CC BY
88технология высоких урожаев
УДК 633.63:581.143.6
шт
www. nt-prom. ru
Вегетативное размножение сахарной свёклы in vitro
E.H. ВАСИЛЬЧЕНКО, ст. научн. сотрудник
Е.О. КОЛЕСНИКОВА, ст. научн. сотрудник, канд. биолог. наук
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова» (е-mail: [email protected])
Введение
В селекционной практике часто возникают проблемы, связанные с поддержанием, сохранением в чистоте и размножением идентичного родительским формам ценного исходного материала, полученного как традиционными, так и нетрадиционными методами (гаплои-дия, клеточная селекция, мутагенез, генетическая трансформация и т. д.). Решение их стало возможным после разработок приёмов вегетативного размножения растений в условиях in vitro — клонального микроразмножения. Принципиальная основа метода заключается в способности соматических клеток реализовывать присущую им тотипотентность под воздействием экзогенных факторов и формировать вегетативные побеги путём активации пазушных меристем [1, 2].
Известно, что в качестве эксплан-та пригодны листовые пластинки, черешки, верхушечные побеги цветоносов, семена. Однако апикальная меристема является наиболее удобной для микроклонирования. Это вызвано тем, что в условиях in vitro она в большинстве случаев генетически стабильна, практически свободна от вирусов, отличается высокой способностью к морфогенезу [3, 4]. Для каждой культуры необходим индивидуальный подбор условий на всех этапах микроклонирования. В связи с вышесказанным выявление основных параметров для осуществления вегетативного размножения различных генотипов сахарной свёклы в культуре in vitro является актуальным направлением исследований.
Материалы и методы исследований
В работе были использованы селекционные материалы лаборатории ЦМС ФГБНУ ВНИИСС им. А.Л. Мазлумова. Массовое вегетативное размножение проводили путём культивирования ме-ристематических тканей сахарной свёклы в условиях in vitro. Питательные среды готовили с использованием макро- и микросолей в количествах, соответствующих прописям Гамборга и Мурасиге-Скуга [5].
Результаты исследований
Основная трудность при введении сахарной свёклы в культуру in vitro состояла в высокой инфици-рованности двулетних вегетирую-щих растений. Применение стерилизующих растворов из группы хлорсодержащих позволило уничтожить инфекцию эксплантируе-мого материала, изолированного от растений, выращенных в полевых условиях. Основными индукторами развития вегетативных почек из верхушечной меристемы цветоносов сахарной свёклы явились экзогенные регуляторы роста.
К концу месяца культивирования наблюдалось формирование листьев на верхушке побега или образование боковых побегов из стеблевых меристем. В результате положительного регуляторного эффекта трёх гормонов — 6-БАП, ки-нетина и гиббереллина — в соотношении 1:1:1 удалось повысить число боковых побегов на один эксплант до 9—10 штук, а прирост микроклонов — до 62,5—79,6 мм. При этом меристематические клоны отлича-
лись наличием интенсивно зелёных листьев, оптимальным соотношением размеров черешка и листовой пластинки, хорошей кустистостью и развитой точкой роста (рис. 1).
Важным моментом в работе с исходным материалом в культуре in vitro являлся контроль развития эксплантов, поскольку в некоторых случаях в растениях-регенерантах может быть нарушено генетическое единообразие. Оно выражается в нарушении плоидности генома, появлении в потомстве стерильных растений, различного рода мутациях. Избежать этого можно только при условии тщательного контроля развития эксплантов и отборе их по морфологическим признакам на всех этапах культивирования. При этом подлежат браковке побеги, имеющие следующие морфологические изменения: витрификация, пожелтение листьев, отсутствие точек роста, формирование каллуса, сильное искривление и изменение формы листьев или черешков, появление некротирующих участков, слабый рост и развитие, сильно вытянутые, нитевидные черешки с мелкими листьями [6].
