CC BY
42УДК 663.11
Galina G. Nianikova1, Alina A. Minina2,Anna D. Beliaeva3
INFLUENCE OF SUBSTRATUM COMPOSITION ON GROWTH OF FUNGUS RHIZOPUS ORYZAE
St. Petersburg State Institute of Technology (Technical University), Moskovsky Pr., 26, St Petersburg, 190013, Russia. e-mail: [email protected].
By using vegetable raw materials, substrates for submerged cultivation of Rhizopus oryzae F-814 were prepared. This fungus is a promising producer of chitosan, enzymes, and lactic acid. R. oryzae is also used in the Asian cuisine. It was found that the substrate on the basis of pea decoction provided the greatest increase in biomass. The influence of the concentration of glucose and ammonium sulfate, as well as the substrate volume, on the growth of the fungus on pea decoction was studied.
Keywords: Rhizopus oryzae, chitosan, lactic acid, pea substrate.
Введение
Гриб Rhizopus oryzae является перспективным объектом для научных исследований и практического применения, поскольку является продуцентом различных полезных продуктов, при этом отвечает требованиям безопасности, а именно, непатогенен, разрешен к применению в пищевой промышленности.
R. oryzae является продуцентом оптически чистой (97-99 % L-формы) молочной кислоты [1-3]. В отличие от молочнокислых бактерий, R. oryzae менее требователен к питательному субстрату, а благодаря наличию амилазы и глюкоамилазы нет необходимости в предварительном гидролизе крахмала, содержащегося в исходном сырье. R. oryzae имеет высокую скорость роста на бедных азотом средах при достаточно высоком выходе целевого продукта - молочной кислоты [4-6]. Впервые условия глубинного культивирования R. oryzae с целью получения молочной кислоты были описаны в 1936 году [7]. В качестве перспективного направления применения молочной кислоты в настоящее время рассматривается получение на ее основе полилактатов [8, 9], отличающихся от традиционных пластмасс биодеградируемостью, что важно с точки зрения экологии.
Молочная кислота синтезируется из пировино-градной кислоты (ПВК) под действием фермента лактат-дегидрогеназы. ПВК образуется из глюкозы в результате гликолиза. Процесс образования молочной кислоты грибом R. oryzae проходит в присутствии кислорода, который необходим для вывода лактата из клетки во внешнюю
Г.Г. Няникова1 , А.А. Минина2 , А.Д. Беляева3
ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОМ СРЕДЫ НА РОСТ ГРИБА RHIZOPUS ORYZAE
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Московский пр. 26, Санкт-Петербург, 190013, Россия. e-mail: [email protected].
На основе сырья растительного происхождения приготовлены питательные среды для глубинного культивирования Rhizopus oryzae F-814. Данный гриб является перспективным продуцентом хитозана, ферментов, молочной кислоты, также R. oryzae используют в азиатской кухне. Показано, что наибольший прирост биомассы обеспечивает среда на основе горохового отвара. Изучено влияние концентрации глюкозы и сульфата аммония, а также объема среды на рост гриба на гороховом отваре.
Ключевые слова: Rhizopus oryzae, хитозан, молочная кислота, гороховая среда.
среду. Транспорт лактата происходит с участием энергии АТФ, образующейся в результате окислительного фосфо-рилирования [10, 11]. Образование других органических кислот разными штаммами R. oryzae происходит в зависимости от активности ферментов, участвующих в их синтезе.
В условиях культивирования с ограниченным доступом кислорода R. oryzae выделяет в среду этиловый спирт. При этом пируват под действием фермента пи-руватдекарбоксилазы переходит в ацетальдегид, а из него - в этанол, выход которого может составлять до 37 % [12].
Разные штаммы R. oryzae продуцируют в том или ином количестве различные ферменты: амилазы [13], липазы [14], протеазы [15]. Согласно СанПин [16], R. oryzae разрешен к применению для получения липаз, пектиназ, амилаз, карбогидразы, протеаз.
Отличительной особенностью R. oryzae является образование в клеточной стенке хитозана из хитина при участии фермента хитиндезацетилазы [17].
Из биомассы R. oryzae получен хитозансодержа-щий биосорбент [18], который предложено использовать для выявления фальсифицированных напитков по признаку наличия синтетических пищевых красителей [19], а также для детоксикации пищевых продуктов [20].
