CC BY
81УДК 633.63:581.143.6
Использование проточной цитометрии для определения плоидности растений Beta vulgaris L.
Е.Н. ВАСИЛЬЧЕНКО, ст. научн. сотр.
Е.О. КОЛЕСНИКОВА, ст. научн. сотр., канд. биолог. наук
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара им. А.Л. Мазлумова» (е-mail: biotechnologiya@mail.ru)
Введение
Одним из основных элементов цитологических наблюдений, проводимых на всех этапах создания новых форм растений, является определение плоидности как компонентов скрещивания, так и полученных гибридов. Традиционный метод определения плоидности посредством подсчёта хромосом на временных или постоянных препаратах под световым микроскопом весьма трудоёмок, а так называемые косвенные методы определения плоидности по размеру устьиц, пыльцы или числу хлоропластов в эпидермальных устьич-ных клетках не отличаются высокой точностью, особенно если плоидность образцов мало различается [2].
Наиболее надёжным методом определения плоидности растений является цитометрический метод, основанный на измерении количества яДНК в клетке, который применяют на срезах, давленых препаратах, изолированных протопластах и клеточных ядрах [3]. Суть проточной цитометрии (ПЦМ) состоит в том, что световой импульс флюорохрома, который фиксируется проточным цитометром, пропорционален количеству ДНК каждого индивидуального ядра клетки, в свою очередь количество ДНК интерфазного ядра отражает плоидность последнего [5, 6]. Проточный цитометр позволяет измерить содержание ДНК и соответственно плоидность нескольких тысяч ядер за несколько минут. Сигналы анализируются компьютером, визуализируются на дисплее и в итоге подаются в виде гистограмм, выражающих распределение ядер в соответствии с интенсивностью интегральной флюоресценции каждой пробы. Этот метод отличается высокой точностью определения количества яДНК и производительностью, позволяя решать широкий круг задач генетики и селекции растений [6]. К таким задачам, в частности, относятся:
— отбор гаплоидных растений-регенерантов in vitro;
— отбор диплоидных и тетраплоидных растений in vitro и ex vitro;
— отбор триплоидных растений во время производства гибридных семян с участием мужских стерильных опылителей;
— элиминацию спонтанно возникающих миксо-плоидных форм и анеуплоидных растений.
Изменчивость генома является одним из основных элементов исследования на современном этапе создания новых форм растений сахарной свёклы как в условиях in vitro, так и в полевых условиях. Конкуренция с зарубежными фирмами и проблема создания своих, отечественных, гибридов требует высокой стабильности по плоидности и высокой однородности гибридных семян. Для их решения в селекции необходимо: использовать биотехнологические методы получения гомозиготных DH-линий сахарной свёклы, микроклонального размножения селекционно-ценных генотипов, цитологические методы определения плоидности путём внедрения современных технологий [4].
Цель исследования
В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования явился анализ ДНК-гистограмм образцов сахарной свёклы in vitro для определения их плоидно-сти, отбора гаплоидных форм и линий с удвоенным набором хромосом.
Материалы и методы исследований
В работе были использованы селекционные материалы лаборатории ЦМС ФГБНУ ВНИИСС им. А.Л. Мазлумова. Объектами выступили растения-регенеранты сахарной свёклы (Beta vulgaris L.), культивируемые в условиях in vitro. Материалом для измерения содержания яДНК служили ядра, выделенные из механически измельчённой живой растительной ткани сахарной свёклы.
Для получения суспензии ядер использовали ткань листа размером 0,5 см2 микроклонального растения, которую измельчали острым лезвием в чашках Петри с небольшим количеством лизирующего буфера (Partec, ФРГ). После измельчения добавляли 2,0 мл раствора DAPI и полученную смесь выдерживали 4 мин при комнатной температуре. Содержимое чашек фильтровали через нейлоновый фильтр с разме-
32 САХАР № 5. 2019
ром ячеек 40 мкм для очистки ядер от крупных клеточных фрагментов.
Измерение интенсивности флюоресценции и числа ядер выполняли на проточном цитометре Partec СА II, содержащем мультиканальный анализатор (Германия). Гистограммы и коэффициент вариации кривых распределения ядер (%) анализировали на компьютере с помощью соответствующей программы.
Результаты исследований и их обсуждение
В процессе биотехнологических исследований по индуцированию партеногамии важным этапом являлся отбор гаплоидных регенерантов, позволивший чётко выделить 9-хромосомные формы (n = 9). Согласно цитометрическому анализу, количество ядерной ДНК у гаплоидных микроклонов в фазе G1 составило 1С, что соответствовало уровню плоидности n = 9. Исследование уровня плоидности созданного материала представлено на гистрограмме классом клеток, соответствующих одинарному набору хромосом (рис. 1).
На оси абсцисс (х-axis) гистограммы представлены группы клеток разных уровней плоидности: пик 1 соответствует гаплоидному уровню; пик 2 — диплоидному уровню и обозначает количество делящихся клеток. На оси ординат (у-axis) показано количество измеренных клеток в каждом классе [1].