Укоренение образованных in vitro побегов достигалось изменением гормонального состава питательных сред. Проведённые нами исследования показали, что корнеобразование у 93,6 % экс-плантов сахарной свёклы вызывало добавление в питательную среду индолилмасляной кислоты (ИМК). Стимулирующее влияние на формирование корней оказывали также индолилуксусная кислота (ИУК) и нафтилуксусная кислота
За то, что наша жизнь не баёкаа,
мы говорим: спасибо, свёкла!
36 САХАР № 10 • 2019
m
FLO R I M О N D
DESPREZ
121248, Москва, Кутузовский проспект, дои 7/4. корпус 1, офис 171 +7 (495) 974-62-51 ¡nfoSflorimonrt-desprei.ru www.florimond-desprei.com
СОВРЕМЕННЫЙ ИНЖИНИРИНГ В ПРОИЗВОДСТВЕ САХАРА
www.nt-prom.ru
технология высоких урожаев
\ V
"йЁШ -'. ■
Рис. 1. Микроклональноеразмножение сахарной свёклы в культуре in vitro: а — верхушечная меристема; б — формирование листьев на верхушке побега; в — образование боковых побегов из стеблевых меристем; г — микроклон с дополнительными побегами; д — черенкование микроклона; е — микроклоны сахарной свёклы в культуре in vitro
(НУК). Однако наличие этих гормонов в питательной среде индуцировало ризогенез менее эффективно (76,1-89,3 %).
Последний этап микроразмножения — перевод пробирочных растений в нестерильные условия грунта. Для этого отбираются хорошо развитые укоренённые регенеран-ты с листьями и черешками тёмно-зелёного цвета, с недлинными, но мощными корнями. В результате исследований было установлено, что для пересадки в грунт лучшим оказался период, когда корневая система только начинала развиваться, а листовой аппарат уже был способен фотосинтезировать и обеспечивать автотрофность растений. Создание высокой влажности воздуха в период адаптации растений к условиям теплицы в первые дни после посадки позволяло обеспечить сохранность материала на 80—100 %. Сформировавшиеся в грунте микроклоны характеризовались выравненностью и морфологической однотипностью в пределах каждой линии. Выращивание в течение 3—4 месяцев на субстра-
тах песок + перегной или почва + + перегной в соотношении 1:1 давало возможность получать ште-клинги со средней массой 53 г.
Штеклинги, выращенные из микроклонов, практически не отличались от полученных из семян. Они хорошо росли в полевых условиях, образуя нормально развитые растения и жизнеспособные семена (рис. 2).
Результаты исследований легли в основу разработки приёма вегетативного микроразмножения сахарной свёклы, принципиальная схема которого предусматривает:
— введение в асептическую культуру верхушечной меристемы растения-донора;
— индуцирование экзогенными факторами ростовых почек для образования пазушных побегов;
— стимулирование пролиферации пазушных меристем и возникновения побегов более высоких порядков;
— укоренение микроклонов и перевод размноженных побегов в грунт;
— получение штеклингов.
Рис. 2. Перевод микроклонов сахарной свёклы в условия ex situ: а — укоренение микроклонов в культуре in vitro; б — микроклоны, формирующие штеклинги в закрытом грунте; в — семенные растения в открытом грунте
Данный перспективный способ вегетативного размножения растений позволяет длительное время сохранять в чистоте ценные формы сахарной свёклы и получать генетически идентичный исходному материал, сокращать продолжительность селекционного периода сахарной свёклы. Реализация предлагаемого подхода не требует больших площадей и не связана с сезонностью.
д
№ 10 • 2019 САХАР
37
т
florimond за то, что наша жизнь не блёкла, DESPREZ мы говорим: спасибо, свёкла!
