CC BY
97
Химия растительного сырья. 2012. №1. С. 171-180.
УДК 579.222.7; 2: 57.083.134; 36
ПУТИ ИНТЕНСИФИКАЦИИ ПРОЦЕССА БИОСИНТЕЗА МАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ
© В.И. Сушкова , О.В. Березина, С.В. Яроцкий
Государственный научно-исследовательский институт генетики иселекции промышленных микроорганизмов, 1-йДорожный проезд, 1, Москва,117545 (Россия), e-mail: [email protected]
С целью интенсификации процесса селективного биосинтеза масляной кислоты штаммом Clostridium tyrobu-tyricum ВКПМ В-10406 использованы методы иммобилизации живых клеток продуцента (гель Са-альгината и целло-лигнин) и экстракции олеиловым спиртом. Получена максимальная концентрация масляной кислоты 14,5 г/л с максимальным выходом 49 мас,% от сброженных моносахаридов.
Проведена оценка эффективности процесса ацидогенеза штамма на различных субстратах: синтетической среде SOL, мелассе, смеси ферментативного гидролизата кукурузной кочерыжки с мелассой, Установлено, что штамм утилизирует следующие моносахариды: глюкозу, фруктозу, галактозу, ксилозу, арабинозу; а также инвертированную сахарозу, Разработана схема безотходного производства масляной кислоты, Показана возможность использования культуральной жидкости, содержащей преимущественно масляную кислоту, в двух направлениях: 1 - для получения масляной кислоты; 2 - как биостимулятор в производстве биобутанола,
Ключевые слава: ферментация, ферментационная жидкость, штамм, ацидогенез, ферментативный гидролизат, кукурузная кочерыжка, меласса, инверсия, масляная кислота, к-бутанол,
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках межгосударственной целевой программы ЕврАзЭС «Инновационные биотехнологии», ГК№ 16.М04.12.0017
Введение
Масляная кислота (МК) является ценным продуктом, ее широко используют в различных отраслях промышленности, в том числе в пищевой и фармацевтической. В этой связи разработка биосинтетического способа получения МК взамен традиционного органического синтеза весьма актуальна, поскольку может обеспечить переход на возобновляемое сырье, а также решить ряд экологических проблем. К настоящему времени отсутствует промышленный процесс микробиологического синтеза МК. Это связано в первую очередь с недостаточной селективностью биосинтеза, сопровождающегося образованием значительных количеств побочных продуктов, а также с его относительно низкими скоростями. Данная работа направлена на решение некоторых задач по интенсификации исследуемого процесса.
Для создания эффективного процесса биосинтеза МК необходимо выполнить следующие действия:
- подобрать штамм, обеспечивающий максимально селективный биосинтез МК;
- повысить устойчивость штамма к более высоким концентрациям МК;
- оптимизировать состав питательных сред;
- снизить эффект токсического действия МК на клетки продуцента.
Типичными представителями маслянокислых бактерий являются Clostridium butyricum и Clostridium tyrobutyricum. Основными конечными продуктами брожения бактерий Cl. butyricum кроме МК являются уксусная кислота, растворители (бутанол, ацетон, этанол), водород и углекислый газ, что снижает выход МК [1]. Cl. tyrobutyricum продуцирует в основном МК и в небольших количествах уксусную кислоту, водород, углекислый газ и этанол [2, 3]. Полная схема метаболических путей штамма Cl. tyrobutyricum JM1 представлена Jo, Ji Hye и др. [3]. Они утверждают, что Cl. tyrobutyricum не производит ацетон и бутанол, ссылаясь на Balows, A. и др. [4], и данные бактерии рассматриваются в качестве продуцентов бутирата.
* Автор, с которым следует вести переписку,
В процессе биосинтеза МК оказывает токсическое действие на клетки продуцента. Одним из путей снижения токсического эффекта служит иммобилизация клеток на носителе, в частности, используя включение клеток в структуру гранул, гелей, мембран и волокон за счет физических взаимодействий с матрицей. При этом клетки должны сохранять жизнеспособность и в присутствии питательной среды размножаться в приповерхностных слоях носителей. Метод использован рядом авторов для процесса биосинтеза МК культурой Cl. tyrobutyricum [2-10] и для других схожих процессов [9, 11].
Для непрерывного производства водорода был разработан процесс с использованием иммобилизованных клеток Enterobacter cloacae ИИТ-BT 08 на экологически чистых лигноцеллюлозных твердых матрицах. Среди трех лигноцеллюлозных носителей лучшим оказался SM-C из кокоса (удержание ячейки 0,44 г сухого элемента/г сухого носителя, плотность упаковки 100 г/л объема реактора, загрузка 4 г сухих клеток / литр объема реактора) [11].
Jo, Ji Hye и др. [3, 7] приводят баланс продуктов биосинтеза штамма Cl. tyrobutyricum JM1, используя иммобилизованные клетки бактерий на полиуретановой пене. Выход продуктов составил: ацетат -3,25-9,23%, бутират - 33,15-46,25%, лактат 0,38-8,68%, этанол - 0,00-1,55%, биомасса - 13,83-37,17% и CO2 - 12,68-29,58%.
