CC BY
9
к подавлению окислительного фосфорилирования и активации гликолиза [3, 4]. Ингибирование К1 с помощью shRNA к NDUFS1 или NDUFB10, или ротенона в течение всего процесса репрограммирования приводит к значительному снижению эффективности репрограммирования. Нами установлено, что уровни АФК сильно коррелируют с количеством митохондрий в процессе репрограммирования. Данные показатели достигают пика к 3-му дню, и резко снижаются к 6-му дню процесса. Снижение антиоксидантами избытка АФК в первые 3 дня репрограммирования значительно повышает эффективность репрограммирования. Однако удаление АФК в течение всего процесса или после 3-го дня репрограммирова-ния значительно подавляет процесс репрограммирования. Мы установили, что снижение уровня АФК в предшественниках ИПСК, имеющих дефицит К1, не восстанавливает, а, напротив подавляет их репрограммирование. Таким образом, сниженный уровень АФК и подавленное окислительное фосфорилирование существенно препятствует репрограммированию. Повышенный уровень АФК в клетках с нарушенной функцией К-1 не является фактором, обуславливающим снижение эффективности ре-программирования. Наши данные указывают на множественные функции АФК в процессе репрограммирования. Повышенные уровни АФК необходимы на начальном этапе, а их оптимальные уровни необходимы на последующих этапах репрограммирования. Полученные результаты также указывают, что окислительное фосфорилирование необходимо на каждой стадии данного процесса.
Благодарности: Мы благодарим В.В. Зенина и А.Н Шатрову за помощь в проведении цитофотоме-трических анализов и Банк клеточных культур ИНЦ РАН за предоставление клеток STO и МСК. Работа поддержана грантом РНФ № 20-14-00242.
Литература:
1. Folmes C.D., Nelson T.J., Martinez-Fernandez A., et al. Cell
Metab. 2011. V. 14. № 2. P. 264-71.
2. Sinenko S.A., Starkova T.Y., Kuzmin A.A., Tomilin A.N. Front.
Cell. Dev. Biol. 2021. V. 9. P. 714370.
3. Rafikov, R., Sun, X., Rafikova, O. Redox. Biol. 201 5. V. 6. P.
278-286.
4. Ni, Y., Hagras, M. A., Konstantopoulou, V. Cells. 2019. V. 8.
№ 10. P. 1149.
ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК (МСК) С ЦЕЛЬЮ УЛУЧШЕНИЯ НЕЙРОПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ ИХ СЕКРЕТОМА
М.Н. Скрябина1, С.С. Джауари1, А.Л. Примак1, Н.А. Басалова1, 2, М.А. Кулебякина1, 2, В.С. Попов1, 2, А.Ю. Ефименко1, 2, А.Я. Величко1, В.А. Ткачук1, 2, М.Н. Карагяур1, 2
1 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Институт Регенеративной медицины, Медицинский научно-образовательный центр, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: m.karagyaur@mail.ru
Ключевые слова: МСК, секретом, генетическая модификация, редактирование генома
Применение продуктов секреции стволовых клеток для стимуляции процессов обновления и регенерации ткани является перспективным терапевтическим подходом
в регенеративной медицине. Стволовые клетки, в частности, МСК секретируют широкий спектр протективных и прорегенераторных молекул и, благодаря этому, способны обеспечивать выживание поврежденных клеток, подавлять воспаление в очаге повреждения и активировать тка-неспецифичные стволовые клетки. В то же время состав секретома клеток (в том числе и МСК) лабилен и зависит от клеточного пассажа, возраста, здоровья и физиологических особенностей донора. Более того, в состав клеточного секретома зачастую могут входить факторы, обладающие противоположной активностью, что может снижать или нейтрализовать терапевтическую активность секретома.
Применение технологий геномной модификации для усиления экспрессии целевых белков и/или микроРНК и подавления экспрессии «нежелательных» молекул с целью усиления терапевтической активности клеточного секретома выглядит перспективным подходом. Генетическая модификация клеток-продуцентов позволяет решить вопросы низкой продуктивности и стандартизации получаемого бесклеточного биомедицинского продукта, приближая момент его практического использования. При этом подход достаточно безопасен, поскольку используются не сами модифицированные клетки, а лишь продукты их секреции.