R. oryzae продуцирует соединения, обладающие антифунгальным и антибактериальным действием [21]. Следовательно, препараты на их основе можно использовать для защиты растений от болезней.
1. Няникова Галина Геннадьевна, канд. биол. наук, доцент, каф. технологии микробиологического синтеза e-mail: [email protected].
Galina G. Nianikova, Ph. D (Biol.), Associate Professor, Department of Technology of Microbiological Synthesis
2. Минина Алина Алексеевна, магистрант, каф. технологии микробиологического синтеза, e-mail: [email protected]. Alina A. Minina , graduate student, Department of Technology of Microbiological Synthesis
3. Беляева Анна Дмитриевна, аспирант, каф. технологии микробиологического синтеза, e-mail: [email protected]. Anna D. Beliaeva, postgraduate student, Department of Technology of Microbiological Synthesis
Дата получения - 08 июня 2018 года
R. oryzae широко используется в азиатской кухне для приготовления традиционных блюд. Это темпе - популярный в Малайзии и Индонезии продукт, полученный в результате ферментации соевых бобов с использованием R. огугае и R. оНдоврогив. Авторы работы [21] описывают процесс приготовления пищевых продуктов с использованием различного сырья: яблоки сортов Голден и Гренни Смит, рис, орехи, семена злаковых и бобовых. Засев производили спорами гриба, инкубировали при температуре 28 оС в течение 24-48 ч. Гриб R. огугае использовали также при приготовлении напитков [21]. Проводили брожение на рисе, пшенице твердых сортов, ячмене, ржи, орехах (фундук), бобовых (горох, соя, фасоль). Авторы описывают органолептический профиль полученных продуктов: специфический вкус, аромат и своеобразную текстуру.
Перечень продуктов, которые можно получить из /?. огугае, представлены на рисунке 1.
Рисунок 1. Продукты, получаемые из ЯЫгорив огугае
Таким образом, гриб R. огугае может быть использован в различных областях, включая гастрономию.
Целью работы было исследование влияния состава питательной среды и условий глубинного культивирования на рост R. огугае.
Экспериментальная часть
Объектом исследования был гриб Rhizopus огугае (Шеп1 е1 Рппвеп-СеегНдв 1895), регистрационный номер Р-814 во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Данный штамм является продуцентом альфа-амилазы, глюкоамилазы, Ц+)-молочной кислоты.
Для получения посевного материала гриб выращивали на картофельно-глюкозном агаре в течение 7 суток. Затем споры гриба смывали стерильной водой, вносили в колбы Эрленмейера и культивировали при температуре 28 °С на качалке со скоростью вращения 220 об/мин в течение суток. Полученный посевной материал в количестве 10 % переносили в колбы Эрленмейера вместимостью 750 мл с ферментационной средой.
В данном исследовании в качестве исходного сырья для приготовления питательных сред использовали: картофель, пивное сусло, пептон, горох, рис, соевую муку, кукурузную муку.
Питательные среды готовили следующим образом:
Картофельно-глюкозная среда. 200 г очищенного сырого картофеля отваривали в течение 1 ч в 1 л водопроводной воды. Картофельный отвар разливали в стерильные колбы, добавляли при необходимости карбонат кальция, аммонийные соли, крахмал картофельный. Стерилизовали при давлении 100 кПа в течение 20 мин. Раствор глюкозы стерилизовали отдельно в режиме 50 кПа в течение 20 мин и в различных концентрациях вносили в
колбы со средой непосредственно перед культивированием.
Картофельно-глюкозный агар. 200 г очищенного сырого картофеля отваривали в течение 1 ч в 1 л водопроводной воды, отвар процеживали через марлю, доливали до 1 л водопроводной водой, добавляли в отвар 20 г агара и нагревали до полного растворения агара. Перед розливом среды в пробирки или чашки Петри, добавляли предварительно простерилизованный раствор глюкозы для достижения ее концентрации 20 г/л.
Пивное сусло. Неохмеленное пивное сусло разводили водопроводной водой до определенной концентрации редуцирующих веществ по Баллингу (измеряли ареометром АС-2). Стерилизовали при давлении 50 кПа в течение 20 мин.