С целью повышения концентрации и выхода МК использовали иммобилизованные клетки культуры Cl. tyrobutyricum АТСС 25755. Иммобилизацию осуществляли на волокнистых материалах, хлопковой и полиэфирной ткани [2, 5, 6]. При переработке растительного сырья (сернокислотного и солянокислого гидролизатов соломы и зернового затора) выход бутирата составил 0,47 г/г и ацетата 0,04 г/г глюкозы за 125 ч, к этому времени достигалась максимальная концентрация МК - 40 г/л [5]. При сбраживании тростниковой мелассы были получены следующие результаты: концентрация бутирата 27 г/л с выходом 0,47 г/г глюкозы и продуктивностью 4,13 г/л/ч при pH 6.0. На отдельных партиях тростниковой мелассы, обработанной серной кислотой, концентрация бутирата достигала 34,6 г/л с выходом 0,58 г/г ( при теоретическом выходе 49%) при степени утилизации сахара 90,8%. Продолжительность работы биокатализатора не указана [6].
Клетки микроорганизмов также иммобилизуют, используя поливиниловый спирт и борную кислоту [8]. При получении органических кислот, в частности яблочной, был использован метод включения в кар-рагинан [9]. Но наиболее эффективными считаются биокатализаторы, полученные методами включения в упругие гели типа ПААГ или Са-альгината. При их использовании для получения глюконовой кислоты в процессе ферментации осуществляли конверсию глюкозы с концентрацией 200 г/л, с продуктивностью до 10 г/л/ч. Продолжительность эксплуатации такого биокатализатора составляла до 200 суток [9].
Установлено, что штамм Cl. tyrobutyricum АТСС 25755 сбраживает пентозные моносахариды ксилозу и арабинозу [2, 5, 11]. Это особенно важно при сбраживании субстратов из растительного сырья любого вида.
Для ослабления эффекта ингибирования продуктами метаболизма в процессах ферментации, в частности МК, их удаляют из культуральной жидкости в ходе биосинтеза либо изолируют от биомассы продуцента. Для отделения масляной кислоты часто используют процесс жидкостной экстракции [8, 12, 13].
Цель данной работы - оценить эффективность продуцирования МК штаммом Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406 (коллекция культур ВКПМ ФГУП ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов) на субстратах SOL и ферментативном гидролизате кукурузной кочерыжки без и в смеси с мелассой как дешевых источников углеводов, определить возможности интенсификации процесса с применением методов иммобилизации и жидкостной экстракции и показать эффективность культуральной жидкости этого штамма в производстве биобутанола.
Экспериментальная часть
Объект исследований. Для проведения работы была выбрана культура Cl. tyrobutyricum, так как в сравнении с другими культурами, например Cl.butyricum [1, 4], она дает побочные продукты в меньшем количестве. В коллекции культур ВКПМ ФГУП ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорга-низмов имеется два штамма Cl.tyrobutyricum ВКПМ В-10406 и В-9516. Большую селективность по биосинтезу МК показал штамм В-1046. По результатам двух отборов по максимальному продуцированию МК на твёрдой и в жидкой среде был отобран вариант, который обозначили В-10406-2.
Питательные субстраты. Для культивирования Cl.tyrobutyricum использовали среды SOL [1], MSS [1], ферментативный гидролизат кукурузной кочерыжки [1] и свекловичную мелассу.
Содержание глюкозы изменяли в интервале 1,5-4%.
В среду SOL вводили мелассу исходную и инвертированную в количестве 1,35% по РВИ. Увеличение концентрации сахаров в субстрате SOL2 (концентрация сахаров 20 г/л) до 30-40 г/л осуществляли введением в него стерильного 40% раствора глюкозы.
Было получено три образца ферментативных гидролизатов кукурузной кочерыжки, отличающихся исходным гранулометрическим составом и гидромодулем (ГМ) [1]. Первый образец из порошка с диаметром частиц менее 1 мм, ГМ 8, второй образец с диаметром гранул 1-5 мм и ГМ 7 и третий - d = 1-3 мм, ГМ 7. Ферментативный гидролизат 2 был разбавлен дистиллированной водой до концентрации РВИ = 9 г/л. Третий гидролизат был использован для исследования моносахаридного состава культуральной жидкости в процессе маслянокислого брожения. Углеводный состав образцов представлен в таблице 1.
Питательные субстраты на основе кукурузной кочерыжки состояли из ферментативных гидролизатов с добавками компонентов среды MSS (1) или SOL (2), и 1,35% РВИ (1% сахарозы) мелассы. Ферментативный гидролизат 3 из кукурузной кочерыжки содержал минеральные вещества в соответствии с составом среды Vandak и др. [1, 13].
В качестве источника углеродного питания и витаминов использовали свекловичную мелассу, содержащую 54,3% РВИ (редуцирующие вещества после инверсии), в том числе 40% сахарозы, биотин.
Субстраты стерилизовали при 120 °С в смеси с мелассой при 135 °C.