121248. Москва, Кутузовский проспект, дои 7/4, корпус 1, офис 171 +7 (495) 974-62-51 ¡nfoSflorimond-cleEprsz.ru wwui.flonmond-clesprei.coiTi
РЫНОК САХАРА СТРАН СНГ 2020
27 марта
Москва,
Рэдиссон Славянская
взцены
V ПО 7) ЭКСПОРТНОЕ _
8 (l) -is ОБЪЕДИНЕНИЕ Апк СБОР
О
МЕЛАССА Щ
ЗСТ ¡д
ЖОМ р
риски ¡jj
БИОПЛАСТИК
СУБСИДИИ Н ВАЛОВЫЙ в
=" О I § I О КОРМА
£3 i!£i--------
ЦЕНЫ
^ ЖОМ
СЕВООБОРОТ
РАСТЕНИЕВОДСТВО
DLIVnn ГАУАОА
■ m g g m РАСТЕНИЕВОД ¡СНгЗ TS 8 ^ ВЫХОД САХАРА : САХАР § ТЕХНИКА
СНГ МЕЛАССА
© т МИРОВОЙ РЫНОК
ТАРИФЫ апк е£й экспорт ПЕРСПЕКТИВЫ £ т £ ПОТРЕБЛЕНИЕ Л «# Ж & 1 ПОШЛИНЫ [ "" X А V ° 5 ЛОГИСТИКА ■ СУБСИДИИ
I
— САХАР » I БАЛЛАМ
ГИБРИДЫ,
диверсификация снг
СНГ
Организаторы
sugarconference.ru [email protected] +7 495 695 37 42
Дальнейшее исследование и проработка всех этапов микроразмножения сахарной свёклы in vitro в направлении изучения и выявления механизмов взаимодействия генетических и экзогенных факторов на растительную клетку открывает возможности направленного регулирования процессов морфогенеза, что значительно повысит результативность процесса за счёт увеличения жизнеспособности клонов и повышения коэффициента размножения всех вводимых в культуру генотипов.
Список литературы
1. Батыгина, Т.Б. Размножение растений: учебник / Т.Б. Батыгина, В.Е. Васильева. — СПб. : Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2002. — 232 с.
2. Жужжалова, Т.П. Перспективные технологии изолированных тканей в селекционном процессе сахарной свёклы / Т.П. Жужжалова, Е.О. Колесникова, Н.Н. Черкасова, Е.Н. Ва-сильченко // Российская сельскохозяйственная наука. — 2018. — № 6 (ноябрь-декабрь).
3. Ritchie, J.A. In vitro shoot Regeneration from callus, leaf Axils and Petioles of sugar beet (B. vulgaris L.) / J.A. Ritchie, K.C. Short, M.R. Davey // Journal of Experimental Botany. — 1989. - Vol. 40. - № 211. - P. 277-283.
4. Slavova, J. Effective Method for Sugar Beet Haploids Obtained from unpollinated ovules. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 7:2, 34-35 doi: 10.1080/13102818.1993.10818689
5. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: учеб. пособие / Р.Г. Бутенко. - М. : ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.
6. Технология создания реституционных линий сахарной свёклы / Е.Н. Васильченко, Т.П. Жужжалова, Т.Г. Ващенко, Е.О. Колесникова // Вестник ВГАУ. - Вып. 1 (56). - 2018. -С. 42-50.
Аннотация. В статье представлен приём культивирования изолированных тканей растений в условиях in vitro, который можно использовать при размножении и создании нового исходного материала сахарной свёклы. Данный перспективный способ вегетативного размножения Beta vulgaris позволяет длительное время сохранять в чистоте ценные формы сахарной свёклы и получать материал, генетически идентичный исходному. Ключевые слова: сахарная свёкла, апикальная меристема, растения-регенеранты, микроклональное размножение, штеклинги. Summary. In the paper, a method of isolated plant tissues' cultivation under in vitro conditions that can be used for propagation and development of sugar beet new starting material is presented. This perspective method of Beta vulgaris vegetative propagation allows maintenance of valuable sugar beet forms' purity for a long time and obtaining of material being genetically identical to the initial one. Keywords: sugar beet, apical meristem, plants-regenerants, microclonal propagation, steckling.
За to, что наша жизнь he баёкаа,
мы говорим: спасибо, свёкла!
38 САХАР № 10 • 2019
Ф
FL0RIM0ND
DESPREZ
121248, Москва, Кутузовский проспект, дои 7/4. корпус 1, офис 171 +7 (495) 974-62-51 ¡пРоЭПогтпюп(1-с1е5ргег,ги www.florimoild-desprei.coni