Глюкозо-пептонная среда. Пептон растворяли в водопроводной воде в количестве 10 г/л, разливали в стерильные колбы. Стерилизовали при давлении 100 кПа в течение 20 мин. Раствор глюкозы стерилизовали при давлении 50 кПа и вносили в колбы с пептонной водой непосредственно перед культивированием.
Среда Сабуро. Пептон растворяли в водопроводной воде в количестве 10 г/л, добавляли дрожжевой экстракт в количестве 20 г/л, разливали в стерильные колбы. Стерилизовали при давлении 100 кПа в течение 20 мин. Раствор глюкозы стерилизовали при давлении 50 кПа и вносили в колбы с пептонной водой непосредственно перед культивированием.
Гороховая среда с глюкозой. 50 г гороха замачивали на несколько часов в 1 л воды, затем нагревали до кипения. После отстаивания фильтровали через марлю и разливали в стерильные колбы. Стерилизовали при давлении 100 кПа в течение 20 мин. Раствор глюкозы стерилизовали при давлении 50 кПа и вносили в колбы с гороховым отваром непосредственно перед культивированием в различных концентрациях.
Рисовая среда с глюкозой. 20 г риса измельчали в ступке, заливали 1 л воды, подогревали до кипения. После отстаивания фильтровали через марлю и полученный рисовый отвар разливали в колбы. Стерилизовали при 100 кПа в течение 15 мин. Раствор глюкозы стерилизовали при давлении 50 кПа и вносили в колбы с рисовым отваром непосредственно перед культивированием.
Соевая среда с глюкозой. 20 г соевой муки вносили в 1 л водопроводной воды. Стерилизовали при 100 кПа в течение 15 мин. Раствор глюкозы стерилизовали при давлении 50 кПа и вносили в колбы с соевой средой непосредственно перед культивированием.
Кукурузная среда с глюкозой. 20 г кукурузной муки вносили в 1 л водопроводной воды. Стерилизовали при 100 кПа в течение 15 мин. Раствор глюкозы стерилизовали при давлении 50 кПа и вносили в колбы с кукурузной средой непосредственно перед культивированием.
Глубинное культивирование проводили на разных вариантах сред, с разными добавками (глюкоза, сульфат аммония) в различных концентрациях, в разных объемах среды на качалочной установке с перемешиванием при 220 об/мин. при температуре 28 оС в течение трех суток.
После культивирования мицелий гриба отделяли на вакуум-фильтре, сушили до постоянного веса при температуре 50 °С и рассчитывали количество биомассы. Концентрацию глюкозы в исходной среде и в культураль-ной жидкости определяли орто-толуидиновым методом; рН среды и культуральной жидкости определяли потен-циометрически на рН-метре рН-150М со стеклянным электродом сравнения; чистоту культуры оценивали микро-скопированием.
Обсуждение результатов
В паспорте на штамм Я. огу2ав Р-814 для культивирования с целью получения молочной кислоты рекомендованы неохмеленное сусло (3,5 Б) и картофельно-глюкозная среда (2 % глюкозы). Данные среды обеспечивают высокую степень конверсии углеводов в молочную кислоту, однако выход биомассы при этом невысокий.
Ранее нами было изучено влияние на выход биомассы Я. огугав азотсодержащих добавочных компонентов при культивировании на картофельно-глюкозной среде [6, 18]. Было установлено, что наибольший прирост биомассы достигается на картофельно-глюкозной среде с добавлением в качестве источника азота сульфата аммония в количестве 15 г/л.
В данной работе мы ориентировались на крах-малсодержащие среды, поскольку особенностью данного штамма является высокая активность альфа-амилазы и глюкоамилазы. При выборе исходного сырья для приготовления питательных сред также учитывали доступность, низкую стоимость, способность обеспечивать хороший рост продуцента и не затруднять выделение целевого продукта.
Культивирование Я. огугав на пивном сусле (4 Б), гороховой, соевой, рисовой, кукурузной, картофельной и пептонной средах с добавлением глюкозы показало, что наибольший выход биомассы достигается на пивном сусле и горохово-глюкозной среде. В присутствии большого количества глюкозы (4 %) на всех средах наблюдали эффект субстратного ингибирования роста. По результатам предварительных экспериментов была выбрана для дальнейших исследований среда на основе горохового отвара как наиболее перспективная для получения биомассы Я. огугав.
