CC BY
61
УДК 663.15
Л. А. Зимагулова, В. М. Гематдинова, А. В. Канарский
СИНТЕЗ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ ГРИБОМ RHIZOPUS ORYZAE КУЛЬТИВИРОВАНИЕМ НА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ ИЗ ОВСЯНЫХ ОТРУБЕЙ
Ключевые слова: овсяные отруби, гидролизаты крахмала и белков, Rhizopus oryzae, культивирование, молочная кислота.
Показана целесообразность синтеза молочной кислоты Rhizopus oryzae F-1030 при культивировании отъемно-доливным методом на питательной среде, приготовленной из гидролизатов крахмала и белков овсяных отрубей.
Keywords: oat bran, hydrolysates of starch and proteins, Rhizopus oryzae, culturing, lactic acid.
The reasonability of the synthesis of lactic acid Rhizopus oryzae F-1030 in the cultivation detachable-drevnem method on a nutrient medium prepared from hydrolysates of starch and protein oat bran.
Введение
Молочная кислота (лактат) — а-оксипропионовая (2-гидроксипропановая) кислота. В пищевой промышленности используется как консервант и антиоксидант. Применяется молочная кислота в консервной, мясоперерабатывающей, рыбной, молокоперерабатывающей, масложировой и других отраслях пищевой промышленности. Относительно высокая стоимость молочной кислоты -основной фактор, ограничивающий её широкое применение в качестве подкислителя, консерванта, регулятора рН, улучшителя вкуса, запаха и структуры пищевых продуктов [1,2,3]. Молочная кислота находит применение в сельском хозяйстве для приготовления и консервирования кормов; в ветеринарии как препарат, обладающий антисептическим и противобродильным действием [4]. Молочную кислоту также используют в текстильной, кожевенной, парфюмерно-косметической и фармацевтической промышленности, в изготовлении растворителей и пластификаторов [1]. Молочная кислота хорошо полимеризуется. Спрос на нее вырос в связи с возможностью ее использования в качестве исходного сырья для биоразлагаемых полимеров, оксигениро-ванных веществ, регуляторов роста растений и химических продуктов специального назначения [5]. Мировые объемы производство молочной кислоты увеличиваются из года в год, основываясь на совершенствование технологии.
Получение молочной кислоты проводят двумя способами: химическим (органический синтез) и микробиологическим. Микробиологический метод производства молочной кислоты является экономически достаточно эффективным. Получают молочную кислоту молочнокислым брожением глюкозы [6]. Микроорганизмы синтезируют молочную кислоту на различных источниках углерода: сахар, рафинадная патока, меласса, сахарный сироп и др., что существенно увеличивает себестоимость конечного продукта.
Молочную кислоту получают с использованием различных продуцентов - бактерий и мицелиалъных грибов [1].
Питательная среда обеспечивает необходимые условия для культивирования. В состав питательной среды входят различные органические и неоргани-
ческие вещества, содержащие углерод, азот, фосфор и другие минеральные вещества, витамины.
Сырьем для получения молочной кислоты могут служить различные углеводы. В отечественном производстве молочной кислоты сырьем служит крахмал, смесь тростникового сахара-сырца, рафинадной потоки и свекловичной мелассы. Источником необходимых органических и минеральных веществ являются солодовые ростки. Применение мелассы позволяет ускорить процесс брожения из-за наличия в ней необходимых для молочнокислого брожения веществ. Однако из-за интенсивной окраски мелассы применение большого ее количества приводит к затруднениям при очистке молочной кислоты. Для получения молочной кислоты рекомендуется использовать отходы переработки молока (сыворотки) и производства фруктовых соков [1,7].
Актуальным является получение дешевых источников сырья для получения молочной кислоты из различных отходов перерабатываемой промышленности сельского хозяйства содержащих крахмал. В частности, источником глюкозы может являться крахмал отрубей. Однако использование всевозможных сырьевых ресурсов содержащих клетчатку приводит к снижению производительности технологического оборудования. В этой связи появляется необходимость предварительного отделения клетчатки от крахмала и более эффективного использования биогенных веществ, присутствующих в сырье.
Применение в качестве источника углерода крахмалосодержащего сырья позволяет рассматривать в качестве перспективного продуцента молочной кислоты мицелиальный гриб Rhizopus oryzae, который обладает амилолитической активностью [2,8,9]. Следует отметить, что рекомендуемый периодический способ культивирования гриба Rhizopus oryzae не эффективен. Биомассы гриба по завершению культивирования в дальнейшем не используется. Для более полного использования физиологических возможностей рассматриваемого продуцента необходим поиск рациональных способов культивирования.
Целью настоящей работы является обоснование возможности культивирования гриба Rhizopus ory-zae на питательной среде из отрубей овса с получением молочной кислоты.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1) Ферментативный метод разделения клетчатки, крахмала и биогенных веществ отрубей для приготовления питательной среды.
2) Определение эффективности синтеза молочной кислоты при культивировании гриба Rhizopus oryzae отъемно-доливным методом.
