), и в концентрации 5х104 клеток на 1 см2. Пересев клеток осуществляли по достижении монослоем 75% кон-флюэнтности.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 1, 2013
Оригинальные исследования
31
Получение дермальных фибробластов Для выделения фибробластов человека фрагменты кожи размером 1 см2 инкубировали в 0,25% диспазе в течение 24 ч при 4°С для отделения дермы от эпидермиса по базальной мембране. Дерму нарезали на участки размером 0,5 см2 и инкубировали в течение 2 ч с 0,2% раствором коллагеназы I типа (Sigma, США) в фосфатном буфере при 37°С. Клетки высевали в концентрации 5х104 клеток на 1 см2 в культуральную среду IMDM (Gibco, Великобритания) с добавлением 10% ЭТС, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина в культуральные чашки диаметром 60 мм.
Для оценки пролиферативного ответа в соответствии с распределением флуоресценции были установлены границы популяции CD3+Т-клеток среди живых лимфоцитов. Пролиферация Т-лимфоцитов оценивалась как доля не поделившихся (CFSEhigh) и поделившихся (CFSElow) Т-клеток. Результат регистрировался на 50 000 событий в случае.
Для оценки иммуносупрессивного влияния ММСК и фибробластов на пролиферацию Т лимфоцитов рассчитывали коэффициент супрессии (КС) по формуле:
КС
100 П
Тм + ЫСК/Фб
X 100
П
Тм
где
Выделение мононуклеаров крови
Для выделения мононуклеаров периферической крови (МПК) гепаринизированную венозную кровь смешивали с равным объемом среды RPMI-1640 (Gibco, Великобритания), наслаивали на градиент Histopaque-1077 (Sigma, Германия) и центрифугировали 30 мин при 1500 об/мин. Клетки переносили в пробирку со средой RPMI, содержащей 10% ЭТС, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина и дважды центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин.
CFSE-окрашивание мононуклеаров крови
Для оценки антиген-неспецифической пролиферации Т-лимфоцитов здоровых доноров в ответ на митоген ФГА был использован метод количественного анализа клеточного деления in vitro, основанный на применении внутриклеточного красителя карбок-сифлуоресцеина (CFSE), флуоресценция которого снижается пропорционально числу клеточных делений. Выделенные МПК в концентрации 1х107 кл/мл окрашивали CFSE (Molecular Probe, Голландия) в концентрации 7 иМ среде RPMI-1640 (Sigma, Германия) течение 5 мин в темноте при комнатной температуре. Окрашивание клеток останавливали средой RPMI-1640, содержащей 10% ЭТС. После двукратного центрифугирования клетки ресуспенди-ровали в среде RPMI, содержащей 10% ЭТС, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина и использовали для со-культивирования с ММСК и фибробластами человека.
Совместное культивирование мононуклеаров крови
с ММСК и фибробластами человека
Предварительно окрашенные CFSE МПК, полученные от 4-х здоровых доноров, культивировали в концентрации 2х105 клеток/лунку в 96-луночном планшете в культуральной среде RPMI, содержащей 10% ЭТС, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина в присутствии 2,5 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) совместно с ММСК или фибробластами 2-го пассажа (в соотношении 10:1). Регистрация количества не поделившихся и поделившихся спонтанно или в условиях митогенной активации Т-лимфоцитов осуществлялась на 6 сут. со-культивирования методом проточной цитофлуорометрии ФС 500, Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных антител к СD3 (Beckman Coulter, США). Культуры МПК окрашивались моноклональными антителами или негативным контролем и инкубировались при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин.
КС-коэффициент супрессии; П-^+^ц^ — количество поделившихся митоген-стимулированных Т-лимфоцитов в совместной культуре МПК с ММСК или фибробластами, %; ПТм — количество поделившихся митоген-стимулированных Т-лимфоцитов в культуре МПК, %.
