CC BY
28Влияние терапии хондроитинсульфатом на биохимические параметры синовиальной жидкости коленного сустава человека при остеоартрозе
Рябков А.Б. (andrewbr@svs.ru) (1), Шишкин В.И. (1) (2), Кудрявцева Г.В. (2)
(1) Санкт-Петербургская клиническая больница Российской Академии Наук (2) Санкт-Петербургский Государственный Университет
Остеоартроз (ОА) - хроническое прогрессирующее дегенеративно-дистрофическое заболевание суставов, характеризующееся первичной дегенерацией суставного хряща с последующими изменениями субхондральной кости и развитием краевых остеофитов, что приводит к деформации суставов, сопровождается явным или скрыто протекающим синовитом [3, 4].
ОА становится одной из самых распространенных хронических болезней в высокоиндустриальных странах. Из-за преобладания этого заболевания среди пожилых людей тенденция к росту заболеваемости принимает мировой масштаб как следствие увеличения продолжительности жизни. В то же время, изучение ОА все еще финансово ограничивается в рамках биомедицинского исследования, а молекулярные и биофизические основы начала болезни и ее прогрессирования во многом остаются невыясненными [13].
Характеризующийся длительным и прогрессирующим характером течения, ОА редко угрожает жизни, но ассоциирован с высокой частотой формирования инвалидности у взрослых по суставному синдрому [3, 16].
Синовиальную жидкость (СЖ) можно рассматривать как интегральный показатель состояния суставных структур. Выполняя не только защитную, но и обменную функцию, непосредственно соприкасаясь со всеми микро- и макроструктурами сустава, СЖ может дать более точную информацию об их текущем состоянии.
Некоторые из основных механизмов патогенеза ОА и их влияние на состав СЖ можно представить в виде следующей схемы (рис. 1):
Рис. 1. Схема взаимосвязи основных звеньев патогенеза ОА Таким образом, ключевыми интегральными показателями активности основных патогенетических звеньев ОА, по нашему мнению, являются:
1) активность бета-гиалуронидазы и содержание глюкуроновой и гиалуроновой кислот в СЖ;
2) активность ключевых ферментов энергетического метаболизма;
3) скорость потребления кислорода клетками СЖ;
4) содержание простагландинов в СЖ.
Материалы и методы.
Диагноз подтверждался при физикальном обследовании больных, рентгенологически и при использовании биохимических, иммунологических и общеклинических критериев, удовлетворяющих диагностическим критериям ОА Американской коллегии ревматологов [6]. Характеристика исследуемых пациентов приведена в таблице 1. Всем пациентам была объяснена схема исследования, возможные риски и осложнения, после чего у каждого пациента было получено письменное согласие на участие в исследовании. Оценка клинического течения ОА проводилась с помощью альгофункциональных индексов Лекена [12] и KOOS [18].
Таблица 1
Характеристика больных ОА коленного сустава
Критерий Группа ОА (n=30)
Рентгенологическая стадия (Kellgren-Lawrence) 1,2
Индекс Лекена (Lequesne) [12], баллов 11,6±1,3
Индекс KOOS (Knee injury and Osteoarthritis Outcome Score) [18], баллов 179,2±8,1
Пол: м/ж 14/16
Средний возраст, лет 52,2±4,2
Индекс массы тела 26,12±0,32
В качестве условной нормы использовались данные анализа трупной СЖ. Оказалось, что такой методический подход вполне оправдан, поскольку полученные нами значения параметров трупной СЖ не выходили за пределы таковых у здоровых добровольцев [9]. Кроме того, наши данные не противоречили таковым, полученным ранее рядом авторов при изучении трупной СЖ [15].
СЖ извлекалась из коленных суставов людей (возраст от 30 до 55 лет), умерших в результате острой травмы, не связанной с повреждением коленных суставов (в основном -тяжелые черепно-мозговые травмы). СЖ извлекалась в течение 4 часов после смерти и немедленно обрабатывалась.
Аспирацию СЖ у испытуемых из полости сустава производили с помощью тонкой иглы в стерильных условиях. В цельной СЖ определяли цитоз и синовиоцитограмму. Для приготовления мазка на стекло наносили каплю СЖ, мазок окрашивали по Лейшману. Клеточный состав подсчитывали, исходя из процентного содержания клеток на 100
обнаруженных. С помощью метода дифференциального центрифугирования из цельной СЖ выделяли клетки и фракцию цитозоля, которую использовали в дальнейшем для определения активности ферментов и уровня метаболитов (рис. 2).
