CC BY
153
УДК 579.222.7; 2: 57.083.134; 36
БИОСИНТЕЗ МАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ ШТАММОМ CLOSTRIDIUM BUTYRICUM ВКПМ В-9619 ИЗ КУКУРУЗНОЙ КОЧЕРЫЖКИ И МЕЛАССЫ
© В.И. Сушкова , С.В. Жуковский, О.В. Березина, С.В. Яроцкий
ФГУП ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва, 1-йДорожный проезд, 1, 117545 (Россия) e-mail: elenas@paraleles.sw.ru
Приводятся результаты исследований процесса ацидогенеза штамма Clostridium butyricum ВКПМ В-9619 на синтетической среде SOL, ферментативном гидролизате кукурузной кочерыжки и мелассе как дешевых источников углеводного питания микроорганизмов. Выход масляной кислоты составляет не менее 43%. Установлено, что штамм сбраживает, помимо гексоз, и пентозы (ксилозу и арабинозу), что позволяет перерабатывать отходы пентозан- и целлюлозосодержащего растительного сырья с добавкой мелассы. Ферментационная жидкость штамма может быть использована для получения масляной кислоты путем выделения способом ионного обмена.
Ключевые слова: ферментационная жидкость, масляная кислота, ферментативный гидролизат, кукурузная кочерыжка, меласса, инверсия, ионный обмен.
Введение
Масляная кислота (МК) имеет широкое применение. Ее используют в производстве ароматизирующих веществ для пищевой промышленности, пластификаторов для лаков и др. В медицинской научной литературе имеются сообщения о роли масляной кислоты в гибели опухолевых клеток.
В промышленности МК получают каталитическим окислением масляного альдегида или бутанола. При этом продукт имеет высокую себестоимость и цену. Необходима разработка альтернативного простого способа производства МК с низкой себестоимостью.
Известен способ биосинтеза МК путем маслянокислого брожения. Экономически целесообразно получать МК методом сбраживания углеводов отходов производств от переработки растительного сырья (сельскохозяйственные отходы, меласса и т.д.) бактериями рода Clostridium.
Химическое уравнение маслянокислого брожения без учета расхода глюкозы на прирост биомассы и образование ацетата выглядит следующим образом:
СбН^Об = СНз(СН2)2-СООН + 2Н2 +2СО2. (1)
Максимальный теоретический выход масляной кислоты из глюкозы по данному уравнению составляет 48,9% [1].
Ramey [2] указывает, что в лабораторных условиях в процессе маслянокислой ферментации с иммобилизованной биомассой культуры бактерий Cl. tyrobutyricum получен выход МК около 0,5 г/г, или 0,9 моль/моль и УК около 0,27 моль/моль глюкозы.
Vandak и др. [3] представили данные по маслянокислому брожению синтетической среды (в г/л, глюкоза - 30; KH2PO4 - 3; MgSO4-7H2O - 0,6; MnSO4-7H2O - 0,01; FeSO4-7H2O - 0,03; NaCl - 0,01; (NH4)2SO4 - 4; дрожжевой экстракт - 5; остальное дистиллированная вода) штаммом Cl. butyricum S21. Для создания анаэробных условий и стабилизации pH после внесения посевного материала пробирки с питательным субстратом продували С02 и добавляли стерильный мел в количестве 20 г/л. При pH 5,2 и 6,5 концентрация, выход и усредненная продуктивность МК составили 7,26 и 11,75 г/л; 24 и 39%; 0,33 и 0,52 г/лч соответственно.
Цель данных исследований - оценить эффективность продуцирования МК штаммом Cl. butyricum ВКПМ В-9619 на субстратах SOL и ферментативном гидролизате кукурузной кочерыжки без и с добавками мелассы, как дешевых источников углеводного питания микроорганизмов.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Используемые штаммы бактерий. В коллекции культур ВКПМ ФГУП ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов имеются два штамма Cl. Butyricum: ВКПМ В-9619 и ВКПМ В-9617. Предварительные исследования этих штаммов показали, что наиболее эффективен штамм ВКПМ В-9619. Поэтому в данной статье представлены результаты исследований с этим штаммом.
Данные культуры являются облигатными анаэробными бактериями. Это сольвентогенные клостридии; грамположительные, палочковидные, спорообразующие бактерии.
