CC BY
9
Риски осложнений, высокие показатели смертности от терминальной стадии фиброза печени побуждают к поиску эффективных способов лечения фиброза печени [1, 2].
Эксперименты проведены на 40 мышах. Фиброз печени моделировали путем внутрибрюшинного введения CCl4 в количестве 2 мкл/г веса животного в растворе оливкового масла (1:4). Инъекции проводили в течение 6 недель дважды в неделю.
Животные с фиброзом печени были разделены на 4 группы.
1-я группа — вводили 0,2 мл PBS в хвостовую вену.
2-я группа — вводили 1 млн ММСК в хвостовую вену.
3-я группа — фукоксантин per os в количестве 10 мг/кг мыши.
4 -я группа — вводили ММСК и фукоксантин.
ММСК были выделены из хориона плаценты мышей. Для оценки эффективности терапии производилось определение количества клеток, позитивных по MMP-9, MMP-13, TIMP-1, a-SMA на 1 мм2 гистологического препарата. Методом ИФА определялось содержание HGF, TGF-ß в гомогенате печени. Также оценивалось содержание соединительной ткани с использованием окраски срезов Sirius red и программного обеспечения SIAMS. Количество соединительной ткани выражали в процентах по отношению к общей площади среза.
Установлено, что во 2 и 3 группах произошло снижение содержания соединительной ткани на 31,4% и 19,1% соответственно. При этом сочетанное введение ММСК и фукоксантина (4 группа) приводит к уменьшению данного показателя на 48,3%. При анализе количества a-SMA положительных клеток установлено их снижение во 2-4 группах. Механизм этих изменений обусловлен повышением экспрессии HGF после введения ММСК и снижением уровня TGF-ß после введения фукоксантина. Количество клеток MMP-9 и MMP-13 после трансплантации ММСК (во 2 и 3 группах) увеличилось на 35,3% и 24,3% соответственно. Введение фукоксантина не сопровождалось изменением уровня металлопротеиназ. Активность TIMP-1 была ингибирована как после введения фукоксантина, так и после трансплантации ММСК.
Полученные данные свидетельствуют о различных механизмах действия фукоксантина и ММСК на регресс фиброза печени, снижение количества a-SMA-положительных клеток. ММСК оказывают свое действие через повышение экспрессии матриксных металлопро-теиназ, выработку HGF. Фукоксантин вызывает уменьшение количества соединительной ткани преимущественно через снижение уровня TGF-ß. Таким образом, для лечения фиброза печени перспективно использовать комбинацию ММСК и препарата фукоксантин.
Литература:
1. Roehlen N., Crouchet E., Baumert T. Cells. J. 2020. V.9(4). P.
875.
2. Parola M., Pinzani M. Molecular Aspects of Medicine. J. 2019.
V65. P.37-55.
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПЛАЗМИДНЫХ КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ ПОЯСНО-КОНЕЧНОСТНЫХ МЫШЕЧНЫХ ДИСТРОФИЙ R1 И R9
Я.С. Слесаренко1, И.А. Яковлев1, 2, Р.В. Деев2, 3, А.А. Исаев2
1 ООО Генотаргет, Москва. Россия
2 ПАО ИСКЧ, Москва, Россия
3 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: поясно-конечностная мышечная дистрофия, ПКМД, ПКМД R1, ПКМД R9, CAPN3, FKRP, генная терапия.
Поясно-конечностные мышечные дистрофии (ПКМД) — группы мышечных дистрофий, которые поражают мышцы тазобедренного и плечевого пояса. Эта группа включает более 20 различных подтипов, каждый из которых возникает вследствие мутации различных генов [1]. ПКМД R1 (кальпанопатия) является наиболее частой формой и составляет ~ 30% всех случаев ПКМД. Причина ПКМД R1 — мутация в гене CAPN3. Белок CAPN3 является специфичным для скелетных мышц, модулирует активность внутриклеточных киназ, фосфатаз, фосфолипаз, факторов транскрипции и цитоскелетных белков [2]. Другая форма ПКМД — R9, распространённость составляет 6-38% в разных популяциях. ПКМД R9 возникает из-за мутаций в гене FKRP, в результате нарушается гликозилирование а-дистрокликана. Это приводит к потере целостности клеточной мембраны, разрушению волокон и прогрессирующей мышечной дегенерации [3].