Результаты культивирования гриба на гороховом отваре с различными концентрациями глюкозы и сульфата аммония представлены в таблице. Из данных, приведенных в таблице, видно, что присутствие (МН4)2Б04 оказывает значительное влияние на рост гриба и способствует увеличению выхода биомассы в несколько раз. Так, при добавлении 1 % (МН4)2Б04 к гороховой среде с концентрацией глюкозы 0,5 %, 1,0 % и 2,0 % количество биомассы увеличивается 2,3, 2,1 и 1,7 раза соответственно.
Можно сделать заключение о целесообразности дополнительного внесения в гороховый отвар сульфата аммония как легкодоступного источника азота, несмотря на присутствие в горохе аммонийного азота в составе белка. Это связано с низкой активностью протеаз у данного штамма Я. огугав.
Оптимальной концентрацией глюкозы является (0,5-1,0)%. При повышении концентрации глюкозы с 1,0% до 2,0 % количество биомассы снижается в 2 раза. Дальнейшее увеличение концентрации глюкозы в среде способствует синтезу молочной кислоты, но при этом выход биомассы значительно снижается.
Таблица. Рост Я. огугав на гороховой среде с различными кон-
Концентрация глюкозы, г/л Концентрация (ЫН4)2Б04, г/л Концентрация биомассы, г/л
20 10 15,43 ± 1,80
10 10 20,85 ± 0,83
5 10 22,73 ± 0,98
0 10 3,17 ± 0,13
20 0 9,14 ± 0,71
10 0 9,92 ± 1,05
5 0 9,82 ± 0,95
0 0 4,54 ± 0,45
На рисунке 2 представлены результаты роста гриба на горохово-глюкозной и картофельно-глюкозной средах с разными концентрациями глюкозы, но без дополнительного внесения сульфата аммония.
Из диаграммы, представленной на рисунке 2, видно, что выход биомассы гриба на картофельно-глюкозной среде ниже, чем на горохово-глюкозной среде, что, возможно, связано с более высоким содержанием крахмала в горохе по сравнению с картофелем. В горохе содержится в 3 раза больше крахмала, чем в картофеле [22] - в горохе на долю крахмала приходится 45 % массы, тогда как в картофеле всего 15 %. Также горох является богатым источником азота (23 % белка), тогда как в картофеле на белковую часть приходится всего 2 %.
Таким образом, наибольший выход биомассы Я. огугав (рисунок 3) обеспечивает среда следующего состава, г/л: горох - 50; глюкоза - 5; (МН4)2Б04 - 10,0; рН = 7,0.
Концентрация глюкозы, % ■ Картофельно-глюкоэная среда и Горохово-глюкозная среда
Рисунок 2. Выход биомассы Я. огугае на горохово-глюкозной и картофельно-глюкозной средах
Рисунок 3. Рост Я. огугав на горохово-глюкозной среде
Было изучено влияние объема среды на выход биомассы при культивировании на горохово-глюкозной среде колбах Эрленмейера с объемом среды 100, 150, 200 и 250 мл с течение трех суток. Результаты представлены на рисунке 4.
—
° 250 мл 200 мл 150мл 100 мл
□ Концентрация биомассы, г/л
Рисунок 4. Влияние объема среды на выход биомассы Я. огугае
Как видно из результатов, представленных на рисунке 4, снижение объема среды с 250 мл до 100 мл способствует увеличению выхода биомассы почти в 2 раза. Чем меньше объем среды в колбах, тем более активен массообмен, способствующий быстрой доставке кислорода к клеткам и, соответственно, более активному росту гриба.
Также в ходе экспериментов было установлено, что характер роста гриба влияет на выход биомассы. Так, рост гриба пеллетами имеет преимущества перед ростом сгустком за счет увеличения площади массообмена. При культивировании Я111горив огугае на гороховой среде с исходной концентрацией глюкозы 5 г/л конверсия сахаров в биомассу на третьи сутки культивирования составила 88% при росте гриба пеллетами и 84 % при росте сгустком.