Оценка концентрации TNF-a методом
иммуноферментного анализа
Продукция TNF-a оценивалась в 5-дневных супернатантах различных культур клеток мезенхимального происхождения (ММСК и фибробластов), а также 6-дневных супернатантах от ко-культур интактных и митоген-активированных МПК с ММСК или дермальными фибробластами. Количественное определение концентрации TNF-a проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-системы производства Вектор-Бест (Россия). Результаты регистрировали на спектрофотометре BRIO-SIRIO (SEAC, Италия), измеряя оптическую плотность в двухволновом режиме: основной фильтр — 450 нм, референс-фильтр — 620 нм.
Статистический анализ
Статистическую обработку полученных данных проводили с применением пакета прикладных программ «STATISTICA 6.0» (StatSoft, США). По данным проведенных исследований рассчитана медиана (Ме) и интерквартильный размах (25 и 75 проценти-ли). Для сравнения динамики изменения показателя в исследуемых группах использовали непараметрические методы: критерий Вилкоксона, U-критерий Манна — Уитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,05 [21].
Результаты и обсуждение
Морфофенотипическая характеристика культур
ММСК и фибробластов человека
В исследованиях иммунорегуляторных свойств различных клеток мезенхимального происхождения были использованы культуры ММСК костного мозга (ММСК-КМ) и ММСК жировой ткани (ММСК-ЖТ), а также фибробласты, выделенные из кожи человека и контрольная культура постнатальных фибробластов крайней плоти линии Foreskin (коллекция АТСС CRL 2429, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия). Первичные культуры и ранние пассажи ММСК-ЖТ, фибробластов кожи и постнатальные фибробласты линии Foreskin (2-й пассаж) на светооптическом уровне характеризовались сходным гомогенным клеточным составом, включающим веретеновидные, фибробластоподобные клетки с четко выраженным ядром и цитоплазматической пе-ринуклеарной зернистостью (рис. 1).
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 1, 2013
32
Оригинальные исследования
В то же время, первичные культуры ММСК-КМ отличались гетерогенностью и включали, помимо фибробластоподобных, также мелкие округлые клетки, очевидно гемопоэтического происхождения, которые исчезали при последующих пересевах (рис. 1А).
Рис. 1. Культуры клеток мезенхимального происхождения, выделенных из различных источников:
А - первичная культура ММСК-КМ, 14 сут. культивирования;
Б - первичная культура ММСК-ЖТ, 10 сут. культивирования;
В - культура фибробластов линии Foreskin, 10 сут. культивирования;
Г - первичная культура фибробластов кожи, 12 сут. культивирования.
Ув. х400
Влияние клеток
мезенхимального происхождения
на митоген-индуцированную пролиферацию
МПК
Оценка иммуносупрессивного влияния клеток мезенхимального происхождения на ФГА-индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов проводилась с помощью аллогенного со-культивирования ММСК и фибробластов с мононуклеарами периферической крови с дальнейшим подсчетом коэффициентов супрессии. На рис. 2 представлены оригинальные точечные диаграммы и их проекции в виде гистограмм результатов проточной цито-флуориметрии, отражающие изменение пролиферации Сй3+ Т клеток здорового донора в ответ на поликлональный митоген ФГА в присутствии и в отсутствии аллогенных культур фибробластов и ММСК. На рис. 2А отображена спонтанная пролиферация Сй3 + Т-лимфоцитов в 6-дневной культуре (количество поделившихся CFSElow Т клеток — 2,0%); добавление ФГА (рис. 2Б) значительно стимулировало пролиферацию Т-клеток, и процент поделившихся клеток составил 72,7%.
Фибробласты и ММСК, добавленные к митоген-стимулированным МПК, в разной степени супрес-сировали пролиферацию Т-лимфоцитов. Наиболее выраженное иммуносупрессивное действие на ми-тоген-индуцированную пролиферацию лимфоцитов оказывали ММСК-КМ и фибробласты линии Foreskin (рис. 2В, Д), где количество пролиферирующих Т клеток резко уменьшалось до 14,6% и 18,1%, соответственно. В присутствии аутогенных ММСК-ЖТ и дермальных фибробластов количество пролиферирующих Сй3+ Т-лимфоцитов в ответ на митоген снижалось до 41,4% и 45,8%, соответственно (рис. 2 Г, Е).