Методы анализа. Содержание свободных масляной и уксусной кислот, а также растворителей (бу-танола, ацетон, этанол) в культуральной жидкости (КЖ) и органической фазе определяли методом ГХ с пламенно-ионизационным детектированием. Использовали капиллярную колонку Heliflex® AT-AquaWAX-DA (Grace) длиной 15-30 м, диаметр 0,5-0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм. В качестве внутренних стандартов применяли 0,2% об. растворы н-пентанола и пропионовой кислоты. Система сбора и обработки данных «Мультихром» на основе персонального компьютера. Погрешность определения в диапазоне концентраций 500-10000 мг/л составляет менее 10% относительных.
Содержание моносахаридов определяли ВЭЖХ на хроматографе системы «alliance» фирмы WATERS с рефрактометрическим детектором Waters 2414. Колонка Reprosil-Pur NH2, размером 250*4,0 мм, 5 |im. Состав подвижной фазы: ацетонитрил - 76, вода - 20, этилацетат - 4. Прием и обработку данных производили с использованием компьютерной системы «Empower Pro». Погрешность определения в диапазоне концентраций 200-10000 мг/л составляет 10% относительных.
Концентрацию редуцирующих веществ (PB), пересчитанных на глюкозу, в КЖ и субстратах определяли фотоколориметрическим методом с реактивом DNSA на фотоколориметре марки КФК - 2М.
Для определения концентрации редуцирующих веществ после инверсии (РВИ), пересчитанных на глюкозу, в КЖ (субстрате) использовали известный принцип анализа [1, 14].
Содержание углеводов в кукурузной кочерыжке и мелассе определяли эбулиостатическим методом [15].
Количество параллельных ферментаций составляет от 2 до 5 раз. Среднее квадратичное отклонение результата измерения концентрации МК составляет 0,25. При доверительной вероятности 0,95 коэффициент Стьюдента равен 3,182. Доверительные границы случайной погрешности полученного результата составляют 0,79 г/л. Среднее квадратичное отклонение концентрации бутанола - 0,212. Коэффициент Стьюдента равен 2,571. Доверительные границы случайной погрешности полученного результата составляют 0,55 г/л [16].
Методы исследований. Ферментацию проводили в анаэробных условиях в стерильных пробирках общим объемом 50 см3. Стерильные питательные субстраты заливали в пробирки в количестве 35 см3.
Основными технологическими показателями для процесса ацидогенеза клостридий являются температура, pH, количество посевного материала и концентрация сахаров в субстрате.
Сравнение процессов при 35 и 37 °С показали, что предпочтительная температура для штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406 составляет 37 °С.
Таблица 1. Углеводный состав ферментативных гидролизатов кукурузной кочерыжки
№ Компонентный состав гидролизатов, г/л
образца PB РВИ глюкоза манноза галактоза фруктоза ксилоза арабиноза
1 20 22,2 8,5 0,6 0,0 0,7 2,4 0,5
2 30,58 35,84 21,8 0,0 0,0 4,4 4,1 0,8
3 19,0 22,5 11,9 0,7 0,4 1,8 2,8 0,7
Процесс ацидогенеза у клостридий идёт в интервале pH от 5,2 до 6,5 [1, 2, 5, 8]. pH поддерживали в интервале 4,5-6,0 2N водным раствором NaOH. Корректировку pH проводили один раз в сутки. В отдельных опытах для стабилизации pH в субстрат добавляли мел в количестве 2 и 5 г/л.
Количество посевного материала составляло 7%об. Для его подготовки использовали среду SOL с концентрацией глюкозы 20 г/л. Время брожения составляло 7 суток.
В опытах с иммобилизацией культуры количество посевного материала было существенно выше. В опыте 1 количество абсолютно сухой иммобилизуемой биомассы составляло 0,6 г (180 см3 субстрата для выращивания биомассы) на 1,8 см3 альгината натрия (0,33 г/см3 альгината натрия; 17 г/л рабочего объёма биореактора), в опыте 2 - 1,33 г (субстрат для выращивания биомассы был взят в количестве 400 см3) на 3 см3 альгината натрия (0,44 г/см3 альгината натрия; 38 г/лрабочего объема биореактора).
После введения посевного материала pH субстрата снижался до 4,0-4,5. Корректировку pH до 5,86,0 вели 2N водным раствором NaOH.
Термообработку культуры проводили в субстрате в водяной бане с 75 °Св течение 5 мин.
Расчёты выхода МК сделаны от сбраживаемых РВ в мае. %.
Клетки иммобилизовали двумя методами: 1 - в Са-альгинатный гель [9]; 2 - на гранулах отходов кукурузной кочерыжки после ферментативного гидролиза. Соотношение гранул Са-альгината с субстратом 1 : 6. Соотношение объемов гранул кукурузной кочерыжки с d = 3 мм после ферментативного гидролиза с субстратом 1 : 1. Подачу субстрата осуществляли после полного удаления отработанной культуральной жидкости.