Заключение
Я. огугае способен расщеплять крахмал благодаря наличию амилолитических ферментов, что позволяет упростить процесс получения целевых продуктов, исключив стадию предварительного гидролиза крахмалсодер-жащего субстрата. Регулируя соотношение углерод / азот в питательной среде, а также условия культивирования (рН, уровень аэрации, время культивирования), можно получать в различных соотношениях биомассу, молочную кислоту и этанол. Увеличение содержания азота в питательной среде положительно сказывается на росте Я. огугае, в то время как ограничение по азоту приводит к достижению более высоких выходов молочной кислоты.
По нашим данным, наилучший рост гриба Я. огу-гае в глубинных условиях обеспечивает питательная среда на основе горохового отвара с добавлением глюкозы (0,5 - 1,0 %) и сульфата аммония (1,0 %). Применяемое для их приготовления сырье доступно и недорого. Кроме того, определенная селективность среды, учитывающая биохимические особенности гриба, уменьшает риск заражения посторонней микрофлорой.
Изменение условий аэрации (в модельных опытах это достигали за счет различных объемов питательной среды в колбе: от 100 до 250 мл при вместимости колбы Эрленмейера 750 мл) влияло на выход биомассы. Установлено, что при увеличении доступа кислорода (снижении объема горохово-глюкозной среды в колбе от 250 до 100 мл при одной и той же скорости перемешивания - 220 об/мин) концентрация биомассы увеличивалась на 70 %.
На выход биомассы значительное влияние оказывает характер роста гриба. Так, при росте гриба пеллета-ми повышается выход биомассы за счет лучшего массооб-мена. При выборе сырья для ферментации необходимо также учитывать возможность успешного отделения био-
массы, поэтому при культивировании гриба на средах с большим количеством взвеси предпочтительно выращивать гриб в виде сгустка.
Литература
1. Zhang Zh. Yi., Jin B, Kelly J.M. Production of lactic acid from renewable materials by Rhizopus fungi // Biochemical engineering journal. 2007. No 35. P. 251-263.
2. Watanabe T, Oda Y. Comparison of sucrose-hydrolyzing enzymes produced by Rhizopus oryzae and Amy-lomyces rouxii // Bioscience, biotechnology, and biochemistry. 2008. Vol. 72. No 12. P. 3167-3173.
3. Dong X.-Y., Bai S, Sun Y Production of L(+)-lactic acid with Rhizopus oryzae immobilized in polyurethane foam cubes // Biotechnology letters. 1996. Vol. 18. No 2. P. 225-228.
4. Chunmei G, Yingge Y, Yonghong F, Wen L, Renrui P., Zhiming Zh, Zengiang Y. Improvement of L(+)-lactic acid production of Rhizopus oryzae by low-energy ions and analysis of its mechanism // Plasma science technologies. 2008. Vol. 10. No 1. P. 131-135.
5. Fu Y, Xu Q, Li Sh, Huang H, Chen Y A novel multi-stage preculture strategy of Rhizopus oryzae ME-F12 for fumaric acid production in a stirred-tank reactor // World journal of microbiology and biotechnology. 2009. Vol. 25. No 10. P. 1871-1876.
6. Няникова Г.Г., Комиссарчик С.М, Хрусталёва М.В. Исследование условий культивирования Rhizopus oryzae для получения молочной кислоты и биосорбента // Известия СПбГТИ(ТУ). 2012. № 17(43). С. 56-60.
7. LockwoodL.B., G.E. Ward. The physiology of Rhizopus oryzae // Journal of Agricultural Research. 1936. № 53 (11). Р. 849-857.
8. Buyukkileci A.O. Lactate and ethanol productions by Rhizopus oryzae ATCC 9363 and activities of related pyruvate branch point enzymes // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2006. Vol. 102. № 5. P. 464-466.
9. Longacre A. Flux analysis of glucose metabolism in Rhizopus oryzae for purpose of increasing lactate yields // Fungal Genetic Biology. 1997. № 21. P. 30-39.
10. Skory Ch. D. Isolation and expression of lactate dehydrogenase genes from Rhizopus oryzae // Applied and Environmental Microbiology. 2000. Vol. 66, № 6. P. 23432348.
11. Skory Ch. D. Induction of Rhizopus oryzae pyruvate decarboxylase genes // Current Microbiology. 2003. Vol. 47. P. 59-64.