Для отражения степени выраженности ингибирующего влияния клеточных культур на пролиферацию CD3 + лимфоцитов был рассчитан коэффициент супрессии пролиферативного ответа k (%). На рис. 3 представлены коэффициенты супрессии клеток мезенхимального происхождения на митоген-индуци-рованную пролиферацию Т-лимфоцитов.
В ходе статистической обработки результатов выявлены более высокие коэффициенты супрессии ММСК-КМ (69,2 (65,8—73,8)), по сравнению с ММСК-ЖТ (38,6 (30,5-47,8), р<0,05), а также фибробластов линии Foreskin (62,6 (61,9-63,6)), при сравнении с дермальными фибробластами (33,3 (28,7-39,3), р<0,05). При этом отсутствовали статистически значимые различия в степени супрессии пролиферации CD3+ Т-лимфоцитов между ММСК-КМ и фибробластами линии Foreskin, а также между ММСК-ЖТ и дермальными фибробластами.
Иммунорегуляторный потенциал ММСК и клеточно-молекулярные механизмы его реализации являются предметом многочисленных научных исследований [6, 7, 10]. В последние годы появляются данные о том, что антипролиферативный эффект является универсальным свойством клеток мезенхимального происхождения [9]. Так, M. Haniffa с со-авт. (2007) показали, что дермальные фибробласты оказывают иммуносупрессивный эффект на антиген-индуцированную пролиферацию МПК, механизмы реализации которого отличаются в зависимости от источника получения клеток [5].
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 1, 2013
Оригинальные исследования
33
о
■&
г
п
О
О
А
Б
2%
В
Г
Д
Е
CFSE
Рис. 2. Пролиферация Т-лимфоцитов при различных условиях культивирования:
А - спонтанная пролиферация;
Б - митоген-индуцированная пролиферация;
В - митоген-индуцированная пролиферация Т-лимфоцитов в присутствии ММСК-КМ;
Г - митоген-индуцированная пролиферация Т-лимфоцитов в присутствии ММСК-ЖТ;
Д - митоген-индуцированная пролиферация Т-лимфоцитов в присутствии фибробластов линии Foreskin;
Е - митоген-индуцированная пролиферация Т-лимфоцитов в присутствии дермальных фибробластов.
Верхняя панель - dot-plots, показывает CFSE сигнал CD3+ лимфоцитов; нижняя панель - проекция CFSE сигнала на гистограмму, показывающая количество поделившихся CFSElow CD3+ лимфоцитов
Оценка концентрации TNF-a в супернатантах различных культур клеток мезенхимального происхождения и их кокольтур с МПК В таблице представлена продукция TNF-a в супернатантах различных культур клеток мезенхимального происхождения.
Установлено, что ММСК и фибробласты секрети-руют провоспалительный цитокин на низком уровне, при этом, достоверных отличий как между различными пассажами каждой из культур, так и между исследуемыми культурами клеток не было выявлено. Полученные нами результаты согласуются с данными литературных источников о низком уровне конститутивной экспрессии TNF-a как ММСК, так и фибробластами [8].
В нестимулированных культурах МПК здоровых доноров концентрация TNF-a в среднем составила 64,07 (32,83-71,49) пг/мл (рис. 4).
При этом, добавление ММСК-КМ и фибробластов линии Foreskin к МПК без митогенной стимуляции не влияло на продукцию последними TNF-a: 46,71 (20,52-59,48) пг/мл и 49,61 (21,59-64,13) пг/мл, соответственно, в то время как ММСК-ЖТ способствовали увеличению продукции изучаемого цитокина до 185,62 (136,33-228,2) пг/мл, р<0,05.