Питательные субстраты. Для культивирования Cl.butyricum использовали синтетические среды MSS, SOL, Vandak и др. [3] а также ферментативный гидролизат кукурузной кочерыжки и мелассу.
Состав среды MSS (г/л): KH2PO4 - 1,0; K2HPO4 - 0,8; MgSO4-7H2O - 1,0; FeSO4-7H2O - 0,05; ацетат аммония - 3; дрожжевой экстракт - 5, цистеин - 0,5; витаминный раствор - 1 мл/л; вода - остальное.
Состав среды SOL (г/л): KH2PO4 - 0,7; K2HPO4 - 0,7; MgSO4-7H2O - 0,1; MnSO4-7H2O - 0,02; FeSO4-7H2O -
0,015; NaCl - 0,01; ацетат аммония - 3; дрожжевой экстракт - 1, пептон - 1,0; цистеин - 0,5; крахмал - 1,0; витаминный раствор - 1 мл/л, резазурин - 1 мг/л, вода - остальное. Содержание глюкозы изменяли в интервале 2-3%.
Питательные субстраты на основе кукурузной кочерыжки состояли из ферментативных гидролизатов с добавками компонентов выше указанных синтетических сред и 1,35% РВИ (1% сахарозы) мелассы. При более высоком количестве мелассы в субстрате выход МК снижался.
Измельченную биомассу кукурузной кочерыжки делили на две фракции на сите d = 1мм. Водную суспензию измельченной кукурузной кочерыжки (легкогидролизуемые полисахариды - 34,5%, трудногидролизуемые полисахариды - 28,45%) с гидромодулем 1 : 8 (фракция с d < 1 м) и с гидромодулем 1 : 7 (фракция с d = 1-5 мм) кипятили с обратным холодильником в течение 1 ч. Ферментативный гидролиз кукурузной кочерыжки проводили в две ступени. На первой ступени гидролиз осуществляли ферментными препаратами «Ксиланаза» (2 мг/г) (производитель НПО «Восток») в течение 1 ч при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке при температуре 50-55 °С и pH 5,5 (pH к концу гидролиза снижался до 4,5, его повышали 2 н раствором NaOH). На второй ступени ферментативный гидролиз проводили в термостате при температуре 50 °С с ферментными препаратами целловиридин (20 мг/г), МЭК-3 (10 мг/г) и «Novozim» (5 мг/г) в течение 24 чс периодическим перемешиванием. pH поддерживали в интервале 5,5-5,0 2 н раствором NaOH.
Состав фугата ферментолизата из порошка (1, d < 1 мм): РВ = 20 г/л, РВИ = 22,2 г/л; и из гранул (2, d = 1-5 мм): РВ = 30,58 г/л, РВИ = 35,84 г/л. Ферментативный гидролизат-3 из кукурузной кочерыжки (d = 1-3 мм) содержал минеральные вещества в соответствии с составом среды Vandak и др. [3]. Моносахаридный состав ферментолизата-1 (г/л): глюкоза - 8,5; ксилоза - 2,4; арабиноза - 0,5; манноза - 0,6; фруктоза - 0,7 (сумма углеводов без инверсии -12,7 г/л). Ферментолизата - 2 (г/л): глюкоза - 21,8; ксилоза - 4,1; арабиноза - 0,8; фруктоза - 4,4 (сумма углеводов без инверсии - 31,1 г/л). Ферментативный гидролизат-2 был разбавлен дистиллированной водой до концентрации РВИ = 9 г/л. Моносахаридный состав ферментативного гидролизата-3 (г/л): глюкоза - 11,9; манноза - 0,7; галактоза - 0,4; ксилоза - 2,8; арабиноза - 0,7; фруктоза - 1,8; (сумма углеводов без инверсии - 18,3 г/л).
В качестве источника углеродного питания и витаминов использовали свекловичную мелассу, содержащую 75% абсолютно сухих веществ, 54,3% РВИ (редуцирующие вещества после инверсии), в том числе 40% сахарозы (легкометаболируемый углевод для большинства микроорганизмов), биотин [4]. Данный отход свёклосахарного производства имеет преимущества по содержанию более легкометаболируемой сахарозы в сравнении с такими отходами, как соевая и тростниковая мелассы [4-7].