Экстрактивную ферментацию проводили в следующих условиях: общий объём биореактора 120 см3, исходный объем ферментационной суспензии 60 см3, исходный объём олеилового спирта 20 см3. В качестве субстрата использовали ферментативный гидролизат кукурузной кочерыжки в смеси с инвертированной мелассой (РВ = 34,4 г/л и РВИ = 66 г/л, в том числе РВИ мелассы 13,5 г/л) и с добавками мела 5 г/л. Ферментацию вели отъемно-доливным способом. Доливки делали с поддержанием концентрации сахаров 20 г/л. Экстракцию осуществляли в режиме накопления, экстрагент отбирали только для анализа и его не добавляли. Олеиловый спирт был введён через 4 суток от начала ферментации.
Обсуждениерезультатов
Эффективность биосинтеза масляной кислоты штамма Cl. tyrobutyricum ВКПМ В-10406 при оптимальных условиях ферментации (t, pH, количество посевного материала, активность культуры) в основном зависит от состава питательного субстрата.
Для поддержания культуры в активном состоянии использовали синтетический субстрат SOL, содержащий биотин. С целью поддержания культуры в активном состоянии и недопускания автолиза ее клеток при пересевах исследовали оптимальную концентрацию глюкозы в ней. Результаты исследований эффективности сбраживания субстрата SOL, представлены в таблице 2.
Таблица 2. Эффективность процесса биосинтеза МК на субстрате SOL с мелом в количестве 5 г/л
Концентрация РВ или РВИ, г/л Выход масляной кислоты, % Время, ч Состав культуральной жидкости, г/л
исходная остатоточная кислоты бутанол ацетон этанол
масляная уксусная
15 3,9 49 72 5,39 0,12 0,02 0,01 0,97
4,7 - 96 6,20 0,23 0,02 0,01 0,78
5,8 - 336 6,64 0,40 0,02 0,01 0,98
20 5,6 49 72 7,1 1,0 0,0 0,0 0,20
3,9 49 96 7,9 1,2 0 0 0,30
6,7 - 240 7,9 1,1 0 0 0,10
7,8 - 336 10,5 0,09 0,00 0,02 0,97
27 11,0 - 48 4,0 0,5 0,0 0,0 0,50
8,3 - 120 7,6 0,2 0,0 0,0 0,59
4,7 38 168 8,4 0,58 0,0 0,1 0,49
5,1 - 336 12,1 0,40 0,1 0,0 0,79
По данным таблицы 1 видно, что в процессе ферментации штамма Cl. tyrobutyricum ВКПМ В-10406 на субстрате SOL образуется в основном МК, остальные примеси присутствуют в незначительных количествах. Максимальный выход МК 49% от сброженных сахаров имеет место при концентрации РВ = 1520 г/л. Время брожения в данном случае составляет 96 ч, продуктивность - 0,06-0,08 г/л/ч. Но при концентрации глюкозы 20 г/л при длительном хранении наблюдается повышение концентрации МК до 10 г/л, при которой идёт автолиз клеток культуры. Поэтому для пересева культуры и поддержания ее в активном состоянии использовали субстрат SOL с концентрацией глюкозы 1,5%.
Проверяли эффективность сбраживания смешанного субстрата SOL без биотина с мелассой (табл. 3 и рис. 1, 2). Свекловичную мелассу использовали как источник не только углеводов, но и биотина.
При брожении субстрата с мелассой концентрация МК в культуральной жидкости составила 7-9 г/л в зависимости от концентрации сахаров в субстрате. Максимально достигнутая концентрация МК - 10 г/л. Наличие мелассы в субстрате незначительно влияет на образование уксусной кислоты и других примесей.
В присутствии мелассы в субстрате наблюдается повышение концентрации остаточных сахаров в культуральной жидкости. Анализ углеводов в субстрате и культуральной жидкости показал, что в остаточных сахарах в качестве основного компонента присутствует сахароза.
Надо отметить, что в достоверности расчета выхода МК при ферментации Cl. tyrobutyricum ВКПМ В-10406 есть сомнения, так как в этом случае трудно определить истинную остаточную концентрацию РВИ. В конце процесса идёт автолиз клеток и клеточных стенок, в результате образуется дополнительное количество РВИ.
Для стабилизации pH в процессе ацидогенеза в статических условиях в культуральную жидкость на вторые сутки брожения был добавлен стерильный мел. За счет мела pH поддерживали в более узком интервале 4,8-6,3. Кинетические кривые процесса брожения субстрата SOL с концентрацией РВ=20 г/л и РВИ=33,5 г/л (в том числе РВИ мелассы 13,5 г/л) с содержанием мела в количестве 2 г/л представлены на рисунках 1 и 2.
По данным таблицы 3 и рисунков 1 и 2 видно, что концентрация МК при ферментации штамма Cl. tyrobutyricum ВКПМ В-10406 была 7,8 г/л, выход МК - 39%, время брожения 96-144 ч. Продуктивность процесса по МК - 0,05-0,08 г/л/ч.
С целью более глубокого сбраживания сахарозы ее инвертировали (табл. 3.). Выход МК при концентрации в субстрате РВ=22 г/л составил до 49% от сброженных РВ в пересчёте на глюкозу, продуктивность
0,07 г/л/ч.
