CC BY
27УДК 633.63: 631.416
Влияние стрессовых факторов in vitro на биохимические особенности адаптации растений-регенерантов Beta vulgaris L.
Н.Н. ЧЕРКАСОВА, Е.О. КОЛЕСНИКОВА, канд. биолог. наук
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова» О.А. ЗЕМЛЯНУХИНА, канд. биолог. наук (е-mail: biotechnologiya@mail.ru)
ФГБОУ ВО «Воронежский аграрный университет им. императора Петра I»
Введение
Одним из эффективных приёмов повышения урожайности растений сахарной свёклы является увеличение их адаптационной способности к условиям произрастания. В связи с этим особой актуальностью отличаются исследования по разработке методов адаптивной селекции в растениеводстве, основанных на современных достижениях биотехнологии и генетики, позволяющих за короткие сроки значительно расширить диапазон изменчивости существующих генотипов и создать формы с новыми признаками и свойствами.
Физиолого-биохимические механизмы устойчивости, проявляющиеся на клеточном уровне, позволяют повышать эффективность селекции с внедрением клеточных технологий. При создании новых форм растений с высоким потенциалом устойчивости к абиотическим стрессорам перспективно использовать клеточную селекцию [1, 3]. Отбор клеточных линий и растений с новыми хозяйственно-ценными свойствами проводится на уровне культивируемых клеток. Получение таким путём растений возможно благодаря тотипотент-ности растительной клетки. Использование селективных сред in vitro имитирует естественные стрессовые условия, что даёт воз-
можность отобрать нужные варианты. Метод клеточной селекции in vitro позволит проводить испытание и отбор устойчивых форм на клеточном уровне, а также создавать принципиально новый исходный материал в более короткий период, тем самым сокращая сроки создания высокопродуктивных гибридов, приспособленных к возделыванию в стрессовых условиях [10].
Цель исследований заключалась в выделении растений-регенеран-тов с высокой адаптационной способностью к комплексу абиотических факторов и изучении их биохимических признаков.
Материалы и методы
исследования
Материалом исследований служили генотипы сахарной свёклы Рамонской селекции: МС — муж-скостерильная форма, О-тип — фертильный закрепитель стерильности, ОП — многосемянный опылитель. Исследования проводили на питательных средах с добавлением гормонов (БАП, кинетин, ИУК, ГК, НУК) в различных концентрациях. Культивирование материала проводили в термальных комнатах при температуре 26 °С, освещённости 5000 люкс, 16-часовом фотопериоде, относительной влажности воздуха 70 % [4].
Эксплантами служили зрелые зародыши семян сахарной свёклы.
Семена предварительно очищали от перикарпа и обеззараживали 10%-ным раствором хлорамина «Б» в течение 1 часа. Для моделирования засухи в питательные среды добавляли сорбит (0,40— 0,45М), кислую среду создавали, доводя питательную основу до рН 4,0. Активность ферментов пероксидазы (ПО; КФ 1.11.17), глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы (гл.-6-Ф-ДГ; КФ 1.1.1.49), изо-цитратдегидрогеназы (ИДГ; КФ 1.1.1.42), малик-фермента (КФ 1.1.1.39), изоцитратлиазы (ИЦЛ; КФ 4.1.3.1), малатдегидро-геназы (МДГ; КФ 1.1.1.37) изучали по методам А.А. Землянухина. Количественное содержание белка определяли по методу Брэдфорда [5, 6]. В качестве растительного материала для биохимических исследований использовали листовой аппарат устойчивых и контрольных регенерантов сахарной свёклы. Ферментативную активность вычисляли с использованием коэффициентов экс-тинкции. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующего превращение 1 мкМ субстрата в 1 мин при 25 оС. Удельную активность определяли путём отношения общей активности к содержанию белка в 1 мл
ферментативного препарата. Отношение общей активности к количеству белка в 1 мл ферментативного препарата использовали для расчёта удельной активности.