Методы анализа. Содержание свободных МК и УК, а также растворителей (бутанол, ацетон, этанол) в культуральных жидкостях (КЖ) определяли газохроматографическим методом после подкисления пробы фосфорной кислотой до pH 3,5. Погрешность определения в диапазоне концентраций 500-10000 мг/л составляет менее 5% относительных.
Содержание моно- и дисахаров в фугате ферментализата кукурузной кочерыжки определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Концентрацию редуцирующих веществ (РВ), пересчитанных на глюкозу, в КЖ и субстратах определяли фотоколориметрическим методом с реактивом DNSA.
Для определения концентрации РВИ в КЖ (субстрате) уточнили известный метод анализа [6]. 1 см3 КЖ (субстрата) после добавки 0,01 см3 концентрированной серной кислоты (98%) кипятили в пробирках V=10 (20) см3 с притертыми пробками на водяной бане в течение 1 ч; делали разведение в 100 (200) раз; после чего определяли в ней (в нем) редуцирующие вещества, пересчитанные на глюкозу, с реактивом DNSA. КЖ (субстрат) предварительно центрифугировали.
Замеры pH делали на рН-метре марки МР-220 с комбинированным электродом.
Содержание углеводов в кукурузной кочерыжке и мелассе определяли эбулиостатическим методом [8].
Методы исследований. Ферментацию бактерий проводили в анаэробных условиях во флаконах общим объемом 120 см3, с резиновыми пробками и алюминиевыми колпачками. Питательные субстраты в количестве 70 см3 заливали во флаконы и нагревали на кипящей водяной бане. В отдельных опытах флаконы с питательным субстратом продували азотом при t = 90-100 “C, в других опытах продувка азотом отсутствовала.
Субстраты стерилизовали при t = 125 “C. Общее время нагрева, выдержки и охлаждения составляло 1 ч.
Основными технологическими показателями для процесса ацидогенеза клостридий являются температура, pH и количество посевного материала.
Исследования, проведенные нами при температурах 35 и 37 “С, показали, что предпочтительной для штаммов Clostridium butyricum ВКПМ В-9619 является температура 37 “С. Поэтому в данных материалах представлены результаты исследований, полученные при температуре 37 “С.
Процесс ацидогенеза клостридий идет в интервале pH от 5,2 до 6,5 [2, 3, 9, 10]. Корректировку pH проводили один раз в сутки 2N водным раствором NaOH. В отдельных опытах для стабилизации pH в субстрат добавляли мел в количестве 2, 3 и 5 г/л.
Количество посевного материала составляло 7 об.%. При более высокой подаче чистой культуры во флаконы в культуральной жидкости повышалась концентрация УК до 4 г/л. После добавки посевного материала pH доводили до 6,3-6,5.
Термообработку культур проводили в субстрате на водяной бане с t = 80 0Св течение 1-2 мин.
Расчеты выхода МК сделаны в вес.% от сброженных РВ. Расчеты выхода бутанола представлены в вес.% от условного крахмала в исходном субстрате.
Количество параллельных ферментаций составляет от 2 до 5 раз. Среднее квадратичное отклонение результата измерения концентрации МК - 0,25. При доверительной вероятности 0,95 коэффициент Стьюдента равен 3,182. Доверительные границы случайной погрешности полученного результата - 0,79 г/л [11].
Обсуждениерезультатов
Для обеспечения высокого выхода МК важно, чтобы она была единственным продуктом биопроцесса. Однако метаболизм бактерий рода Clostridium отличается многообразием путей. Продуктами биосинтеза при ферментации сольвентогенных бактерий рода Clostridium, кроме МК, являются также УК, бутанол, ацетон, этанол, CO2 и др. Эффективность биосинтеза МК при оптимальных управляемых параметрах ферментации (t, pH, количество посевного материала) в основном зависит от состава питательного субстрата.
Были проведены исследования по эффективности процесса ацидогенеза штамма Cl. butyricum ВКПМ В-9619. Для ферментации использовали субстраты SOL с продувкой и без продувки азотом и ферментативные гидролизаты кукурузной кочерыжки с добавками мелассы в количестве 1,35% РВИ.
Результаты исследований эффективности брожения субстрата SOL как с продувкой азотом, так и без -представлены в таблице 1 и на рисунках 1, 2.