Методическая часть
Использованные в исследованиях овсяные отруби содержали клетчатки 14,6-16,4 %, сахара 246,0 %, крахмала 21,2-23,8 %; массовая доля жира 2,5-2,8 %; массовая доля влаги и летучих веществ 11,1 %; сырого протеина 10,05-11,30%; содержание влаги 6,18%; массовая доля азота - 1,90%.
Отруби обрабатывали ферментами для выделения и гидролиза крахмала до простых сахаров и олигомеров, а также для получения биогенных веществ из протеина. Использовали ферментные препараты:
- а-амилаза AG XXL фирмы «Novozymes», производства Швеции. Активность а-амилазы AG XXL 460 AGU/мл, рН 6-7;
- Proteks 6 L фирмы «Genencor», производства Финляндии. Ферментный препарат активностью 580 DU/г, рН 6-10.
Ферментативный гидролиз крахмала и белков проводили в колбах с непрерывным перемешиванием и термостатированием на шейкере. Ферментативный гидролиз крахмала: гидромодуль 1:10, расход фермента а-амилазе на 1 г крахмала - 4,6 AGU/мл, t=45 оС, т =6 ч. pH=7. Ферментативный гидролиз крахмала контролировался определением содержания редуцирующих веществ (РВ) и заканчивался после прекращения увеличения содержания РВ в гидролизате [11].
Затем гидролизат крахмала и нерастворившиеся вещества разделяли центрифугированием при параметрах w = 7000, т = 10 мин.
Нерастворившиеся вещества, содержащие белки и клетчатку, обрабатывали ферментом Proteks 6 L, гидромодуль 1:5, расход фермента Proteks 6 L на 1г. белка 17,109 DU/g., t = 45 о С., т = 6 ч., pH 7 при непрерывном перемешивании.
Продуцентом молочной кислоты выбран штамм Rhizopus oryzae F-1030, полученный из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов.
Питательной средой для культивирования служил гидролизат крахмала и белков овсяных отрубей. Культивирование Rhizopus oryzae проводили в колбах вместимостью 250 мл при температуре 28±1 °С без перемешивания. Общий объем питательной среды составил 150 мл, содержал редуцирующие вещества 3-8 г/л и имел рН 4,5-6. Стерилизацию питательной среды проводили при 115 °С в течение 30 мин, охлаждали до температуры 28±1 °С без, вносили чистую культуру Rhizopus oryzae F-1030.
Культивирование проводили отъемно-доливным способом. На 3-4 сутки в течение 21 суток культи-
вирования отбирали 100 мл и доливали такой же объем стерилизованной и охлажденной до 28±1 0С питательной среды. В отобранной культуральной жидкости определяли количеством редуцирующих веществ, рН, концентрацию молочной кислоты. В питательную среде контролировали количество редуцирующих веществ, рН, температуру.
Содержание молочной кислоты в культуральной жидкости определяли титрованием 1Н раствором №ОН. рН определяли рН-метром рН-150МИ.
Для выделения молочной кислоты культураль-ную жидкость обрабатывали гашеной известью, доводя значение рН до 10. Затем отделяли лактат кальция центрифугированием. Надосадочную жидкость выпаривали, охлаждали и проводили повторное выделение лактата кальция. Указанную обработку надосадочной жидкости проводили 4 раза.
Затем отделенные центрифугированием осадки лактата кальция смешивали, растворяли дистиллированной водой и доводили концентрированной H2SO4 рН до 2±0,5. По стечению суток выпавшую гипсовую смесь отделяли центрифугированием. Далее надосадочную жидкость, содержащую молочную кислоту, дополнительно очищали от гипса фильтрованием.
Выход молочной кислоты определяли на стадиях культивирования и выделения из культуральной жидкости по формуле:
Q=К/Р*100%,
где Q - выход молочной кислоты,%; К - количество молочной кислоты, г; Р - расход РВ, г.
Результаты и обсуждение
Как видно из результатов, представленных в таблице 1, физиологическая активность гриба Rhizopus oryzae продуцента молочной кислоты взаимосвязана с продолжительностью культивирования. В начальный период культивирования гриба Rhizopus oryzae наблюдается низкий выход молочной кислоты и значительный расход РВ, которые трансформируются в биомассу. После отделения культуральной жидкости от биомассы гриба и внесения питательной среды выход молочной кислоты увеличивается. Эта закономерность наблюдается и на последующих стадиях отъемно-доливного культивирования гриба Rhizopus oryzae до 16 суток культивирования. Судя по расходу РВ, гриб Rhizopus oryzae не растет и большая часть РВ расходуется на синтез молочной кислоты.
Затем физиологическая активность снижается. На 21 сутки культивирования выход молочной кислоты снижается при достаточно высоком расходе РВ. Видимо, гриб Rhizopus oryzae «стареет», и РВ расходуются на поддержание лишь жизнедеятельности микроорганизма.
Общий выход молочной кислоты на стадии культивировании гриба Rhizopus oryzae на питательной среде из гидролизатов крахмала и белка овсяных отрубей отъемно-доливным методом составляет более 16 %.