Результаты исследований
и обсуждения
Проведённые исследования показали, что зрелые зародыши семян Beta vulgaris L., в отличие от других эксплантов, прорастали в более жёстких селективных условиях (сорбит 0,45М, рН среды 3,5). По-видимому, это было обусловлено наличием питательных веществ в зародыше семени, которые участвовали в регуляции метаболических процессов при прорастании [7]. Выживаемость полученных проростков при первичном отборе составила 15,0—22,7 % [8].
При повторном культивировании в стрессовых условиях полу-
ченные регенераты хорошо развивались и сохраняли признак устойчивости. Количество выживших варьировало от 58,0 до 73,5 %.
Для стимуляции процессов ри-зогенеза и массового укоренения нами было проанализировано несколько вариантов сред с различными регуляторами роста. Наиболее активное корнеобразование было отмечено на среде с основой '/2 МS и 1,0 мг/л ИМК и составило 74,3-84,0 %.
Исследования показали, что воздействие селективной питательной среды (рН 4,0; сорбит 0,45-0,40 М) приводило к гибели микроклонов. В дальнейшем при снижении стрессовой нагрузки (сорбит 0,35 М; рН-4,0) хорошо развивалась корневая система, что позволило отобрать 60,0-72,5% устойчивых растений-регенеран-тов с высокой адаптационной способностью.
В условиях стресса у растений происходит изменение экспрессии генов, сопровождающееся снижением или увеличением активности целого ряда ферментов, содержанием общего белка. Поэтому оценка биохимических изменений у регенерантов может способствовать более эффективному отбору генотипов с адаптивными способностями.
При проведении исследований были выявлены изменения в метаболизме клетки: активация или ингибирование пентозофосфат-ного и глиоксилатного циклов, ферментов ЦТК, а также ферментов окислительного стресса в зависимости от генотипа [2] (см. рис.).
Глюкозо-6-фосфат-дегидроге-наза ^АОР-зависимая) является первым ферментом пентозофос-фатного пути, откликающимся на различные изменения окружаю-
Удельная активность гл.-6-Ф-ДГ ФЕ/мг х 10 -80
60 40 20 0
МС-к MC O-типК О-тип ОП-K ОП
Малик-энзим
50 40 30 20 10
ФЕ/мг х 10 -
МС-к MC O-munK О-тип ОП-K ОП
Изоцитратлиаза
ФЕ/мг х 10 -3 20
15
10
МС-к MC O-типК О-тип ОП-K ОП
ФЕ/мг х 10-3 10 8 6 4 2 0
Перокзидаза
| I I I I
МС-к MC O-munK О-тип ОП-K ОП
Удельная активность ферментов микроклонов сахарной свёклы МС-К, О-тип-К, ОП-К — контроль; МС, О-тип, ОП—устойчивые
Удельная активность ферментов микроклонов сахарной свёклы, устойчивых к эдафическим факторам
Генотип Вариант Удельная активность (ФЕ/мг х 10-3) Количество белка, мг/мл
Гл.-6-Ф-ДГ ИЦЛ МЭ Пероксидаза
МС Контроль 57,27±3,86 6,56±0,56 28,09±1,53 6,48±0,38 0,90±0,04
Усточивый 34,60±5,70 6,56±0,56 20,25±3,47 5,21±1,94 1,45±0,16
О-тип Контроль 45,48± 4,21 9,26±0,30 30,12±3,77 6,27±0,83 0,91±0,03
Усточивый 44,12±4,14 12,21±2,30 41,61±3,98 8,63±0,88 0,82±0,10
ОП Контроль 44,01±1,61 11,69±0,38 32,56±0,57 8,02±0,60 0,91±0,06
Усточивый 50,19±3,62 17,20±1,86 40,73±0,87 5,71±0,43 0,71±0,07
щей среды по отношению к стрессорам [9]. Активность её у устойчивых регенерантов МС-формы в сравнении с контролем была понижена в 1,7 раза (34,60 ФЕ/мг * 10-3), у ОП, наоборот, была увеличена в 1,1 раза, что составило 50,19 ФЕ/мг * * 10-3 (см. табл.).