Концентрация TNF-a в супернатантах различных культур клеток мезенхимального происхождения
Пассаж Концентрация ФНО-a в супернатантах различных культур клеток мезенхимального происхождения, пг/мл (n = 4)
ММСК-КМ ММСК-ЖТ Дермальные Фибробласты Фибробласты линии Foreskin
Первичная культура 3,9 (2,0-5,3) 3,7 (2,3-4,6) 4,2 (3,1-5,4) -
Первый пассаж 3,5 (2,1-4,6) 3,3 (2,2-4,1) 3,6 (2,2-5,1) -
Второй пассаж 2,9 (2,3-4,5) 3,9 (3,4-,3) 3,8 (2,4-4,9) 3,6 (2,8-4,0)
70 60 50 ц 40
ф
I 30 20 10 0
МСК ЖТ Фибробласты Фибробласты линии кожи
Foreskin
Рис. 3. Коэффициенты супрессии клеток мезенхимального происхождения на митоген-индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов; * - р < 0,05 по сравнению с ММСК-ЖТ и дермальными фибробластами
МСК КМ
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 1, 2013
34
Оригинальные исследования
Культивирование МПК в присутствии фибробластов, выделенных из кожи человека, недостоверно (р>0,05) повышало уровень TNF-a до 131,96 (62,06-201,86) пг/мл.
линии Foreskin кожи
Рис. 4. Концентрация TNF-a в супернатантах МПК с культурами ММСК и фибробластов человека;
* - р < 0,05 по сравнению с МПК
МСК КМ МСК ЖТ фибробласты фибробласты линии кожи
Foreskin
Рис. 5. Концентрация TNF-a в супернатантах МПК в присутствии ФГА с культурами ММСК и фибробластов человека. ФГА - митоген, стимулирующий Т-лимфоциты; * - р < 0,05 по сравнению с МПК, культивируемыми в присутствии ФГА
ЛИТЕРАТУРА:
Егиев В.Н., Сологуб В.К., Чижов Д.В. и др. Сравнительная оценка степени фиксации фибробластов на синтетических эндопротезах, используемых для пластики дефектов передней брюшной стенки. Герниология 2006; 2: 37-41.
Карпюк В.Б., Перова М.Д., Козлов В.А. и др. Экспериментальная модель реконструкции кости путем остеогенной трансформации аутотрансплантированных свежевыделенных стромальных клеток жировой ткани. Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии 2007; 4: 14-18.
Skala С.Е., Petry I.B., Gebhard S. et al. Isolation of fibroblasts for coating of meshes for reconstructive surgery: differences between mesh types. Regen. Med. 2009; 4(2): 197-204.
Мальцева Н.В., Панченко В.А., Прокопьева Е.Г. и др. Биоматрица на основе полипропиленовой сетки и эмбриональных фибробластов. Клеточные технологии в биологии и медицине 2008; 3: 128-31.
В присутствии ФГА наблюдалось статистически значимое увеличение концентрации TNF-a в супернатантах МПК до 274 (221,71-301,49) пг/мл (рис. 5).
Добавление к активированным лимфоцитам ММСК-КМ и фибробластов линии Foreskin снижало продукцию TNF-a (150,11 (81,66-218,55) пг/мл и 114,83 (49,76-178,9) пг/мл, соответственно). Совместное культивирование активированных МПК и ММСК-ЖТ достоверно стимулировало выработку TNF-a, уровень которого достигал 334,77 (321,3390,74) пг/мл. Подобный тип влияния на продукцию цитокина стимулированными лимфоцитами оказывали и дермальные фибробласты кожи, не достигая при этом уровня статистически значимых значений (263,43 (232,47-294,41) пг/мл).
Выводы
1. Культуры клеток мезенхимального происхождения, обладающих морфо-фентотипическим сходством, в разной степени ингибируют митоген-индуци-рованную пролиферацию аллогенных Т-лимфоцитов периферической крови здоровых доноров. При этом степень выраженности супрессивного влияния ММСК-КМ и фибробластов линии Foreskin аналогична и достоверно превышает способность ММСК-ЖТ и дермальных фибробластов ингибировать пролиферацию лимфоцитов периферической крови.
