Культивирование Clostridium acetobutylicum ВКМ 1787 – продуцента бутанола, ацетона и этанола Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 663.1

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM ВКМ 1787 -ПРОДУЦЕНТА БУТАНОЛА, АЦЕТОНА И ЭТАНОЛА

1 19

К.В. Молокова1, Е.А. Привалова1, Т.А. Гиль2

Иркутский государственный технический университет, 664013, Иркутск, ул. Лермонтова, 83, v35@ istu.edu. 2Иркутская государственная сельскохозяйственная академия, 664038, Иркутская обл., п. Молодежный, cs.cvetus_1992@list.ru.

В данной работе была подобрана питательная среда для штамма Clostridium acetobutylicum ВКМ 1787 с целью получения максимального выхода нейтральных продуктов метаболизма. Было определено время культивирования микроорганизмов, которое составило 30 часов. Штамм является медленнорастущим. Наибольший выход растворителей (около 22 г/дм3) наблюдается при протекании процесса на субстрате, представляющем собой клейстеризованную пшеничную муку. Ил. 2. Табл. 1. Библиогр. 10 назв.

Ключевые слова: Clostridium acetobutylicum; биобутанол; ацетоно-бутиловое брожение.

CULTIVATION OF CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM VKM 1787 -PRODUCER OF BUTANOL, ACETONE AND ETHANOL

K.V.Molokova, E.A.Privalova, T.A.Gil

1

Irkutsk State Technical University, 664074, Irkutsk, Lermontov Str., 83, v35@istu.edu.

2

Irkutsk State Agricultural Academy

Molodezhny Settl., Irkutsk 664038, Russia, cs.cvetus_1992@list.ru.

The nutrient medium for Clostridium acetobutylicum VKM 1787 cultivation was selected in this work to achieve the highest possible yield of neutral metabolites. Microorganism cultivation time was found to be 30 hours. The strain Clostridium acetobutylicum VKM 1787 is slow-growing. The highest solvents yield (about 22 g/dm3) was observed when process conducting on a gelatinized wheat flour substrate. 2 figures. 1 table. 10 sources.

Keywords: Clostridium acetobutylicum; biobutanol; A-B-E fermentation.

ВВЕДЕНИЕ

Бактерии Clostridium acetobutylicum являются продуцентами таких ценных продуктов, как бутанол, ацетон и этанол. Данные микроорганизмы способны сбраживать широкий спектр углеводов, в том числе крахмал, глюкозу, сахарозу, мальтозу, фруктозу, галактозу, маннит, ман-нозу, ксилозу, арабинозу и т.д. Набор сбраживаемых углеводов зависит от штамма микроорганизмов. Ацетоно-бутиловое брожение - двухфазный процесс, в котором на первом этапе происходит образование уксусной и масляной кислот, в дальнейшем конвертируемых бактериями в этанол, ацетон и бутанол. В среднем соотношение получаемых растворителей составляет бутанол : ацетон : этанол = 6 : 3 : 1 [1]. Концентрация растворителей в культуральной жидкости в конце брожения зависит от многих факторов (состав среды, условия брожения, особенности используемого штамма и т.д.) и в большинстве случаев составляет 18-33 г/дм3 [2].

В настоящее время путем селекции и мутагенеза разрабатываются новые штаммы бактерий Clostridium acetobutylicum, способные сбраживать углеводы с более высоким выходом растворителей, а также обладающие большей резистентностью по отношению к неблагоприятным факторам, в частности, к повышенной концентрации в культуральной жидкости продуктов жизнедеятельности, которые оказывают токсическое действие на бактерии [3-5]. Основной технологической задачей, таким образом, становится повышение выхода бутанола, ацетона и этанола путем поддержания жизнедеятельности микроорганизмов. Для достижения этой цели используются такие способы, как продувка культуральной жидкости газами, жидкостная экстракция, молекулярная адсорбция, мембранная фильтрация, периодическое вакуумирование и

др. [6].

Целью данной работы был подбор питательной среды для достижения максимальной концентрации продуктов ферментолиза в куль-туральной жидкости и определение времени культивирования штамма бактерий Clostridium acetobutylicum ВКМ 1787.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объектом исследования являлся штамм бактерий Clostridium acetobutylicum ВКМ 1787. По

литературным данным [2] штамм способен сбраживать как гексозы, так и пентозы с образованием до 13-18 г/дм бутанола. Для выбора субстрата, наиболее подходящего для культивирования микроорганизмов, и получения высокого выхода растворителей были проведены эксперименты по выращиванию культуры бактерий данного штамма на синтетических и натуральных средах. Состав сред определен в соответствии с литературными данными [3,7] и представлен в таблице 1.