Целью нашей работы была оценка эффективности плазмид, содержащих трансгены CAPN3 и FKRP, с промоторами CMV (П1) и мышцеспецифичным промотором (П2) в линиях Expi293F и С2С12 для дальнейшей разработки генной терапии.
Для подбора условий трансфекции клетки трас-фицировали плазмидой pEGFP-Жс использованием Lipofectamine ™ 3000 (Invitrogen, США). Эффективность трансфекции оценивали на проточном цитометре NovoCyte (ACEA Biosciences, США) с использованием ПО NovoExpress (ACEA Biosciences, США). После выбора условий выполняли трансфекцию с плазмидами, содержащими CAPN3 и FKRP под управлением П1 или П2 (GenScript, США). Транскрипцию трансгенов и наличие трансгенного белка анализировали через 48 часов после начала трансфекции с помощью ПЦР-РВ на CFX96 (BioRad, США) с готовой смесью для ПЦР qPCRmix-HS (Евроген, Россия), вестерн-блоттинга.
Мы подтвердили наработку белков CAPN3 и FKRP в трансфицированных клетках. В Expi293F большее количество белков содержалось при использовании промотора П1 . Следовое количество — при использовании промотора П2. Это согласуется с более ранними публикациями других научных групп. Для С2С12 показана более высокая экспрессия обоих трансгенов при использовании тканеспецифичного промотора П2. Следующим этапом работы является верификация плазмид в модельных клеточных линиях и сборка конструкций на основе AAB для разработки генно-терапевтических препаратов.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ, соглашение № 075-15-2021-1346.
Литература:
1. Angelini C. Acta Myol. 2020. 39(4):207-217.
2. Huang, Y. et al. Hum. Mol. Genet. 2008.
3. Hanisch F. et al J Neurol 2010. 257(2):300-301.
ФОРМИРОВАНИЕ БИОАКТИВНЫХ КЕРАМИЧЕСКИХ ПОКРЫТИЙ НА ТИТАНОВЫХ ИМПЛАНТАХ
И.В. Смирнов, П.В. Смирнова, А.Ю. Тетерина, В.И. Калита, В.С. Комлев
ФГБУН Институт металлургии и материаловедения им. АА. Байкова РАН
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: фосфаты кальция, керамическое покрытие, титановый имплант.
Высокие прочностные характеристики в совокупности с нейтральными биологическими свойствами имплантов на основе титана делают их незаменимыми при замещении дефектов костной ткани в условия высоких механических нагрузок. Использование имплантов из титана и его сплавов в условиях живого организма не приводит к возникновению реакций отторжения, но возможные коррозионные реакции могут являться причиной вторичных операций. Технологии комбинирования разных материалов в одном изделии, а именно титана и фосфатов кальция (ФК), являются актуальной задачей для исследователей. Такие материалы суммируют положительные свойства друг друга и минимизируют недостатки. Применение фосфатов кальция в виде покрытия на титановый имплант значительно повышает биологические свойства конечного изделия, а именно биосовместимость и остеоинтеграцию.
В данной работе был предложен метод формирования многофазных покрытий на основе различных модификаций фосфатов кальция. Был предложен способ плазменного нанесения покрытий на основе высокотемпературных модификаций ФК гидроксиапатита (ГА) и а-трикальцийфосфата (а-ТКФ) на титановую подложку с промежуточным слоем состава TiCaO с последующей трансформацией поверхностного слоя в низкотемпературный Фк октакальцийфосфат (ОКФ).