По данным таблицы 1 видно, что в процессе брожения субстрата SOL2, подготовленного как с продувкой, так и без продувки азотом при изменении pH в интервале 4,5-6,5 штамм Cl. butyricum ВКПМ В-9619 дает низкий выход МК и продуцирует бутанол в количестве 4 и 2 г/л. При проведении процесса без продувки азотом бутанола образуется меньше.
На рисунках 1 и 2 представлены кинетические кривые образования кислот и растворителей штаммом Cl. butyricum ВКПМ В-9619 на субстрате SOL3 с продувкой его азотом.
Согласно представленным кривым (рис. 1) максимальная концентрация МК составила 3,5 г/л за 26 ч, а бутанола за 88 ч брожения - 6,4 г/л. Максимальная оптическая плотность за 16 ч - 1,95 ОЕ, остаточная концентрация глюкозы при этом была 21 г/л. За 42 ч брожения концентрация глюкозы снизилась до 2,9 г/л (рис. 2).
Для стабилизации pH в питательный субстрат был добавлен мел в количестве 3 г/л. В процессе ферментации штамма Cl. butyricum ВКПМ В-9619 с продувкой флаконов с субстратом азотом и изменении pH в интервале 5,5-6,5 выход МК повысился и составил 31%. Проведение процесса ферментации без продувки азотом и изменении pH в интервале 5,7-6,5 позволило увеличить выход МК до 36%. При проведении процесса без продувки азотом наблюдается снижение концентрации уксусной кислоты.
Таким образом, мы видим, что проведение процесса маслянокислого брожения в статических условиях на субстрате SOL с РВ = 2% как с продувкой, так и без продувки азотом при pH в интервале 5,5-6,5 позволяет повысить концентрацию и выход МК с 0,8-1,5 до 4,7-5,1 г/л и с 4,8-9,4 до 31-36% соответственно. Ведение процесса ферментации без продувки флаконов с субстратом азотом способствует снижению образования примесей.
Таблица 1. Эффективность процесса маслянокислого брожения субстрата SOL
Добавки в субстрат Концентрация РВИ, г/л Время, Химический состав ферментационной жидкости, г/л Выход
SOL, pH исходная остаточная ч МК УК бутанол-1 ацетон этанол МК, %
С продувкой азотом
pH 4,5-6,5 Мел 3 г/л, pH 5,5-6,5 20 30 20 3.5 6,2 2.6 5,0 96 26 88 96 0,8 3,5 2,2 4,7 0,6 2,9 2,2 3,4 4,0 2,6 6,4 0,7 1,1 0,4 0,5 0,4 0,2 0,5 0,4 0,1 4,8 15.0 8.0 31,3
Без продувки азотом
pH 4,5-6,5 20 4,1 96 1,5 1,8 2,1 0,9 0,2 9,4
Мел 3 г/л 20 48 1,4 0,8 0,2 0,0 0,1
pH 5,7-6,5 6,0 72 5,1 0,9 1,6 0,1 0,5 36,4
Меласса pH 4,5-6,5 33.5 11,6 120 3,3 2,9 3,2 0,4 0,6 16,0
Меласса и мел 2 г/л, pH 5,0-6,3 33.5 9 88 5,2 2,0 5,2 0,2 1,4 21,2
УК - уксусная кислота; МК - масляная кислота
із
ГО
CL
S
ё J5
РЧ*
"^"ацетон;
■ этанол;
А бутанол;
—X" масляная кислота; —Ж" уксусная кислота
ч
/V
Т 2.б
О
_о"
о
1.б о
го
- Q.5
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Время, ч
Рис.1. Кинетические кривые образования кислот и растворителей при брожении субстрата 80Ь3, продутого азотом
Время, Ч
Рис. 2. Кинетические кривые изменения концентрации биомассы и глюкозы при брожении субстрата 80Ь3, продутого азотом
Аналогичные ферментации были проведены на субстрате SOL2 с мелассой в количестве 1,35% РВИ без продувки его азотом с и без добавок мела (табл. 1, рис. 3, 4). В случае ферментации штамма Cl. butyricum ВКПМ В-9619 на данном субстрате с добавками мела в количестве 2 г/л изменение pH было в интервале 5,0-6,3. Концентрация МК составила 5,2 г/л и выход МК - 21,2% (33,5 - 9 = 24,5 г/л сброженных углеводов; 5,2-100 : 24,5 = 21,2%). Через 40 ч ферментации при снижении pH до 5,45 резко повысилась концентрация бутанола до 4,3 г/л, через 88 ч при pH 5,0 она составила 5,2 г/л. В данном опыте наблюдается увеличение времени брожения и концентрации остаточных РВИ. Несмотря на это меласса может быть использована в процессе ферментации штамма Cl. butyricum ВКПМ В-9619 с целью получения МК при более длительном времени брожения в сравнении с брожением только глюкозы.