12. Buyukkileci A.O. Lactate and ethanol productions by Rhizopus oryzae ATCC 9363 and activities of related pyruvate branch point enzymes // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2006. Vol. 102. № 5. P. 464-466.
13. Ray R.C. Extracellular amylase(s) production by fungi Botryodiplodia theobromae and Rhizopus oryzae grown on cassava starch residue // Journal of Environmental Biology. 2004. Vol. 25. No. 4. P. 489-495.
14. Янышева Н.В. Выделение, иммобилизация и практическое использование липолитического комплекса Rhizopus oryzae 1403: дис. ... канд. хим. наук : 03.00.23. Москва, 2005. 203 c.
15. Домарадский И.В. Градова Н.Б. Очерки микологии для экологов / под ред. И.Б. Ушакова. М.: Истоки, 2007. 86 с.
16. СанПин 2.3.2.1078-01. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Введ. 2002-09-01. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010.
17. Longacre A. Flux analysis of glucose metabolism in Rhizopus oryzae for purpose of increasing lactate yields // Fungal Genetic Biology. 1997. № 21. P. 30-39.
18. Комиссарчик С.М. Получение биосорбентов для выявления пищевых синтетических красителей в напитках: дис. ... канд. техн. наук : 03.01.06. СПб, 2011. 167 с.
19. Комиссарчик С.М., Няникова Г.Г. Способ определения синтетических красителей в алкогольсодержащих напитках: пат. 2324179 Рос. Федерация. 2006134948/13; заявл. 04.10.2006; опубл. 10.05.2008. Бюл. № 13. С. 5.
20. Няникова Г.Г., Комиссарчик С.М., Васёшенкова М.А., Молчанова К.В., Соколова Д.А., Маметнабиев Т.Э. Сорбционные свойства гриба Rhizopus oryzae // Известия СПбГТИ (ТУ). 2015. № 29(55). С. 61-65.
21. Cantabrana I., Perise R., Hernandez I. Uses of Rhizopus oryzae in the kitchen // International Journal of Gastronomy and Food Science. 2015. 2. Р.103-111.
22. Скурихин, И.М. Химический состав российских пищевых продуктов: справочник / под ред. член-корр. МАИ, проф. И.М. Скурихина и акад. РАМН, проф. В.А. Ту-тельяна. Х46 М.: ДеЛи принт, 2002. 236 с.
Reference
1. Zhang Zh. Yi, Jin B, Kely J.M. Production of lactic acid from renewable materials by Rhizopus fungi // Biochemical engineering journal. 2007. No 35. P. 251-263.
2. Watanabe T, Oda Y Comparison of sucrose-hydrolyzing enzymes produced by Rhizopus oryzae and Amy-lomyces rouxii // Bioscience, biotechnology, and biochemistry. 2008. Vol. 72. No 12. P. 3167-3173.
3. Dong X.-Y, Bai S., Sun Y Production of L(+)-lactic acid with Rhizopus oryzae immobilized in polyurethane foam cubes // Biotechnology letters. 1996. Vol. 18. No 2. P. 225-228.
4. Chunmei G, Yingge Y, Yonghong F, Wen L, Renrui P., Zhiming Zh., Zengiiang Y. Improvement of L(+)-lactic acid production of Rhizopus oryzae by low-energy ions and analysis of its mechanism // Plasma science technologies. 2008. Vol. 10. No 1. P. 131-135.
5. Fu Y, Xu Q, Li Sh., Huang H., Chen Y A novel multi-stage preculture strategy of Rhizopus oryzae ME-F12 for fumaric acid production in a stirred-tank reactor // World journal of microbiology and biotechnology. 2009. Vol. 25. No 10. P. 1871-1876.
6. Nyanikova G.G, Komissarchik S.M, Khrustaleva M.VIssledovaniye usloviy kultivirovaniya Rhizopus oryzae dlya polucheniya molochnoy kisloty i biosorbenta (Investigation of the conditions of cultivation of Rhizopus oryzae for the production of lactic acid and biosorbent) // Izvestiya SPbGTI(TU). 2012. № 17(43). S. 56-60 (in Russian).
7. Lockwood L.B., G.E. Ward. The physiology of Rhizopus oryzae // Journal of Agricultural Research. 1936. № 53 (11). Р. 849-857.