2. Культуры ММСК и фибробластов конститутивно продуцируют TNF-a на низком уровне и разнонаправленно влияют на секрецию цитокина. ММСК-КМ и фибробласты линии Foreskin ингибируют продукцию TNF-a активированными МПК, не оказывая при этом влияния на продукцию TNF-a нестимулированными МПК, в то время как ММСК-ЖТ достоверно повышают уровень цитокина во всех культурах МПК. Дермальные фибробласты не оказывают достоверного влияния на секреторную активность клеток иммунной системы, при этом изменяют их функцию подобно ММСК-ЖТ.
3. Нами показано, что ММСК-ЖТ человека, не обладая выраженным супрессивным действием на митоген-индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов, оказывают стимулирующее влияние на функциональные свойства как активированных, так и интактных иммуннокомпетентных клеток с повышением продукции TNF-a.
Таким образом, представляется целесообразным дальнейшее углубленное изучение механизмов иммуномодулирующего действия ММСК человека и фибробластов, выделенных из различных источников.
5. Haniffa M., Wang X.N, Holtick U. at al. Adult human fibroblasts are potent immunoregulatory cells and functionally equivalent to mesenchymal stem cells. J. Immunol. 2007; 179(3): 1595-604.
6. Кругляков П.В., Лохматова Е.А., Климович В.Б. и др. Мезенхимальные стволовые клетки и иммунопатологияеские состояния организма. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2006; IIK5): 36-41.
7. Aggarwal S., Pittenger M.F. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood 2005; 105t4): 1815-22.
8. Wada N., Bartold P.M., Gronthos S. Human foreskin fibroblasts exert immunomodulatory properties by a different mechanism to bone marrow stromal/stem cells. Stem Cells Dev. 2011; 20t4): 645-59.
9. Jones S., Horwood N., Cope A. et al. The antiproliferative effect to mesenchymal stem cells is a fundamental property shared by all stromal cells. J. Immunol. 2007; 179t5): 2824-31.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 1, 2013
Оригинальные исследования
35
10. Ishii M., Koike C., Igarashi A. et al. Molecular marker distinguish bone marrow mesenchymal stem cells from fibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 332(1): 297—303.
11. Yanez R., Lamana M.L., Garcia-Castro J. et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells have in vivo immunosuppressive properties applicable for the control of the draft-versus-host disease. Stem Cell 2006; 24(11): 2582-91.
12. Салина Т.Ю., Морозова Т.И. Особенности продукции фактора некроза опухоли а при туберкулезе легких и внелегочных локализаций. Цитокины и воспаление 2010; 1: 36-42.
13. Kim Y.S., Park H.J., Hong M.H. et al. TNF-alpha enhances engraftment of mesenchymal stem cells into infarcted myocardium. Front. Biosci. 2009; 14(1): 2845-56.
14. Abraham D.J., Shiwen X., Black C.M. et al. Tumor necrosis factor alpha suppresses the induction of connective tissue growth factor by transforming growth factor-beta in normal and scleroderma fibroblasts. J. Biol. Chem. 2000; 275(20): 15220-5.
15. Кевра М.К. Фактор некроза опухолей: изучение роли в организме. Мед. новости. 1995; 8: 13-22.
16. Haniffa M., Collin M., Buckley C. et al. Mesenchymal stem cells: the fibroblasts' new clothes? Haematologica 2009; 94(2): 258-63.
17. Bartholomeew A., Sturgeon C., Siatskas M. et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp. Hematol. 2002; 30(1): 42-8.
18. Scolding N, Marks D, Rice C. Autologous mesenchymal bone marrow stem cells: practical considerations. J. Neuro. Sci. 2008; 265(1-2): 111-5.
19. Lanza C., Morando S., Voci A. et al. Neuroprotective mesenchymal stem cells are endowed with a potent antioxidant effect in vivo. J. Neurochem. 2009; 110(5): 1674-84.
20. Krampera M., Cosmi L. Angeli R. et al. Role of interferon-y in the immunomodulatory activity of human bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells 2006; 24(2): 386-98.
21. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера; 2002.
Поступила: 24.05.2012
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 1, 2013