Была исследована эффективность процесса ацидогенеза данного штамма бактерий на ферментативном гидролизате кукурузной кочерыжки как без, так и с добавкой 1,35% РВИ мелассы и компонентов синтетических сред с термообработкой (табл. 2, рис. 5, 6). Среда MSS входит в состав ферментолизата-1, SOL - в 2, Vandak и др. [3] - в 3.
В процессе брожения ферментативного гидролизата кукурузной кочерыжки был добавлен мел в количе -стве 3 г/л. Изменение pH было в интервале 5,5-6,5. Выход МК - 15,8%.
Из ферментативного гидролизата кукурузной кочерыжки было приготовлено три субстрата с различной концентрацией РВИ 22,5; 9 и 18,3 г/л и к ним была добавлена меласса, общая сумма РВИ составила 35,5; 22,5 и 36 г/л (состав углеводов в субстрате с концентрацией РВИ = 36 г/л: глюкоза - 12,6; галактоза - 0,4; манноза -0,7; ксилоза - 2,7; арабиноза - 0,7; фруктоза - 2,7; сахароза - 12,2) от общего количества субстрата соответственно. pH в процессе брожения поддерживали в интервале 5,2-6,5 при использовании сред SOL и MSS, со средой Vandak и др. [3] - 6,0-6,5. Результаты исследований представлены в таблице 2 и на рисунках 5, 6.
7
Ф б
б
4 -
1
З
2
1 -
Q
Q
Время, ч
Рис. 3. Кинетические кривые биосинтеза кислот и растворителей при маслянокислом брожении субстрата 80Ь2 с 1,35% РВИ мелассы и 2 г/л мела
Время, ч
Рис. 4. Кинетические кривые изменения концентрации углеводов на субстрате 80Ь2 с 1,35% РВИ мелассы и 2 г/л мела
Таблица 2. Эффективность процесса маслянокислого брожения ферментативного гидролизата кукурузной
кочерыжки с добавкой мелассы
Концентрация РВИ, г/л Время, рн Химический состав ферментационной жидкости, г/л Выход
исходная остаточная ч МК УК бутанол-1 ацетон этанол МК, %
26* 6,8 168 5,5-6,5 3,0 3,2 0,8 0,1 0,3 15,8
35,5 9,6 192 5,2-6,5 7,4 4,9 1,1 0,3 0,2 28,6
22,5 7,6 168 5,2-6,5 7,3 2,1 1,3 0,3 0,2 49
36 12,5 192 6,0-6,5 8,3 4,1 1,1 0,1 0,2 35,3
17** 2,8 96 5,5-6,5 6,1 4,3 0,5 0,1 0,2 43
* - без мелассы; ** - с инвертированной сахарозой мелассы; МК - масляная кислота; УК - уксусная кислота
Время, ч
Рис. 5. Кинетические кривые изменения концентрации углеводов при брожении смешанного субстрата из ферментативного гидролизата кукурузной кочерыжки и мелассы (РВ = 19 г/л;
РВИ = 36 г/л, в т.ч. РВИ мелассы 13,5 г/л)
Рис. 6. Кинетические кривые изменения концентрации углеводов при брожении ферментативного гидролизата кукурузной кочерыжки и мелассы
По данным, представленным в таблице 2 и рисунке 5, можно сказать, что при ферментации штамма СЇ. Ьиґугієиш ВКПМ В-9619 на смешанном субстрате из ферментативного гидролизата кукурузной кочерыжки и мелассы концентрация и выход МК повышаются. При концентрации РВИ = 22,5 г/л в субстрате выход МК -49%. В процессе ферментации с использованием субстрата с концентрацией РВИ=36 г/л и минеральной средой Vandak и др. [3] ее выход составил 35%.