Изоцитратлиаза играет ключевую роль в протекании глиокси-латного цикла, а также принимает участие в биосинтезе серина и глицина, образовании щавелевой кислоты в клетках высших растений. Цитозольная форма ИЦЛ действует независимо от глиоксилатного цикла и участвует в превращении органических кислот, увеличиваясь к 7 суткам прорастания семян и оставаясь далее на постоянном уровне. В нашем опыте содержание его увеличилось в 1,5 (17,20 ФЕ/мг * 10-3) у ОПМ и 1,3 раза (12,21 ФЕ/мг * 103).
Малатдегидрогеназный комплекс представляет собой динамическое равновесие белков, способное чётко реагировать на физиологическое состояние и потребности организма, а также на изменения окружающей среды. Один из четырёх ферментов этого комплекса в цикле трикарбоновых кислот малик-энзим (КФ 1.1.1.39) показал примерно одинаковые значения активности: у закрепителя стерильности — увеличение в сравнении с контролем в 1,4 раза (41,61 ФЕ/мг * 10-3), у ОП -
в 1,3 раза (40,73 ФЕ/мг * 10-3), а у МС-формы — уменьшение в 1,4 раза (20,25 ФЕ/мг * 10-3 ).
Первой реакцией на стресс у живых организмов является увеличение содержания активных форм кислорода (АФК), что приводит к изменению уровня активности ферментов, участвующих в процессе детоксикации перекисных и других соединений. Одной из первых реакций на неблагоприятные факторы является активация ферментов окислительного стресса, к которым относится пероксидаза (ПО). Стандартно в стрессовых условиях активность энзима повышается. Однако в данном случае активность её увеличивалась только у закрепителя стерильности в 1,4 раза (8,63 ФЕ/мг * 10-3). Для генотипов МС и ОП, наоборот, наблюдалось снижение в 1,4 раза (5,21; 5,71 ФЕ/мг * 10-3).
Содержание растворимого белка увеличивалось только у МС до 1,6 раз (1,45 мг/л). У О-типа его количество было равно контролю, а у ОП было ниже в 1,3 раза (0,71 мг/л).
Таким образом, биохимические изменения, выражавшиеся в активации или ингибировании синтеза ферментов пентозофосфатного метаболического цикла, ЦТК, ци-топлазматической изоцитратлиа-зы, а также фермента окислительного стресса — пероксидазы, свидетельствовали об адаптационных
процессах у регенерантов, связанных с формированием устойчивости к эдафическим факторам.
Заключение
Проведённые исследования позволили выявить изменения в метаболизме клеток устойчивых регенерантов сахарной свёклы. Величина метаболического отклика в значительной степени зависела от исходного генотипа. Данные исследования необходимо продолжать в направлении изучения аспектов применения диагностики биохимических изменений микроклонов при отборе линейного материала с повышенной устойчивостью к стрессам.
Список литературы
1. Зайова, Е.Т. Използване на in vitro методи за отбор на форми захарно цвёкло, устойчиви на не-благоприятни условия: автореф. дис. ... д-ра биолог. наук / Е.Г. Зайова. - София, 2003. - 40 с.
2. Землянухина, О.А. Метаболическая адаптация растений сахарной свёклы in vitro к условиям водного дефицита / О.А. Землянухина, Н.Н. Черкасова, Т.П. Жужжа-лова // Организация и регуляция физиологических и биохимических процессов. Вып. 11. — Воронеж : ВГУ, 2009. — С. 96—102.
3. Зинченко, М.А. Клеточная селекция мягкой пшеницы на устойчивость к комплексу стрессовых
ВЕСОМЫЕ ДОХОДЫ
новое ПОКОЛЕНИЕ
^РИЧовГ
САХАР
Сделайте выбор в пользу наших гибридов! Это повысит доходность Вашего предприятия и подсластит Ваш бизнес!