Таким образом, процесс ацидогенеза с использованием штамма Cl. tyrobutyricum ВКПМ В-10406 позволяет получить выход МК до 49% от сброженных сахаров на субстрате SOL с концентрацией сахаров 20 г/л без мелассы и с инвертированной мелассой в количестве 1,35%.
Была исследована эффективность процесса ацидогенеза штамма бактерий на образцах ферментативных гидролизатов кукурузной кочерыжки 1 и 2 с добавкой 1,35% мелассы и компонентов среды MSS и SOL с термообработкой. Общая сумма РВИ в них составила 35,5 и 22,5% от общего количества субстрата. pH в процессе брожения поддерживали в интервале 5,2-6,5. Результаты исследований представлены в таблице 4.
Таблица 3. Эффективность процесса биосинтеза МК на субстрате SOL и мелассе с мелом в количестве 5 г/л
Обработка мелассы Концентрация РВ или РВИ, г/л Выход МК, % Время, ч Состав культуральной жидкости, г/л
исходная остаточная МК УК бутанол ацетон этанол
С исходной 33,5 13,2 37 72 7,5 0,2 0,02 0 0,13
мелассой 13,4 39 144 7,8 1,35 0 0 0,1
53,5 27 34 144 9,0 2,4 0,08 0,0 0,3
С инверти- 22 - - 72 1,23 1,55 0,0 0,0 0,53
рованной 3,5 - 120 2,79 0,56 0,0 0,0 0,44
мелассой 1,6 49 168 10,0 0,09 0,0 0,0 0,14
33,5 18,2 - 96 0,97 1,39 0,0 0,0 0,04
10,3 - 144 6,23 0,09 0,0 0,0 0,07
9,8 35 168 8,3 0,06 0,0 0,0 0,14
Рис. 1. Кинетические кривые образования продуктов метаболизма при маслянокислом брожении субстрата 80Ь2 и мелассы (РВ = 20 г/л; РВИ = 33,5 г/л, в том числе РВИ мелассы 13,5 г/л). По оси ординат - концентрации кислот и этанола, по оси абцисс - время
Рис. 2. Кинетические кривые изменения концентраций углеводов, биомассы и pH при брожении субстрата SOL с мелассой. По левой оси ординат концентрации РВ и РВИ; по правой оси -оптическая плотность и pH; по оси абцисс - время
Таблица 4. Эффективность биосинтеза МК на ферментативном гидролизате кукурузной кочерыжки в смеси с мелассой
Концентрация мела, г/л Концентрация РВИ, г/л Выход масляной кислоты, % Время, ч Состав культуральной жидкости, г/л
исходная остаточная МК УК бутанол ацетон этанол
5 22,5 10,4 43 16S 5,2 0,1 0,01 0,01 0,2
5 35,5 S,5 29,5 192 6,S 0,2 0,05 0,01 0,1
0 35,5 S,5 20,4 192 5,5 0,1 0,01 0,01 0,1
МК - масляная кислота, УК - уксусная кислота
Из данных, представленных в таблице 4, следует, что при ферментации штамма Cl. tyrobutyricum ВКПМ В-10406 на смешанном субстрате из ферментативного гидролизата кукурузной кочерыжки и мелассы при концентрации РВИ = 22,5 г/л в субстрате выход МК составил 43%. Однако при этом наблюдается повышение содержания остаточных углеводов.
Исследования состава остаточных сахаров в культуральной жидкости (рис. 3, 4) показали, что штамм Cl. tyrobutyricum ВКПМ В-10406 сбраживает галактозу за 4S ч, фруктозу - за 96 ч, через 96 чв культуральной жидкости отсутствуют глюкоза и ксилоза. При использовании субстрата без мела через 192
4 брожения состав остаточных сахаров в культуральной жидкости был следующим (г/л): арабиноза -
0,41 г/л; манноза - 0,316 г/л; сахароза - 12,3 г/л. При ферментации культуры на субстрате в присутствии
5 г/л мела в культуральной жидкости через 192 ч выявлены арабиноза (0,14 г/л), манноза (0,2S г/л) и сахароза (12,0 г/л). Из этого следует, что сахароза плохо утилизируется продуцентом. Для снижения концентрации остаточных сахаров и сокращения времени брожения необходимо проведение инверсии сахарозы мелассы.
Таким образом, можно сделать вывод, что в процессе ферментации штамма Cl. tyrobutyricum ВКПМ В-10406 на представленных выше субстратах получаются низкие концентрация МК и продуктивность процесса по МК. Это объясняется в основном токсическим действием МК на рост и развитие данного штамма, что не позволяет использовать концентрированные субстраты с достижением высоких показателей процесса.
Для повышения концентрации МК в культуральной жидкости и снижения ее токсического действия на штамм были проведены исследования эффективности процесса с иммобилизацией клеток продуцента в Са-альгинатном геле (табл. 5, опыты 1, 2) и гранулах целлолигнина после ферментативного гидролиза измельчённой кукурузной кочерыжки (табл. 5, опыт 3). В качестве субстрата использовали синтетическую среду SOL с инвертированой мелассой в количестве 1,35% РВИ, с общим количеством РВ = 30 и 40 г/л.