8. BuyukkHeciA.O. Lactate and ethanol productions by Rhizopus oryzae ATCC 9363 and activities of related py-ruvate branch point enzymes // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2006. Vol. 102. № 5. P. 464-466.
9. Longacre A. Flux analysis of glucose metabolism in Rhizopus oryzae for purpose of increasing lactate yields // Fungal Genetic Biology. 1997. № 21. P. 30-39.
10. Skory Ch. D. Isolation and expression of lactate dehydrogenase genes from Rhizopus oryzae // Applied and Environmental Microbiology. 2000. Vol. 66, № 6. P. 23432348.
11. Skory Ch. D. Induction of Rhizopus oryzae pyruvate decarboxylase genes // Current Microbiology. 2003. Vol. 47. P. 59-64.
12. BuyukkHeci A.O. Lactate and ethanol productions by Rhizopus oryzae ATCC 9363 and activities of related pyruvate branch point enzymes // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2006. Vol. 102. № 5. P. 464-466.
13. Ray R.C. Extracellular amylase(s) production by fungi Botryodiplodia theobromae and Rhizopus oryzae grown on cassava starch residue // Journal of Environmental Biology. 2004. Vol. 25. No. 4. P. 489-495.
14. Yanysheva N. V. . (Isolation Vydeleniye. immobili-zatsiya i prakticheskoye ispolzovaniye lipoliticheskogo kom-pleksa Rhizopus oryzae 1403: 03.00.23. Moskva. 2005. 203 c, immobilization and practical use of the lipolytic complex Rhizopus oryzae 1403): dis. ... kand. khim. nauk : 03.00.23. Moscow, 2005. 203 p. (in Russian).
15. DomaradskyI.V. Gradova N.B. Ocherki mikologii dlya ekologov (Essays on mycology for ecologists) / Ed. I.B. Ushakov. Moscow: Istoki, 2007. 86 p. (in Russian).
16. SanPin 2.3.2.1078-01. Gigiyenicheskiye trebo-vaniya bezopasnosti i pishchevoy tsennosti pishchevykh produktov. Vved. 2002-09-01. M.: Federalnyy tsentr gigiyeny i epidemiologii Rospotrebnadzora. 2010.
17. Longacre A. Flux analysis of glucose metabolism in Rhizopus oryzae for purpose of increasing lactate yields // Fungal Genetic Biology. 1997. № 21. P. 30-39.
18. Kommissarchik S.M. Polucheniye biosorbentov dlya vyyavleniya pishchevykh sinteticheskikh krasiteley v na-pitkakh (Reception of biosorbents for revealing food synthetic dyes in drinks): dis. ... kand. tekhn. nauk: 03.01.06. St. Petersburg, 2011. 167 p. (in Russian).
19. Komissarchik S.M, Nyanikova G.G. . Sposob opredeleniya sinteticheskikh krasiteley v alkogolsoderzhash-chikh napitkakh (Method for the determination of synthetic dyes in alcohol-containing beverages): pat. 2324179 Ros. Federatsiya. 2006134948/13; zayavl. 04.10.2006; opubl. 10.05.2008. Byul. № 13. S. 5/ Pat. 2324179 RF, IPC G01N33 / 14; claimed. 04.10.2006; publ. 10.05.2008, Bul. №13. P. 5. (in Russian).
20. Nyanikova G.G, Komissarchik S.M, Vasyoshenko-va M.A, Moichanova K.V, Sokolova D.A, Mametnabiev T.E Sorbtsionnyye svoystva griba Rhizopus oryzae (Sorption properties of the fungus Rhizopus oryzae) // Izvestiya SPbGTI (TU). 2015. № 29(55). S. 61-65. (in Russian).
21. Cantabrana I., Perise R., Hernandez I. Uses of Rhizopus oryzae in the kitchen // International Journal of Gastronomy and Food Science. 2015. 2. P.103-111.
22. Skurikhin. I.M. Khimicheskiy sostav rossiyskikh pishchevykh produktov: spravochnik / pod red. chlen-korr. MAI. prof. I.M. Skurikhina i akad. RAMN. prof. V.A. Tuteliana. Kh46 M.: DeLi print. 2002. 236 s.