Рис. 2. Общая схема обработки СЖ
Определение активности ß-гиалуронидазы (КФ 3.2.1.35) проводили по методу [2, 7]. Определение гиалуроновой кислоты проводили по методу Грейлинга (Greiling, 1960) [17]. Определение содержания глюкуроновой кислоты поводили с нафторезорцином по методу Бюхнера [5]. Белок определяли по методу Лоури [1, 14].
Количественный анализ ПГ в СЖ осуществляли радиоиммунологическим методом с использованием набора реактивов и методических прописей фирмы «Clinical Assay» (США). Радиоактивность проб измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Mark-5» фирмы «Nuclear Chicago» (США) в диоксановом сцинтилляторе. Расчет содержания ПГ производили в нг на 1 мл СЖ.
Скорость поглощения кислорода клетками СЖ определяли на полярографе ОН-102 (Венгрия).
Все пациенты получали монотерапию препаратом хондроитинсульфата «Структум» в суточной дозе 1500 мг (3 приема по 500 мг). Все параметры исследовались до начала приема препарата, через 3 месяца постоянного приема препарата и через 1 месяц после окончания
приема препарата. Сопутствующая терапия в течение всего времени исследования оставалась неизменной.
Математические расчеты и статистический анализ полученных экспериментальных материалов проводили по общепринятым статистическим алгоритмам. Рассчитывались выборочные параметры (выборочное среднее, среднее квадратическое отклонение, средняя ошибка выборочной средней). Для оценки достоверности различий применялись параметрические методы (критерий Стьюдента критерий Вилкоксона-Манна-Уитни (и)) и непараметрические (критерий Уайта (К)). Оценка корреляции проводилась с помощью корреляционного анализа (коэффициент корреляции Уху).
Результаты и обсуждение.
В СЖ коленного сустава у больных ОА отмечается достоверное повышение активности в-гиалуронидазы в среднем на 287% (или в 3,9 раза) по сравнению с условной нормой (табл. 2)
Таблица 2
Активность бета-гиалуронидазы и содержание глюкуроновой кислоты в синовиальной жидкости коленного сустава человека при остеоартрозе и на фоне
лечения препаратом «Структум»
Условия эксперимента Бета-гиалуронидаза (Ед/л) Глюкуроновая кислота (мг/100 мл)
Контроль(п=25) <0,31 0,81±0,20
До лечения(п=30) 1,21±0,23* 1,86±0,21*
3 месяца лечения (п=30) 0,58±0,11 0,96±0,15
Спустя 1 месяц после отмены препарата (п=30) 0,42±0,10 0,83±0,10
Примечание: здесь и далее значения представлены в формате M±m; * - достоверность различий с контролем - p<0,05; n - количество испытуемых
Параллельно с этим возрастает концентрация глюкуроновой кислоты, являющейся конечным продуктом распада гиалуроновой кислоты, в среднем на 134%, или в 2,3 раза
При лечении препаратом «Структум» имеет место достоверное снижение как активности в-гиалуронидазы, так и концентрации глюкуроновой кислоты в среднем на 53% и 48% соответственно, что косвенно подтверждается зарегистрированным нами повышением содержания гиалуроновой кислоты в СЖ коленного сустава у больных ОА (рис. 3).
2,5
о о
1,5
го
IX ^
X
о
0,5
го
Норма (п=25) До лечения ХС 3 мес (п=30) (п=30)
1,6
1,4 «
го
X
1,2 X 1
ол 0,8 Щ £
0,6 ¡2 * с о
0,4
и
0,2 | 0
1 мес после отмены (п=30)
у/////л Глюкуронат —♦— Гиалуронидаза Рис. 3. Динамика содержания глюкуроновои кислоты и активности бета-гиалуронидазы в СЖ при ОА на фоне терапии препаратом хондроитинсульфата "Структум"
Нами отмечено выраженное снижение концентрации гиалуроновой кислоты в СЖ коленного сустава больных ОА в среднем в 3,8 раза по сравнению с условной нормой (табл. 3).