Таблица 1 - Выход молочной кислоты на стадии культивирования гриба Rhizopus огугае
Продолжительность культивирования, сутки pH культуральной жидкости Объем, мл. Концентрация молочной кислоты в культуральной жидкости % Расход РВ, г Количество молочной кислоты, г Выход молочной кислоты, %
3 4,9 100 0,44 6,22 0,44 7,07
6 4,8 100 0,71 6,3 0,71 11,27
9 5,2 100 0,71 4,51 0,71 15,74
13 4,6 125 0,71 4,88 0,85 18,21
16 4,1 100 0,62 0,91 0,71 68,13
21 4,0 195 0,62 5,11 1,21 23,66
Итого - - - 27,93 4,63 16,58
Таблица 2 - Выход молочной кислоты на стадии выделения молочной кислоты из лактата кальция
Стадия обработки надосадочной жидкости Объем раствора лактата кальция, мл pH при определении концентрации молочной кислоты Концентрация молочной кислоты в надосадочной жидкости, % Количество молочной кислоты, г/
1 76 2,64 1,53 1,16
2 115 2,38 0,72 0,82
3 113 1,64 1,98 2,24
4 92 1,95 0,72 0,66
Итого - - - 4,88
Выход, % - - - 17,47
В таблице 2 представлены количество выделенной молочной кислоты из лактата кальция по стадиям обработки и выход молочной кислоты относительно общего расхода РВ на культивирование гриба Rhizopus oryzae. Полученные результаты подтверждают необходимость многократной обработки
культуральной жидкости гашеной известью для более полного выделения лактата кальция. Выход молочной кислоты на стадии выделения лактата кальция составил около 17,5 %. и практически сопоставим с выходом на стадии культивирования гриба Rhizopus oryzae. Некоторое различие в значениях выхода молочной кислоты на стадиях культивирования и выделения из культуральной жидкости могут быть обусловлены избытком серной кислоты при обработке лактата кальция. На это указывают отклонения значений pH на третий и четвертой стадиях обработки лактата кальция серной кислоты.
Выводы
Показана целесообразность синтеза молочной кислоты Rhizopus oryzae при культивировании отъ-емно-доливным методом на питательной среде, приготовленной из гидролизатов крахмала и белка овсяных отрубей.
Литература
1. Young-Jung Weel, Jin-Nam Kim and Hwa-Won Ryu, Food Technol. Biotechnol., 44, 2, 163-172 (2006)
2. Pushparani Mudaliyar and Chandrashekar Kulkami, International Journal of Life science & Pharma Research, 2, 1-3, L-122- L-127 (2012).
3. Fabio Andres Castillo Martinez, Eduardo Marcos Balci-unas, Jose Manuel Salgado, Jose Manuel Dominguez Gonzalez, Attilio Converti and Ricardo Pinheiro de Souza Oli-veira, Trends in Food Science & Technology, 30, 70-83, (2013).
4. Г.Г. Няникова, С.М. Комиссарчик, М.В. Хрусталёва, Известия Санкт-Петербургского Государственного Технологического Университета (Технического Университета) ,17, 43, 56-60, (2012).
5. И.В. Илушка, Доценко С.П. Научный журнал Куб-ГАУ, 82, 8, 48-57 (2012).
6. Auras R., Lim T., Selke M., Tsuji H.: Poly(lactic acid): Synthesis, structures, properties, processing, and applications. Wiley, New Jersey, 2010.528 с.
7. Andrea Komesu, Patricia F. Martins, Johnatt Oliveira, Betania H. Lunelli, Rubens Maciel Filho, Maria Regina Wolf Maciel, Chemical Engineering Transactions, 37, 367372, (2014).
8. Ayumi Abe, Yuji Oda, Kozo Asano, Teruo Sone, Mycolo-gia, 99, 5, 714-722 (2007).
9. Li Ping Huang, Bo Jina, Paul Lant, Jiti Zhou, Biochemical Engineering Journal, 23, 265-276, (2005).
10. Ю.А.Морозова, Е. В. Скворцов, Ф. К. Алимова, А. В. Канарский. Вестник Казанского Технологического Университета., 15, 19, 120-122 (2012).
© Л. А. Зимагулова - аспирант кафедры Пищевая инженерия малых предприятий КНИТУ, zleisan1 @таД.ги; В. М. Гематди-нова - аспирант той же кафедры КНИТУ, venera.nas14@yandex.ru; А. В. Канарский - проф., д.т.н., каф. пищевой биотехнологии, КНИТУ, alb46@mail.ru.
© L. A. Zimagulova - Ph.D. Student, Department of food engineering in small enterprises, Kazan National Research Technological University, zleisanl @mail.ru; V. M. Gematdinova - Ph.D. Student, Department of food engineering in small enterprises, Kazan National Research Technological University, venera.nas14@yandex.ru; A. V. Kanarskiy -Dr. Sci. (Tech.), Prof., Department of Food Biotechnology, KNRTU, alb46@mail.ru.