Рис. 3. Кинетические кривые образования продуктов метаболизма при маслянокислом брожении ферментативного гидролизата кукурузной кочерыжки с мелассой. По оси ординат - концентрации кислот и этанола; по оси абцисс - время
Рис. 4. Кинетические кривые изменения концентраций углеводов при маслянокислом брожении ферментативного гидролизата кукурузной кочерыжки с мелассой. По оси ординат - концентрации; по оси абцисс - время
Таблица 5. Эффективность процесса маслянокислого брожения субстрата SOL с инвертированной
мелассой, иммобилизованной культурой
№ Концентрация РВ, г/л Выход Время, сутки Состав культуральной жидкости, г/л
опыта исходная остаточная МК, % от начала между сменой среды МК УК бутанол ацетон этанол
1 15 4 48 5,3 0,6 0 0 0,09
30 17,8 56,6 7 5 6,9 0,2 0 0 0,10
30 11 50,5 16 9 9,6 1,6 0 0 0,26
30 10,6 54 23 7 10,5 0,7 0 0 0,28
2 30 9 44 11 11 9,3 0,27 0,03 0 0,16
30 2,6 53,6 25 14 14,7 0,11 0,03 0 0,16
40 12 25,7 39 14 7,2 0,24 0,01 0 0,09
3 21,3 6,8 32,4 8 8 4,7 0,09 0,0 0,03 0,01
30 6,2 23 34 8 5,5 0,21 0,03 0,0 0,42
30 - - 52 18 6,0 0,23 0,04 0,0 0,64
3,7 26,6 54 20 7,0 0,11 0,06 0,0 0,62
40 12 - 68 4 3,3 0,98 0,05 0,02 0,61
1,2 19 72 12 7,4 0,23 0,05 0,00 0,51
40 10 - 77 5 5,36 0,41 0,04 0,00 0,51
3,6 25 84 7 9,17 0,08 0,07 0,00 0,53
Способ иммобилизации с использованием альгината натрия был выбран как модель, доказывающая степень эффективности иммобилизации. Опыты 1 и 2 отличаются количеством иммобилизуемой биомассы продуцента, в опыте 2 - количество ее было выше, чем в опыте 1, более чем в два раза.
По данным таблицы 5 видно, что более высокая концентрация иммобилизованных клеток дает возможность получить более высокую концентрацию МК. Иммобилизация культуры в Са-альгинатном геле позволила повысить концентрацию сахаров в субстрате до 30 г/л и концентрацию МК до 14,7 г/л без снижения ее выхода (в сравнении с данными таблице 3 - выход 35% при РВ в субстрате 33,5 г/л). Но при этом не наблюдалось сокращения времени ферментации. Это можно объяснить крупными размерами гранул d = 1-2 мм и влиянием диффузионных процессов. При повышении концентрации сахаров до 40 г/л в исходном субстрате эффективность процесса снизилась, и далее получить более высокие результаты не удалось.
Метод иммобилизации в Са-альгинатном геле был использован нами для оценки процесса иммобилизации, однако в производстве следует применять более дешевый, механически прочный и легко утилизируемый материал, например, на основе отходов от переработки растительного сырья - целлолигнин.
При использовании клеток, иммобилизованных на гранулах (d = 3 мм) кукурузной кочерыжки после ее ферментативного гидролиза (целлолигнине), наблюдалось снижение pH до значений менее 4, так как не задавался мел. При сбраживании субстрата с концентрацией РВ = 30 г/л, содержащего инвертированную мелассу, концентрация МК достигала 5,5-7 г/л, продуктивность 0,03-0,02 г/л/ч при времени работы биокатализатора 34-64 суток. При использовании субстрата SOL с концентрацией РВ = 40 г/л с инвертированной мелассой концентрация МК повысилась и составила 9,17 г/л при общем времени работы биокатализатора 84 суток.
Таким образом, видно, что при использовании целлолигнина в качестве носителя для иммобилизации клеток штамма Cl. tyrobutyricum ВКПМ В-10406 процесс маслянокислого брожения в проводимых условиях был неэффективным, выход МК составил 19-32% от сброженных сахаров.
Одним из способов интенсификации процесса маслянокислого брожения является экстрактивная ферментация. Нами была проведена ферментация штамма Cl. tyrobutyricum ВКПМ В-10406 на смешанном субстрате из ферментативного гидролизата кукурузной кочерыжки и инвертированной мелассы в присутствии экстрагента - олеилового спирта (табл. 6).
Из данных таблицы 6 видно, что извлечение МК методом экстракции из культуральной среды в процессе ферментации позволило повысить ее концентрацию в экстрагенте до 16,1 г/л с выходом 49,4% от сброженного сахара после второй доливки. При однократной экстракции концентрация МК в культуральной среде находится на пределе (8,6-9,6 г/л), при которой идёт автолиз клеток и остаточная концентрация сахаров увеличивается.