Таблица 3
Содержание гиалуроновой кислоты в синовиальной жидкости коленного сустава человека при остеоартрозе и на фоне лечения препаратом «Структум»,
мг/100 мл
Условия эксперимента Содержание гиалуроновой кислоты
Контроль 321±22
До лечения 85±10*
3 месяца лечения 236±24*
Спустя 1 месяц после отмены препарата 284±18
Проведенные нами эксперименты показали, что под влиянием экзогенного ХС в форме препарата «Структум» имеет место достоверное повышение концентрации гиалуроновой кислоты уже через три месяца от начала терапии в среднем на 164%, или в 2,6 раза (рис. 4).
2
1
0
При ОА события на молекулярном уровне могут развиваться в следующем направлении. В результате нарушения функции гемато-гистологических барьеров организма происходит активация протеолитической системы плазминоген-плазмин, которая высвобождает гиалуроновую кислоту из ее связи с белковым компонентом, далее подключается система кислых протеаз, где гиалуронидаза воздействует на ставший доступным для нее субстрат - гиалуроновую кислоту и катализирует процесс деполимеризации последней до свободных гексоз, нарушая тканевую проницаемость и снимая защитные барьеры.
Таким образом, ферментативная функциональная система «гиалуроновая кислота -гиалуронидаза» является одним из важных компонентов гуморального гомеостаза соединительной ткани.
Каскад изучаемых ферментативных реакций довольно сложен, но он практически расшифрован (рис. 5):
Рис.5. Этапы ферментативной деградации гиалуроновой кислоты Использованные биохимические подходы позволяют судить в целом не только об активности в-гиалуронидазы, но и суммарно об активности лизосомальных гидролаз (по уровню гиалуроновой кислоты как субстрата).
Таким образом, снижение активности ОА характеризуется нормализацией обмена гиалуроновой кислоты, а следовательно, и улучшением вязкостных свойств СЖ. Нормализация механических свойств СЖ может играть одну из ведущих ролей в снижении интенсивности процессов разрушения хряща и других тканей сустава, способствуя тем самым относительному преобладанию репаративных процессов.
Согласно полученным нами данным, при ОА имеет место достоверное повышение концентрации ПГ в СЖ по сравнению с условной нормой в среднем в два раза (табл. 3.3).
Обращает на себя внимание тот факт, что уже через три месяца от начала терапии экзогенным ХС в форме препарата «Структум» происходит значительное (в среднем на 38%) снижение концентрации ПГ в СЖ коленного сустава практически до уровня условной нормы (см. табл. 4). Интересно, что через один месяц после окончания терапии ХС тенденция к снижению продолжает сохраняться.
Таблица 4
Содержание простагландинов в синовиальной жидкости коленного сустава человека при остеоартрозе и на фоне лечения препаратом «Структум», нг/мл
Условия эксперимента ПГА ПГЕ ПГБ2-альфа ПГ
Контроль 1,0±0,1 1,5±0,2 0,7±0,2 3,7±0,3
ОА 2,3±0,3 3,4±0,4 0,9±0,2 7,1±0,4*
3 месяца лечения 1,2±0,3 2,0±0,2 0,8±0,1 4,3±0,4
Спустя 1 месяц после отмены 1,1±0,2 1,7±0,3 0,7±0,1 3,6±0,4
препарата
Примечание: ПГ - простагландины
При изучении отдельных фракций ПГ мы обнаружили, что при ОА имеет место повышение содержания ПГА в 1,9 раза, ПГЕ в 1,7 раза, а содержание ПГБ2а остается практически неизменным (рис. 6).
4 3,5 3 2,5 2 1,5 1
0,5 0
Контроль
До лечения
3 месяца лечения ХС
Спустя 1 месяц после отмены препарата
ИПГА ЕЭПГЕ 0ПГР2-альфа
Рис. 6. Динамика фракций простагландинов в СЖ при ОА на фоне терапии препаратом хондроитинсульфата "Структум"
Наши данные свидетельствуют о повышении суммарного содержания ПГ в СЖ при ОА. Учитывая, что ОА характеризуется признаками усиления воспалительных процессов в суставе, можно говорить о преимущественном повышении ПГ за счет фракции провоспалительных ПГ с депрессорной активностью (ПГА и ПГЕ). В этом мы видим еще одно коренное отличие патогенетических механизмов ОА от других заболеваний суставов, таких как ревматоидный артрит, системная красная волчанка или системная склеродермия.