Полученные питательные среды после стерилизации посредством автоклавирования в течение 40 мин при давлении 0,5 атм., хранились при температуре 3-5 оС.

Ферментация в течение 72 ч при температуре 37 °С проводилась на приведенных стерильных средах в биологических пробирках объемом 50 см в четырех повторностях. Для обеспечения анаэробных условий пробирки помещали в анаэростат и использовали газогенерирующие пакеты «Анаэрогаз». По истечении установленного времени ферментации в культуральной жидкости определяли концентрацию полученных растворителей методом ГХ-МС на газовом хроматографе 7820 А с селективным масс-спектро-метрическим детектором НР 5975 фирмы «Agilent Technologies». Условия хроматографи-рования: энергия ионизации - 70 эВ; температура сепаратора - 280°С, ионного источника -230 °С; кварцевая колонка 30000 * 0,25 мм со стационарной фазой (95% диметил-5% дифе-нилполисилоксан); температура колонки 50 оС. Идентификацию компонентов осуществляли с использованием библиотеки масс-спектров «NIST11». Количественное содержание компонентов вычисляли по площадям пиков с использованием корректирующих коэффициентов чувствительности.

Для определения продолжительности культивирования в биологические пробирки со средой, на которой в предыдущем этапе эксперимента была зафиксирована максимальная концентрация растворителей, засевали 10 % иноку-лята от объема питательной среды. Во время культивирования каждые 2 часа из культураль-ной жидкости отбирали пробы в объеме 1 см3для определения титра клеток клостридий по методу Коха высевом на рыбо-пептонный агар в чашках

Состав питательных сред для культивирования C. acetobutylicum

Таблица

№ среды Состав среды Номинальное количество, г/дм3

Натуральные питательные среды

картофель 250

1 глюкоза 5

СаСОз 2

(NH4)2SÜ4 1,5

2 мука пшеничная 60

Синтетические питательные среды

сахароза 4

дрожжевой экстракт 20

KH2PO4 0,5

3 K2HPO4 0,5

MgSO4 0,2

NaCl 0,02

FeSO4 0,01

MnSO4 0,01

крахмал 40

дрожжевой экстракт 20

KH2PO4 0,5

4 K2HPO4 0,5

MgSO4 0,2

NaCl 0,02

FeSO4 0,01

MnSO4 0,01

№ среды Состав среды Номинальное количество, г/дм3

5 глюкоза 40

ЫИдО! 2

КН2РО4 0,5

МдЭО4 0,3

МпЭО4 0,02

РеЭО4 0,02

№О! 0,02

дрожжевой экстракт 20

6 сахароза 20

глюкоза 20

(ЫН4)23О4 0,225

ОаООз 0,03

7 арабиноза, ксилоза 2

манноза, галактоза 0,5

глюкоза 10

сахароза 20

(ЫН4)2ЭО4 4,5

дрожжевой экстракт 3

Петри. Через 2-3 суток проводился подсчет выросших колоний с дальнейшим пересчетом на количество клеток в пробе [8].

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

На основании данных хроматографического анализа культуральной жидкости, полученной на

18

средах различного состава (табл. 1), можно сделать вывод о том, что максимальная концентрация растворителей достигается при использовании питательной среды 2 (рис. 1), на которой за 72 ч (3 суток) культивирования было получено 15,28 г/дм3 бутанола. Синтетические среды на основе смеси сахаров (3, 4, 6, 7) после фермен-

m

16

14 12

10

0)

ш

И а цетон ■ бутанол В этанол

□ уксусная кислота

□ масляная кислота

12 5

номер среды

Рис. 1. Влияние источников углерода в разных питательных средах на концентрацию метаболитов штамма бактерий Clostridium acetobutylicum ВКМ1787 (время ферментации 72 ч, 37 °С)

время, ч

Рис. 2. Изменение численности клеток бактерий Clostridium acetobutylicum ВКМ 1787 на мучной среде

тации не содержали исследуемых метаболитов, что позволяет считать их неблагоприятными для культивирования клеток клостридий и получения растворителей. Среда 1 и среда 5 содержали ацетон, этанол, бутанол в более низких концентрациях по сравнению со средой 2. Так, в культуральной жидкости, полученной на основе глюкозы (среда 5), концентрация бутанола через 72 ч ферментации составила 8,51 г/дм3. На средах 1 и 5 отмечены также более высокие концентрации метаболитов первой фазы брожения -уксусной и масляной кислот, что может свидетельствовать о более низкой скорости ферментации, и предполагает увеличение продолжительности процесса.