Для создания гомозиготных линий, способных участвовать в селекционном процессе, гаплоидные растения переводили на более высокий уровень пло-идности. В результате воздействия на растения мутагеном, добавленным в питательную среду in vitro, у большей части регенерантов происходило удвоение числа хромосом.
Однако следует отметить, что при колхицинирова-нии гаплоидов наблюдались нарушения в процессах деления клеток, приводящие к варьированию количества хромосом у регенерантов. Поэтому обязательное проведение браковки миксоплоидных форм дало возможность получать до 94 % регенерантов с постоянным уровнем плоидности (2n = 18) (рис. 2).
Из полученной гистограммы видно, что количество ядерной ДНК у диплоидных микроклонов в фазе G1 составляет 2С, что соответствует плоидности 2n = 18.
В отличие от гаплоидных и диплоидных растений количество ядерной ДНК у миксоплоидных форм варьировало по числу хромосом и составило 1C, 2С, 4С, что соответствовало плоидности n = (9, 18, 27) (рис. 3).
Для создания линий изучаемых генотипов отбирали растения только с диплоидным набором хромосом, выбраковывая миксоплоидные регенеранты.
Цитометрический анализ позволил с высокой точностью провести оценку исходного материала на ранних этапах развития растений-регенерантов. Это дало
Рис. 1. Гистограмма количества ядерной ДНК гаплоидных (n = 9) растений-регенерантов сахарной свёклы в культуре in vitro
Рис. 2. Гистограмма количества ядерной ДНК диплоидных (2n = 18) растений-регенерантов сахарной свёклы после колхицинирования в культуре in vitro
Рис. 3. Гистограмма количества ядерной ДНК миксоплоидныхрастений-регенерантов сахарной свёклы после колхицинирования в культуре in vitro
№ 5 • 2019 САХАР 33
возможность сформировать в культуре in vitro гомозиготные линии удвоенных гаплоидов (DH-линии), которые представляют практический интерес для селекции сахарной свёклы.
Использование метода прямого цитологического контроля необходимо не только для оценки новых форм, полученных в культуре in vitro, но и для оценки селекционного материала при создании высокопродуктивных гибридов. В селекционном процессе, связанном с непосредственным участием полиплоидных форм, первостепенное значение имеет контроль за уровнем плоидности. Поэтому на всех этапах проведения этой работы данному вопросу должно уделяться повышенное внимание.
Таким образом, анализ ДНК-гистограмм позволяет получить генетическую информацию о новых формах сахарной свёклы и обеспечить ускоренное определение их плоидности, облегчая задачу создания высокопродуктивных гибридов важной технической культуры.
Список литературы
1. Васильченко, Е.Н. Технология создания реституционных линий сахарной свёклы / Е.Н. Васильченко [и др.] // Вестник ВГАУ. - Вып. 1 (56), 2018. - С. 42-501.
2. Иванова, С.В. Морфометрическая и цитогенетическая характеристика гаплоидов томата / С.В. Иванова // Генетика. — 2000. - Т. 36. - № 1. - С. 52-61.
3. Титова, В.И.Использование метода проточной цитометрии для определения плоидности межвидовых гибридов Allium L / В.И. Титова [и др.] // Физиология растений. -1998. - № 3. - С. 76-80.
4. Юрьева, Н.А. О межвидовой гибридизации луков / Н.А. Юрьева, В.И. Титова // Тр. по селекции овощных культур. - Вып. 12. - М., 1980. - С. 98-104.
5. Galbraith, D.W. Flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting in plants: the past, present, and future / D.W. Galbraith // Biomedica. - 2010. - Vol. 30 (Suppl.). - P. 65-70.
6. Jacobsen, E. Ploidy levels in leaf callus and regenerated plants of Solanum tuberosum determined by cytophotometric measurements of protoplasts / E. Jacobsen // Theor. Appl. Genet. - 1983. -Vol. 65. - P. 113-118.
Аннотация. Использование цитометрического анализа ДНК Beta vulgaris L., основанное на флуоресцентном окрашивании ядер растений-регенерантов, дало возможность выделить генотипы с изменённой плоидностью. Метод оценки по определению содержания ядерной ДНК позволил отобрать и стабилизировать регенеранты с гаплоидным набором хромосом (n = 9), а после проведения мутагенеза осуществить отбор растений, набор хромосом которых удвоился (2n = 18).
Ключевые слова: сахарная свёкла, регенеранты, плоидность, цитометрия, ядерная ДНК.
Summary. Use of the cytometry analysis of Beta vulgaris L. DNA based on fluorescent staining of cells of plants-regenerants gave an opportunity to choose genotypes with changed ploidy. The evaluation method by nuclear DNA content determining allowed selection and stabilization of regenerants with haploid chromosome number (n = 9) and, after mutagenesis performing, selection of the plants which chromosome numbers had doubled (2n = 18). Keywords: sugar beet, regenerants, ploidy, cytometry, nuclear DNA.
34 САХАР
№ 5* 2019