Зафиксированное нами в опытах возрастание суммарной фракции ПГ при обострении ОА косвенно свидетельствует об активации двух изоформ ЦОГ (ЦОГ-1 и ЦОГ-2).
Таким образом, тенденция к нормализации уровня ПГ, наблюдаемая нами в ходе терапии ХС в течение трех месяцев, говорит о снижении активности деструктивно-
воспалительных процессов за счет возможного ингибирования циклооксигеназной ферментативной функциональной системы.
Как показал проведенный нами полярографический анализ скорости поглощения кислорода клетками СЖ, при синовите коленного сустава, связанном с ОА, возрастает скорость поглощения кислорода по сравнению с условной нормой (табл. 5)
Таблица 5
Скорость поглощения кислорода клетками синовиальной жидкости коленного сустава человека при остеоартрозе и на фоне лечения препаратом «Структум»,
наноатомов О2/мин. на 1 мг белка
Условия эксперимента Скорость поглощения кислорода
Контроль 35,8±4,4
До лечения 76,3±5,4*
3 месяца лечения 52,6±5,1*
Спустя 1 месяц после отмены препарата 42,4±4,3
Применение экзогенного ХС в виде препарата «Структум» уже через три месяца от начала лечения позволяет добиться снижения скорости поглощения кислорода клетками СЖ коленного сустава у больных ОА в среднем на 31%, что достоверно меньше, чем значение этой величины до начала терапии ХС (см. табл. 3.5).
Через один месяц после окончания перорального введения ХС нами отмечена дальнейшая тенденция к снижению скорости потребления кислорода клетками СЖ (см. табл. 3.5).
Наблюдаемое различие значений этого показателя свидетельствует о преобладании в фазе клинического обострения ОА окислительных биохимических процессов с участием кислорода. Ими могут быть, прежде всего, процессы клеточного дыхания, а также синтеза цитокинов и ПГ. Известно, что при воспалении кислород как акцептор электронов, расходуется на образование своих активных форм, в частности, радикалов и эндоперекисей [8, 10, 20]. Активные формы кислорода могут самостоятельно оказывать дезинтегрирующее действие как на клеточные элементы синовиальной оболочки и хряща, так и на макромолекулы хрящевого матрикса и СЖ [10, 11, 19].
Выводы:
1) терапия ХС приводит к параллельному снижению скорости потребления кислорода клетками СЖ и уровня ПГ в очаге воспаления, тем самым препятствуя
увеличению спонтанной генерации свободных радикалов и купируя динамику воспалительного процесса в целом;
2) подавляя выработку провоспалительных цитокинов в хряще, ХС снижает степень деградации полимерных молекул хрящевого матрикса и СЖ, о чем мы можем косвенно судить по выявленному нами повышению концентрации гиалуроновой кислоты и снижению активности ß-гиалуронидазы;
3) исследованные параметры СЖ могут служить объективными критериями активности воспалительных процессов при ОА, в том числе при оценке эффективности хондромодулирующей терапии
Заключение.
Практическая необходимость в биохимических критериях активности ОА диктуется сегодня, в первую очередь, появлением нового класса препаратов для патогенетической терапии ОА на основе хондроитинсульфата, таких как «Структум». Для объективной оценки эффективности препаратов этой группы требуются тонкие биохимические критерии, отражающие влияние действующего вещества на отдельные патогенетические звенья ОА. Полученная таким образом информация поможет в будущем в поиске и, возможно, направленном синтезе высокоселективных хондромодуляторов следующего поколения.
Механизмы воздействия ХС на рассмотренные выше механизмы патогенеза ОА, по всей видимости, разнообразны и во многом связаны с особенностями молекулярного строения ХС. Можно предполагать, что высокое содержание сульфатных групп в молекуле ХС, способных взаимодействовать с активными формами кислорода, приводит к снижению концентрации последних и, следовательно, к уменьшению процессов дезинтеграции тканей сустава. Являясь важным компонентом протеогликанов, ХС способен непосредственно участвовать в синтезе надмолекулярных структур СЖ, повышая ее хондропротекторные свойства. Список литературы:
1. Авдеев В.Г. Методы определения концентрации белка // Вопр. мед. химии. - 1977. - Т. 23, №4. - С.562-571.