Интересным побочным эффектом генетической модификации клеток является более высокая продукция такими клетками мРНК рекомбинантных белков и/ или микроРНК в составе внеклеточных везикул (аналог мРНК генной терапии), что позволяет оказывать не только немедленный терапевтический эффект на поврежденную ткань за счет воздействия белков, но и отсроченный эффект через модификацию работы генетической программы целевых клеток.
В нашей работе была осуществлена генетическая модификация мезенхимных стволовых клеток жировой ткани человека с помощью технологий генной терапии ex vivo и редактирования генома, что позволило добиться повышения количества ключевых нейротрофических, антиапоп-тотических и проангиогенных белков и микроРНК в составе секретома МСК. Мы предполагаем, что секретом таких генетически модифицированных МСК может обладать более выраженным нейропротективным эффектом в моделях in vivo, что в настоящее время изучается на модели экспериментальной интрацеребральной гематомы у крыс.
Аналогичным образом генетическая модификация клеток-продуцентов может быть применена для получения секретомов с другими терапевтическими модальностями, например, для стимуляции остеогенеза, заживления раневых дефектов и т. д.
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕПРОГРАММИРОВАНЫХ CD8+ Т-ЛИМФОЦИТОВ В ЛЕЧЕНИИ МЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКОГО
Е.Г. Скурихин1, М.А. Жукова1, А.М. Дыгайг 2
1 НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга ФГБНУ Томский национальный исследовательский медицинский центр РАН, Томск, Россия
2 ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, Москва, Россия
e-mail: eskurihin@inbox.ru, mashazyk@gmail.com
Ключевые слова: мелкоклеточный рак легкого, стволовые опухолевые клетки, опухолевые клетки, репрограммирова-ные CD8+ Т-лимфоциты, клеточная терапия.
Цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты определяют противоопухолевый иммунный ответ при раке легкого, в том числе при мелкоклеточном раке легкого (МКРЛ). Однако опухоль и ее микроокружение оказывают негативное действие на иммунные клетки. Восстановление утраченных CD8+ Т-лимфоцитов и их свойств рассматривается как одно из направлений клеточной терапии опухоли. Для повышения активности лимфоцитарного звена противоопухолевого ответа нами был предложен подход к репрограмми-рованию CD8+ Т-лимфоцитов, основанный на применении ингибитора MEK1/2 и блокатора контрольной точки PD-1. Избирательная элиминация мишени обеспечивалась предварительным «обучением» CD8+ Т-лимфоцитов анти-ген-презентирующей смесью, содержащей лизат опухолевых клеток и стволовых опухолевых клеток (СОК).
Целью настоящего исследования явилось изучение противоопухолевой активности репрограммированых CD8+ Т-лимфоцитов при раке легкого.
Объектом исследования выступали репрограмми-рованые CD8+ Т-лимфоциты человека (рчТлимф) и мышей линии C57BL/6 (рмТлимф). Эффекты рчТлимф и рмТлимф были оценены в культуре клеток карциномы легкого Льюис (LLC) и культуре опухолевых клеток и СОК пациентов с МКРЛ; а также в условиях целостного организма у мышей линии C57BL/6 на ортотопической модели LLC и модели спонтанного метастазирования LLC. В исследовании использовались морфометрический и гистологический методы, проточная цитометрия, куль-туральные методы, клеточный имиджинг, методы исследования митохондриального дыхания и др.
Репрограммирование увеличивало активность мито-хондриального дыхания и устойчивость к апоптозу CD8+ Т-лимфоцитов в культуре клеток LLC и культуре опухолевых клеток и СОК пациента с МКРЛ. При этом репрограмми-рованые клетки приобретали способность мигрировать в легкие мышей при внутривенном введении. На ортотопи-ческой модели LLC и на модели спонтанного метастазиро-вания LLC рмТлимф и рчТлимф демонстрировали антиметастатическую и противоопухолевую активности. Мишенью рмТлимф и рчТлимф выступали опухолевые клетки и СОК.