BETASEED*
www.betaseed.com
АГР^ЛсЛИГА® РОССИИ
ГМ.ЦЯ:ШЛ4И1Ч1'и.»Л
Эксклюзивный дистрибьютор в РФ agro@almos-agroliga.ru www.agroliga.ru
Москва, тел.: (495) 937-32-75 Белгород, тел.: (4722) 32-34-26 Брянск, тел.: (910) 231-06-23 Воронеж, тел.: (473) 226-56-39 Казань, тел.: (916) 903-35-31 Краснодар, тел.: (861) 237-38-85
Курск, тел.: (4712) 52-07-87 Липецк, тел.: (4742) 72-41-56 Орел, тел.: (915) 514-00-54 Пенза, тел.: (8412) 45-04-68 Ростов-на-Дону, тел.: (863) 264-30-34 Рязань, тел.: (915) 610-01-54
Ставрополь, тел.: (8652) 28-34-73 Тамбов, тел.: (4752) 45-99-06 Тула, тел.: (919) 074-02-11 Ульяновск, тел.: (937) 431-85-95 Уфа, тел.: (917) 777-17-70 Чебоксары, тел.: (916) 112-96-28
факторов и анализ полученных форм / М.А. Зинченко, О.В. Дубровная, А.В. Бавол // Известия Самарского научного центра РАН. - 2013. - Т. 15. - № 10. -С. 1610-1614.
4. Знаменская, В.В. Микроклонирование in vitro как метод поддержания и размножения линий сахарной свёклы / В.В. Знаменская // Энциклопедия рода Beta: биология, генетика и селекция свёклы. - Новосибирск, 2010. -С. 420-437.
5. Кулаичев, А.П. Методы и средства комплексного анализа данных : учеб. пособие. - Изд. 4-е. -М. : ФОРУМ-ИНФА-М, 2006. -512 с.
6. Нельсон, Д. Основы биохимии Ленинджера. Биоэнергетика и метаболизм / Д. Нельсон, М. Кокс. -Т. 2. - М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2014. - 636 с.
7. Титок, В.В. Биоэнергетическая концепция гетерозиса / В.В. Титок // Доклады Нацио-
нальной академии наук Беларуси. - 2003. - № 47 (4). - С. 84-89.
8. Черкасова, Н.Н. Оптимизация технологии получения растений-регенерантов сахарной свёклы in vitro, устойчивых к эдафиче-ским факторам. / Н.Н. Черкасова, Е.О. Колесникова, Т.П. Жужжа-лова // Сахарная свёкла. - № 3. -2019. - С. 6-8.
9. Чиркова, Т.В. Физиологические основы устойчивости расте-
ний / Т.В. Чиркова : учеб. пособие для студентов биологических вузов. - СПб. : СПбГУ, 2002. - 244 с.
10. Шуплецова, О.Н. Результаты использования клеточных технологий в создании новых сортов ячменя, устойчивых к токсичности алюминия и засухе / О.Н. Шуплецова, И.Н. Щенникова // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2016. - № 20 (5). -С. 623-628.
Аннотация. Показаны особенности растений-регенерантов сахарной свёклы, культивируемых на селективных питательных средах в условиях in vitro, проявляющиеся при адаптации к стрессовым факторам внешней среды. Отобраны устойчивые растения-регенеранты. Установлены изменения в метаболизме клеток микроклонов сахарной свёклы. Показана возможность использования диагностики биохимических изменений при отборе линейного материала с повышенной устойчивостью к стрессам.
Ключевые слова: стресс, растения-регенеранты, in vitro, сорбит, селективная питательная среда, засуха, кислотность, сахарная свёкла, ферменты, адаптация. Summary. Ability of sugar beet plants-regenerants cultivated on selective nutrient media under in vitro condition to adapt to environment stress factors has been shown. Resistant plants-regenerants have been selected. Changers in metabolism of sugar beet microclones have been determined. Possibility of biochemical changes' diagnostics using for selection line material with increased resistance to stresses has been shown. Keywords: stress, plants-regenerants, in vitro, sorbitol, selective nutrient medium, drought, acidity, sugar beet, enzymes, adaptation.