Анализ остаточных углеводов в ферментационной жидкости данных опытов методом ВЭЖХ показал (рис. 6), что штамм Cl. butyricum ВКПМ В-9619 сбраживает галактозу за 48 ч, фруктозу - за 96 ч. Через 192 чв остаточных сахарах присутствовала только сахароза. Содержание ее в ферментационной жидкости составило 8,6 г/л. Для снижения концентрации остаточных сахаров и сокращения времени брожения необходимо проведение инверсии сахарозы мелассы.
При использовании смешанного субстрата из ферментативного гидролизата кукурузной кочерыжки и инвертированной сахарозы мелассы с концентрацией РВ = 17 г/л процесс брожения длится в течение 96 чс выходом МК 43%.
В заключение можно сказать, что смешанный субстрат из ферментативного гидролизата кукурузной кочерыжки и мелассы после инверсии может быть использован для биосинтеза МК штаммом Cl. butyricum ВКПМ В-9619.
Заключение
Таким образом, по процессу маслянокислого брожения с использованием штамма Cl. butyricum ВКПМ В-9619 впервые установлено, что:
1. Продувка субстрата азотом активизирует синтез бутанола, тогда как в ее отсутствии преимущественно образуется МК.
2. При ферментации штамма на ферментативном гидролизате кукурузной кочерыжки с добавками мелассы в количестве 1,35% РВИ (1% сахарозы) (технологические параметры процесса ацидогенеза: концентрация РВ = 2%; t = 37 °С; pH 5,7-6,5; время брожения - 96 ч; количество посевного материала - 7 % отн.) выход масляной кислоты составит не менее 43% от потребленных РВ.
3. Штамм сбраживает помимо гексоз (глюкоза, галактоза, манноза, фруктоза) и пентозы (ксилозу и ара-бинозу) и в последнюю очередь сахарозу.
4. Для промышленного производства МК можно рекомендовать смешанный субстрат, состоящий из ферментативного гидролизата кукурузной кочерыжки или других видов отходов производств от переработ -ки пентозан- и целлюлозосодержащего растительного сырья с добавкой мелассы в количестве 1,35% РВИ (1% сахарозы) от количества исходного субстрата после инверсии сахарозы.
5. Выделение МК из ферментационной жидкости, содержащей преимущественно МК, возможно путем ионного обмена.
Список литературы
1. Яроцкий С.В., Сушкова В.И., Синеокий С.П., Лукина Г.П. Экономический анализ производства биобутанола и перспективы его развития // Деп. в ВИНИТИ 10.04.08. №308-2008. 65 с.
2. Ramey David. Production of bytyric acid and butanol from biomass. Final report. Work performed under: contract №DE-F-G-02-00ER 86106 for Departament of Energy. Morgantown, WV, 2004.
3. Vandak D., Zigova J., Stardik E. and Schlosser S. Evalusion of solvent and pH for extractive fermentation of butyric acid // Proc. Biochem. 1997. V. 32. Pp. 245-251.
4. Новаковская C.C., Шишацкий Ю.И. Производство пекарских дрожжей: справочник. М., 1990. 335 c.
5. Ezeji Thaddeus С., Qureshi Nasib, Blaschek Hans P. Butanol fermentation reseach: upstream and downstream manipulations // Chemical reconl. 2004. V. 4. Pp. 305-314.
6. Сушкова В.И., Воробьёва Г.И. Безотходная конверсия растительного сырья в биологически активные вещества. М., 2008. 216 c.
7. ЛоготкинИ.С. Технология ацетоно-бутилового производства. М., 1958.
8. Емельянова И.Э. Химико-технический контроль гидролизного производства. М., 1969. 328 с.
9. Zigova J. and Sturdik E. Advances in biotechnological production of butyric acid // Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 2000. N24. Pp. 153-160.
10. Ying Zhu, Zetang Wu, Shang-Tian Yang. Butyric acid production from acid hydrolysate of corn fibre by Clostridium tyrobutyricum in a fibrous-bed bioreactor // Process Biochemistry. 2002. N38. Pp. 657-666.
11. ГОСТ 8.207-76. Прямые измерения с многократными наблюдениями. Методы обработки результатов наблюдений. Основные положения.
Поступило в редакцию 13 июля 2010 г.
После переработки 15 декабря 2010 г.