Таким образом, репрограммирование CD8+ Т-лимфоцитов ингибированием MAPK/ERK сигналинга через MEK1/2i и блокадой PD-1/PD-L1 сигналинга человеческим моноклональным антителом ниволумабом с целевой направленностью на элиминацию опухолевые клетки и СОК представляет собой перспективный путь повышения эффективности иммунотерапии МКРЛ. Целевым «обучением» CD8+ Т-лимфоцитов опухолевыми клетками и СОК пациента с МКРЛ достигается пер-сонализация лечения. Исследование выполнено за счет гранта Министерства науки и высшего образования Российской Федерации № 075-15-2020-773.
ОСОБЕННОСТИ ПЛАЗМАЛЕММЫ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ МИТОГЕННОЙ СТИМУЛЯЦИИ
Е.А. Сладкова, С.В. Заболотная, Т.А. Михайлик
Белгородский государственный национальный исследовательский университет, Белгород, Россия
e-mail: sladkova@bsu.edu.ru
Ключевые слова: лимфоциты, лейкоз, митогены, плазма-лемм, атомно-силовая микроскопия.
Основной задачей современной медицины является поиск прогностических критериев, позволяющих
выявить ранние признаки активации патологического процесса. Одним из методов, имеющих прогностическое значение при лейкозах, является цитогенетиче-ский анализ, требующий присутствия соответствующих митогенов [1]. Кроме того, реакция бласттрансформа-ции на митогены широко применяется для комплексной оценки иммунного статуса больного. Ввиду чего, целью нашего исследования явилось — изучить особенности плазмалеммы лимфоцитов здоровых доноров и больных острым лимфолейкозом (ОЛЛр) в ремиссии при митоген-ной стимуляции.
Объектом исследования служили лимфоциты больных ОЛЛ в ремиссии, контроль — клетки здоровых доноров. Митогенную стимуляцию осуществляли ФГА. Рельеф клеточной поверхности и её жесткость исследовали на атомно-силовом микроскопе (АСМ).
В лейкосуспензиях здоровых доноров при стимуляции ФГА наблюдали появление субпопуляций микро-цитов, нормоцитов и бластов. В состоянии ремиссии у больных ОЛЛ под влиянием ФГА микроцитов не обнаружено. Для нормоцитов больных ОЛЛр характерно снижение жесткости клеточной поверхности на 27% (р<0,05) по сравнению с контролем. Рельеф поверхности нормоцитов представлен глобулами и инвагинациями. Высота и ширина глобулярных выступов нормоци-тов больных ОЛЛр снизились на 39% и 85% (р<0,05) по сравнению с клетками доноров. Жесткость плаз-малеммы лимфобластов в группе пациентов с ОЛЛр снижена на 45% (р<0,05). На поверхности клеток наблюдали мелкие остроконечные глобулярные выступы, высота и количество которых снизились на 37% и 23% (р<0,05) по сравнению с бластами доноров.
Установленное в нашем исследовании разнонаправленное влияние ФГА на морфологию и жесткость лимфоцитов, вероятно, связано с разной специфичностью ре-цепторных комплексов на поверхности клеток здоровых доноров и больных ОЛЛ в ремиссии. Преобразования клеточной поверхности лимфоцитов больных ОЛЛр на фоне снижения её жесткости по сравнению с контролем при воздействии ФГА указывает на различия в работе актиновых и тубулиновых сетей цитоскелета [2].
Полученные результаты расширяют имеющиеся научные данные о морфофизиологических особенностях трансформированных лимфоцитов и наводят на мысль о необходимости дальнейшего изучения влияния митогенов на лимфоциты здоровых доноров и больных лимфопролиферативными заболеваниями с целью получить надежные данные прогностического значения о регенеративных возможностях в процессе лимфопоэза.
Литература:
1. Panagiotis B., Blanca E., Mellink C. et al. HemeSpere. J. 2022.
V. 6. P. 707.
2. Ymazaki D. Cancer Sci. 2005. V. 96. P. 379-386.
ВЛИЯНИЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ММСК И ФУКОКСАНТИНА НА ФИБРОЗ ПЕЧЕНИ
В.Н. Слаутин1, Д.Ю. Гребнев1 2, И.Ю. Маклакова1, 2, К.В. Конышев1, 2
1 ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России, Екатеринбург, Россия
2 ГАУЗ СО ИМКТ, Екатеринбург, Россия e-mail: dr-grebnev77@mail.ru
Ключевые слова: фиброз печени, фукоксантин, ММСК.