2. Виха И.В., Приваленко М.Н., Хорлин А.Я. Определение активности гиалуронидазы в сыворотке крови при совместном присутствии гиалуронидазы, ß-глюкуронидазы и N-ацетил^-О-глюкозаминидазы // Вопр. медицинской химии. - 1973. - Т.19, № 3. - С. 9096.
3. Насонов Е.Л. Остеопороз и остеоартроз: взаимоисключающие или взаимодополняющие заболевания // Consilium Medicum. - 2000. - T.2, № 6. - C.248 -250.
4. Цветкова Е.С., Насонов Е.Л., Бадокин В.В. Дона перспективный препарат для лечения остеоартроза // Рос. ревматология. - 1999. - № 5. - C.34-38.
5. Agala W., Moor L., Hess E.J. Clin. Invest. - 1951. - Vol.30. - P.781.
6. Altman R. Classification of diseases: osteoarthritis // Semin. Arthr. Rheum. - 1991. - № 20. -P.40-46.
7. Appleyard R.C., Ghosh P., Swain V. Biochemical, histological and immunological studies of patellar cartilage in an ovine model of osteoatrhritis induced by lateral meniscectomy // Osteoarthrit. and Cartilage. - 1999. - Vol.7, № 3. - P. 281-294.
8. Dimock A.N., Siciliano P.D., Mcllwraith C.W. Evidence supporting an increased presence of reactive oxygen species in the diseased equine joint // Equine Vet. J. - 2000. - Vol.32, № 5. -P.439-443.
9. Heilmann H.H., Lindenhayn K., Walther H.U. Synovial volume of healthy and arthrotic human knee joints // Z. Orthop. Ihre. Grenzgeb. - 1996. - Vol.134, № 2. - P. 144-148.
10. Jahn M., Baynes J.W., Spiteller G. The reaction of hyaluronic acid and its monomers, glucuronic acid and N-acetylglucosamine, with reactive oxygen species // Carbohydr. Res. -1999. - Vol.321, № 3. - P.228-234.
11. Kurz B., Schunke M. Articular chondrocytes and synoviocytes in culture: influence of antioxidants on lipid peroxidation and proliferation // Anat. Anz. - 1997. - Vol.179, № 5. -P.439-446.
12. Lequesne M.G. The algofunctional indices for hip and knee osteoarthritis // J. Rheumatol. -1997. - № 24. - P.779-781.
13. Lohmander L.S. What is the current status of biochemical markers in the diagnosis, prognosis and monitoring of osteoarthritis? // Baillieres Clin. Rheumatol. - 1997. - Vol.11, № 4. - P.711-726.
14. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.S. // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol.193. -P.265-275.
15. Madea B., Kreuser C., Banaschak S. Postmortem biochemical examination of synovial fluid--a preliminary study // Forensic. Sci. Int. - 2001. - Vol.118, № 1. - P.29-35.
16. Martin J.A., Buckwalter J.A. Roles of articular cartilage aging and chondrocyte senescence in the pathogenesis of osteoarthritis // Iowa Orthop. J. - 2001, № 21. - P.1-7.
17. Praest B.M., Greiling H., Kock R. Assay of synovial fluid parameters: hyaluronan concentration as a potential marker for joint diseases // Clin. Chim. Acta. - 1997. - Vol.266, № 2. - P.117-128.
18. Roos E.M., Roos H.P., Lohmander L.S. et al. Knee injury and Osteoarthritis Outcome Score (KOOS): Development fo a self-administered outcome measure // J. Orthopaedic and Sports Physical Therapy. - 1998. - Vol.78, № 2. - P. 88-96.
19. Saari H., Sorsa T., Konttinen Y.T. Reactive oxygen species and hyaluronate in serum and synovial fluid in arthritis // Int. J. Tissue React. - 1990. - Vol.12, № 2. - P.81-89.
20. Stavaru C., Dolganiuc A., Baltaru D., Olinescu A. The levels of neutrophils oxidative burst in rheumatic disorders // Roum Arch. Microbiol. Immunol. - 1999. - Vol.58, № 3. - P.241-248.