Необходимость создания многофазных покрытий заключается в различных свойствах промежуточных слоев. Первый слой на основе TiCaO способствует прочному скреплению титановой подложки с покрытиями ГА и а-ТКФ. Плотноспеченое покрытие на основе слаборезорбируемого материала (ГА и а-ТКФ) препятствует реакциям коррозии титанового импланта. Формирование конечного слоя на основе ОКФ повышает биоактивность, так как ОКФ обладает высокой степенью резорбируемости, является прекурсором биологического гидроксиапатита (ГА) и способствует образованию новой костной ткани в областях с низким регенеративным потенциалом, что способствует быстрому образованию прочной связи между имплантом и костной тканью пациента.
Покрытие на основе ДКФД, играющее роль промежуточного звена для получения ОКФ, получено осаждением из раствора. Раствор, содержащий Ca2+ и PO43- ионы в необходимых концентрациях, вступает в реакцию с напыленным слоем ГА или а-ТКФ, что приводит к образованию и росту кристаллов ДКФД равномерно по поверхности. Формирование поверхностного слоя на основе ОКФ реализовывали за счет трансформации предварительно
осажденного ДКФД покрытия в условиях буферной системы согласно реакции:
СаНР04 -2Н20 о Са2+ + НР042- + 2Н20 НР042- о Р043- + Н+ 8Са2++ 2НР042- +4 Р043- + 5Н20 о о Са8(НР04)2( Р04)4*5Н20 Подход, совмещающий в себе метод плазменного напыления и трансформационные процессы, дает возможность создания покрытий различных составов которые могут быть скомбинированы в различных соотношениях исходя из поставленной задачи.
В данном исследовании разработана методика создания биоактивных покрытий в системах ГА/ОКФ и ТКФ/ ОКФ, способных значительно изменить конечные свойства титанового имплантата. Данные покрытия способствуют увеличению остеоинтеграции импланта с косной тканью пациента, уменьшению рисков возникновения реакций отторжения, а также уменьшению количества повторных операций ввиду повышенного срока службы импланта. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект № 20-19-00671 «Структура, фазовый состав и механические свойства плазменных композиционных покрытий с новым типом пористой структуры».
ВЛИЯНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
СЕМЕЙСТВА TET НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ
HOXA10 И HOXA11 В СТРОМАЛЬНЫХ
КЛЕТКАХ ЭНДОМЕТРИЯ ЧЕЛОВЕКА
А.С. Смирнова1, М.А. Кулебякина1, Р.Ю. Еремичев2,
Н.А. Александрушкина2, П.И. Макаревич1 2
1 Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Институт регенеративной медицины МНОЦ МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: стромальные клетки эндометрия,
H0XA10, HOXA11, ферменты семейства TET, гипоксия.
Эндометрий — одна из немногих тканей человека, обладающая высокой регенеративной способностью. В последние годы появились сведения о том, что для регенерации и обновления эндометрия важны транскрипционные факторы H0XA10 и H0XA11. Эти высококонсервативные гены участвуют в сохранении позиционной информации и постоянства строения тела, а также обеспечивают восстановление тканей и органов после повреждения. На сегодняшний день не известно, какие механизмы обеспечивают поддержание экспрессии генов H0XA10 и H0XA11 в эндометрии, а также их индукцию в ответ на стимулы, возникающие при повреждении (такие как гипоксия). Согласно данным литературы, промоторы генов H0XA10 и H0XA11 подвержены метилированию и деметилированию. Поэтому мы выдвинули гипотезу о том, что экспрессия генов H0XA10 и H0XA11 регулируется системой активного деметилирования ДНК, основными участниками которой являются активностью ферменты семейства TET (Ten-Eleven-Translocation).
Целью работы было выяснение роли ферментативной активности белков TET в поддержании и в индукции экспрессии генов H0XA10 и H0XA11 в стромальных клетках (СК) эндометрия человека.
В работе использовали первичные культуры СК эндометрия человека, полученные от молодых (20-30 лет)