Результаты определения титра микроорганизмов на мучной среде по методу Коха приведены на рисунке 2.

Интенсивный рост культуры Clostridium acetobutylicum штамма ВКМ 1787 на мучной среде отмечали спустя 24 ч от начала культивирования, максимальное количество клеток бактерий (4 х 105 КОЕ/см ) было отмечено через 30-32 ч. Дальнейшее увеличение времени культивирования приводит к снижению числа клеток, вероятно, вследствие увеличения концентрации продуктов ферментации, которые действуют на клетки губительно.

Результаты кинетических исследований, представленные на рисунке 2, показывают, что

1. Корнеева О.С., Жеребцов Н.А. Роль амилоли-тических ферментов Clostridium acetobutylicum в биосинтезе растворителей // Биотехнология. 1986. № 3. С. 133-136.

2. Laili Gholizadeh Baroghi. Enhanced Butanol Pro-

duction by Free and Immobilized Clostridium sp. Cells

using Butyric Acid as Co-Substrate: dis. PhD in biology 08.12.2009 / University College of Borâs. School of Engi-

neering, 2009. 115 c.

культура бактерий на мучной среде обладает специфической кривой роста. Стационарная фаза не выражена: после достижения бактериями максимального количества КОЕ на 1 см3, его зн а-чение сохраняется на протяжении краткого промежутка времени, а затем наблюдается начало отмирания клеток. Такой характер роста встречается у некоторых бактерий [9]. Полученные результаты согласуются с данными, описанными в литературных источниках [10].

Согласно расчетам параметров роста клеток по [8], время генерации составляло 120 мин, константа скорости деления - 0,5, отсюда следует, что штамм исследуемой культуры медленнорастущий. Следовательно, рекомендуется выращивать инокулят данного штамма для ферментации с целью получения растворителей не менее 30 ч.

ВЫВОДЫ

Исследуемый штамм бактерий Clostridium acetobutylicum ВКМ 1787 является медленнорастущим. Штамм способен сбраживать клей-стерезованную муку, синтетические среды на основе глюкозы, крахмала картофеля. Наибольший выход растворителей наблюдается при протекании процесса на субстрате, представляющем собой клейстеризованную муку.

НЕСКИЙ СПИСОК

3. Давидов, Е.Р. Штамм бактерий Clostridium acetobutylicum - продуцент бутанола, ацетона и этанола / П.С. Каныгин, К.Б. Филиппов, О.А. Фракин, И.В. Черемнов, Е.В. Чекасина // Патент РФ №2381270. Опубл. 10.02.2010.

4. Qurat-ul-Ain Syed, Muhammad Nadeem, Rubina Nelofer. Enhanced butanol production by mutant strains of Clostridium acetobutylicum in molasses medium // Turkish Journal of Biochemistry. 2008. № 33(1). P. 25-30.

5. Manish Kumar, Kalyan Gayen. Developments in biobutanol production: New insights // Applied energy. 2011. № 88. Р 1999-2012.

6. Сушкова В.И., Яроцкий С.В. Эффективность методов выделения продуктов ацетоно-бутиловой ферментации // Химия растительного сырья. 2011. № 3. С. 5-14.

7. Сушкова, В.И. Штамм бактерий Clostridium acetobutylicum - продуцент н-бутанола / С. В. Яроцкий // Патент РФ №2458118. Опубл. 17.02.2011.

8. Гусев, М. В. Микробиология / М. В. Гусев, Л. А. Минеева. М. : Академия, 2003. 462 с.

9. Hideaki Shinto, Yukihiro Tashiro, Mayu Yamashi-ta, Genta Kobayashi, Tatsuya Sekiguchi, Taizo Hanai, Yuki Kuriya ,Masahiro Okamoto, Kenji Sonomoto. Kinetic modeling and sensitivity analysis of acetone-butanol-ethanol production // Journal of Biotechnology. 2007. № 131. 45-56.

10.Никольская А.Б. Каталитические системы получения водорода биофтолизом воды : автореф. дис. ... канд. хим. Москва.: Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, 2012. 25 с.

Поступило в редакцию 27 июня 2013 г.