Таблица 6. Результаты экстрактивной ферментации Cl. tyrobutyricum ВКПМ В-10406 с олеиловым спиртом
Фаза Концентрация РВ, г/л Выход Время, ч Компоненты ( зазы, г/л
исходная остаточная МК, % от начала от доливки МК УК бутанол ацетон этанол
Водная 20 3,7 - 4,8 3,3 1,23 0,15 0,19
4,6 45,5 96 - 7,0 1,05 0,01 0,02 0,15
Водная 18,8 - - 96 0 - - - - -
Водная - 7,4 - 168 72 8,5 0,81 0,01 0,01 0,21
Водная - 9,0 35,2 192 96 9,6 0,57 0,01 0,02 0,23
Органическая - - 10,1 96 - 9,5 0,01 0,02 0,01 0,08
Е45,3
Водная 9,1 32,9 288 192 8,6 0,23 0,02 0,01 0,23
Органическая - 14,7 192 - 14,2 0,01 0,03 0,01 0,08
Е47,6
Водная 22 - 288 0 - - - - -
Водная 21,4 35,8 336 48 8,99 0,52 0,01 0,01 0,21
Органическая - 13,6 240 - 16,14 0,10 0,1 0,17 0,10
Е49,4
Водная 18,8 34,8 480 144 9,5 0,39 0,01 0,01 0,23
Органическая 12,3 384 - 15,4 0,01 0,1 0,19 0,1
S47.1
Таким образом, использование процесса ферментации, совмещенного с процессом экстракции МК олеиловым спиртом, позволяет повысить концентрацию МК в экстрагенте.
Известно, что добавки масляной кислоты в культуральную жидкость на стадии сольвентогенеза при ацетоно-бутиловом брожении способствуют повышению выхода н-бутанола [2]. Проверяя данный способ, мы не получили положительного результата по выходу н-бутанола, он обнаружили, что осветленная культуральная суспензия после ферментации культуры О. tyrobutyricum в течение 4-7 суток оказывает стимулирующее действие на процесс ацетоно-бутилового брожения. Поэтому нами были проведены исследования по использованию культуральной жидкости, получаемой при биосинтезе МК, в качестве биостимулятора процесса ацетоно-бутилового брожения. Для ферментации применяли субстрат, состоящий из ржаной муки в количестве 6% и мелассы в количестве 0,5% по сахарозе (43,75 г/л условного крахмала).
Результаты исследований представлены в таблице 7, по которым видно, что добавки культуральной жидкости в субстрат в количестве 8-30 мас.% в стандартном процессе ацетоно-бутиловой ферментации способствуют повышению выхода бутанола и общего количества растворителей до 22-25 и 35-40% соответственно.
Таблица 7. Данные по ацетоно-бутиловой ферментации культуры а acetobutylicum СВ-2 (ВКПМ В-10290)
Время брожения, ч Количество культуральной жидкости в субстрате,мас.% Состав продуктов брожения, г/л Выход от крахмала, %
бутанол ацетон этанол МК УК бутанола растворителей
96 - 9,4 5,1 1,0 1,0 1,5 21,5 35,4
72 4 8,98 5,05 1,1 0,9 1,1 20,5 34,6
24 8 3,51 1,88 0,13 1,9 1,6 - -
48 9,52 4,75 1,04 0,7 1,4 21,8 35,0
24 20 3,79 2,06 0,24 2,9 2,1 - -
48 5,42 3,25 0,32 2,2 1,7 - -
96 11,0 5,77 0,69 1,7 2,4 25,2 40,0
24 30 1,91 1,18 0,17 1,9 1,8 - -
48 8,69 5,30 0,59 1,1 1,4
96 10,2 5,10 0,83 0,9 1,7 23,3 36,9
МК - масляная кислота, УК - уксусная кислота
Таким образом, используя штамм О. tyrobutyricum ВКПМ В-10406, можно предложить безотходную схему получения МК с двумя продуктами: масляной кислотой, выделяемой из экстрагента; отработанной культуральной жидкостью, содержащей преимущественно МК, для использования в производстве биобу-танола.
Безотходная схема получения МК состоит из следующих стадий:
- подготовка смешанного субстрата из ферментативного гидролизата целлюлозо- или пентозансо-держащего растительного сырья и мелассы в количестве не более 1,35% РВИ от исходного субстрата;
- подготовка посевного материала и получение биокатализатора;
- проведение экстрактивной ферментации с биокатализатором;
- отделение отработанной культуральной жидкости и использование ее в производстве биобутанола на стадии подготовки крахмалсодержащего субстрата;
- отделение органической фазы, выделение из нее МК и регенерация экстрагента.
Выводы
Таким образом, по представленным результатам можно сделать следующие выводы:
1. Штамм С1. tyrobutyricum ВКПМ В-10406 позволяет получить на субстрате 80Ь2 без мелассы и с инвертированной мелассой в количестве 1,35% по РВИ выход МК 49%.
2. При ферментации штамма на субстрате с концентрацией глюкозы 20 г/л накапливается максимально возможное количество МК 8-10 г/л, которое ингибирует процесс.
3. При ферментации штамма на ферментативном гидролизате кукурузной кочерыжки в смеси с мелассой в количестве 1,35% РВИ (1% сахарозы) выход масляной кислоты составляет 43% при концентрации РВ в субстрате 20 г/л.
4. Установлено, что штамм утилизирует следующие моносахариды: глюкозу, фруктозу, галактозу, маннозу, ксилозу, арабинозу, а также инвертированную сахарозу мелассы.
5. При иммобилизации клеток продуцента в Са-альгинатном геле можно повысить концентрацию углеводов в исходном субстрате до 30 г/л и концентрацию МК в отработанной культуральной жидкости до 14,7 г/л при выходе продукта близком к теоретическому.
6. При использовании целлолигнина кукурузной кочерыжки в качестве носителя для иммобилизации удельная скорость биосинтеза снижается по сравнению с иммобилизацией в альгинатном геле.
7. Для рационального процесса получения МК (оптимальные технологические параметры процесса ацидогенеза: t = 37 °С; pH 5,2-6,5; d = 0,005-0,04 1/ч; количество посевного материала - 7% отн.) можно рекомендовать смешанный субстрат, состоящий из отходов производств от переработки пентозан- и целлюлозосодержащего растительного сырья в смеси с инвертированной мелассой в количестве 1,35% РВИ (1% сахарозы) от количества исходного субстрата.
8. Разработана безотходная схема получения МК, включающая экстрактивную ферментацию с олеи-ловым спиртом и иммобилизованной культурой бактерий Cl. tyrobutyricum ВКПМ В-10406, с использованием культуральной жидкости, содержащей преимущественно МК, в производстве н-бутанола.
Список литературы
1. Сушкова В.И., Жуковский С.В., Березина О.В., Яроцкий С.В. Биосинтез масляной кислоты штаммом Clostridium butyricum ВКПМ В-9619 из кукурузной кочерыжки и мелассы // Химия растительного сырья. 2011. №1. С. 157-162.
2. Ramey D. Production of bytyric acid and butanol from biomass. Final report. Work performed under: contract № DE-F-G-02-00ER 86106 for Departament of Energy. Morgantown, WV, 2004.
3. Ji Hye Jo, Dae Sung Lee, Junhoon Kim, Jong Moon Park. Effect of Initial Glucose Concentrations on Carbon and Energy Balances in Hydrogen-Producing Clostridium tyrobutyricum JM1 // J. Microbiol. Biotechnol. 2009. V. 1, N3. Pp. 291-298.
4. Balows A., Truper H.G., Dworkin M., Harder W., Schleifer K.-H. (eds.). The Prokaryotes: A Handbook on the Biology of Bacteria: Ecophysiology, Isolation, Identification, Applications, 2nd Ed. NY Springer-Verlag. New York. 1992.
5. Ying Zhu, Zetang Wu, Shang-Tian Yang. Butyric acid production from acid hydrolysate of corn fibre by Clostridium tyrobutyricum in a fibrous-bed bioreactor // Process Biochemistry. 2002. N38. Pp. 657-666.
6. Jiang L., Wang J., Liang S., Wang X., Ctn P., Xu Z. Butyric acid fermentation in a fibrous bed bioreactor with immobilized Clostridium tyrobutyricum from cane molasses // Bioresour Technol. 2009. Jul. T.100. №13.
7. Ji Hye Jo, Dae Sung Lee, Donghee Park, Jong Moon Park. Biological hydrogen production by immobilized cells of Clostridium tyrobutyricum JM1 isolated from a food waste treatment process // Bioresource Technology. 2008. V. 99. Pp. 6666-6672.
8. Zigova J., E. Sturdik Advances in biotechnological production of butyric acid // Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 2000. N24. Pp. 153-160.
9. Синицин А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И. и др. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М., 1994. 288 с.
10. Kumar N., Das D. Continuous hydrogen production by immobilized Enterobacter cloacae nT-BT 08 using lignocel-lulosic materials as solid matrices // Enzyme Microb. Technol. 2001. V. 29. Pp. 280-287.
11. Zhu Y., Yang S.-T. Effect of pH on metabolic pathway shift in fermentation of xylose by Clostridium tyrobutyricum // J. Biotechnol. 2004. V. 110. Pp. 143-157.
12. Wu Z, Yang ST. Extractive fermentation for butyric acid production from glucose by Clostridium tyrobutyricum // Biotechnol Bioeng. 2003. V. 82, N1. Pp. 93-102.
13. Vandak D., Zigova J., Stardik E. and Schlosser S. Evalusion of solvent and pH for extractive fermentation of butyric acid // Proc. Biochem. 1997. V. 32. Pp. 245-251.
14. Сушкова В.И., Воробьёва Г.И. Безотходная конверсия растительного сырья в биологически активные вещества. М., 2008. 215 с.
15. Емельянова И.Э. Химико-технологический контроль гидролизных производств. М., 1971. С. 160.
16. ГОСТ 8.207-76. Прямые измерения с многократными наблюдениями. Методы обработки результатов наблюдений. Основные положения.
Поступило в редакцию 6 марта 2011 г.
После переработки 19 января 2012 г.
