CC BY
786
УДК 579.66.663.18
А. Я. Самуйленко, В. И. Еремец, С. А. Гринь, С. М. Шинкарев, Л. А. Неминущая, Т. А. Скотникова, С. А. Лермонтов, А. В. Канарский, Л. А. Мингазова
ПРОМЫШЛЕННЫЕ СПОСОБЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПОЛУЧЕНИЯ И ВЫДЕЛЕНИЯ
МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ
Ключевые слова: молочная кислота, культивирование, мембранные технологии, фильтрация.
Представлен обзор научно-технической литературы и патентов по существующим и перспективным технологиям производства молочной кислоты, которая находит применение в пищевой промышленности, сельском хозяйстве, в производстве биодеградируемых полимерных материалов в частности для получения полилакти-дов. Поскольку традиционные способы получения и выделения молочной кислоты недостаточно эффективны, сопровождаются большим количеством образования отходов, переработка которых энергозатратна и может приводить к загрязнению окружающей среды, совершенствование технологии производства молочной кислоты является актуальной и экономически важной задачей.
Keywords: milk acid, cultivation, membranous technologies, filtration.
A review of scientific literature and patents on existing and emerging technologies ofproduction of lactic acid, which is used in the food industry, agriculture, in the production of biodegradable polymers such as polylactide for. Since traditional methods of preparation and isolation of lactic acid are not effective enough, accompanied by a large number of waste, energy consumption and recycling of which can lead to pollution of the environment, improvement of lactic acid production technology is relevant and economically important challenge.
Актуальность
Полимеры молочной кислоты (ПМК) - полилак-тиды - являются биоразлагаемыми, при этом период разложения в условиях естественной биодеструкции составляет несколько месяцев. Качество полилакти-да определяется стереорегулярностью его полимерной цепи. Наибольшую перспективу практического применения, особенно в медицине, имеет стереоре-гулярный поли-Ь-лактид, имеющий самую высокую степень кристалличности при сравнительно низкой температуре плавления, равной 180°С.
Существующие технологии не обеспечивают интенсивный и стабильный синтез молочной кислоты (МК), кроме того традиционные способы ее выделения сопровождаются накоплением большого количества отходов, переработка которых требует больших энергетических затрат и, как правило, приводит к загрязнению окружающей среды.
МК образуется в результате анаэробного превращения углеводов молочнокислыми бактериями. Схема биосинтеза МК представлена на рис. 1 [1].
В России МК для пищевых целей получают в соответствии с технологической инструкцией ТИ 18-8-1-83 сбраживанием углеводсодержащего сырья молочнокислыми бактериями рода Lactobacillus, которые синтезируют D(-)-, L(+)-, DL - формы МК.
Технические требования и методы контроля МК, предназначенной для использования в качестве пищевой добавки (Е270), установлены в ГОСТ 4902006 [2].
Сейчас в промышленности в основном реализуется периодический процесс ферментации, при котором на первом этапе методом глубинного культивирования с помощью гомоферментативных термофильных бактерий выращивается биомасса микробного продукта, а на следующем осуществляется
синтез МК с добавлением в ферментационную среду требуемого количества глюкозы (сахарозы). В этих процессах полный цикл ферментации составляет от 2 до 10 суток. Эскизная схема производства МК представлена на рисунке 2 [3,4].
ферменты пиколки
ЦНцЦ
лаштдегндрогеназа
2CHj—CHUH—СООН Рис. 1 - Схема биосинтеза молочной кислоты
В промышленных и лабораторных условиях МК получают из глюкозы, сахарозы, мелассы, смеси сахара-сырца, сока сорго, гидрола, рафинадной патоки и свекловичной мелассы, лактозы, гидролиза-тов крахмала и целлюлозосодержащих материалов [5,6].
Почти все современные технологии получения МК основаны на культивировании разных термофильных штаммов лактобацилл палочковидных форм, преимущественно Lactobacillus delbrueckii при температуре 48-50°C с последующим выделением биосинтезируемой МК из ферментационной среды. В условиях повышенной температуры в процессе культивирования не развивается посторонняя микрофлора, и осуществление процесса не требует соблюдения специальных условий стерильности. Культивирование продуцента осуществляют отъём-но-доливным методом, длительность которого составляет 10-12 суток, в процессе которого одну часть культуральной жидкости отбирают и направляют на дальнейшую переработку, а вторую часть
используют как посевной материал, в который добавляют свежую питательную среду и цикл культивирования повторяют [7].
Поссвной Питательная
материал среда _±_*_
Размножение чистой культуры
Вытяжка
солодовых ростков
Т
Молочнокислое брожение (49... 50 °С)
Е
Известное Обработка сброженного раствора
молот ' гашеной известью (КО... 90 Т)
Фильтрация
I
Фвлырат ---+
Кристаллизация лактата кальция
г
Сериал Расщепление лактата кальция
кислота ' серией кислотой
Желтая
вромщяиль k Очистка молочной кислоты
Активный
уголь '
+
Фильтрация I ИИШЬЫЙ —■- шлам
+
Пар ( Первое упаривание раствора Конденсат
до 50 %-noii концентрации ----*
т
Фильтрация 1 Гилепаы^ шлам
Пар ( * Второе упаривание раствора Гшковый
до SO %-кой концентрации шлам
Фильтрация
Е
Конденсат
Розлив
Рис. 2 - Схема производства молочной кислоты
Биосинтезируемая МК в процессе культивирования нейтрализуется с помощью CaO или Са(ОН)2. Выделение МК из ферментационной среды осуществляют переводом лактата кальция в МК с H2SO4. В результате, накопление МК в культураль-ной жидкости составляет 110-130 г/л, а степень конверсии сахаров 90-98%. Удельный выход МК лежит в пределах 0,2-0,4 г/лхчас.
В.В. Евелева [8] предлагает способ получения молочной кислоты, который включает сбраживание сахаросодержащей питательной среды молочнокислыми бактериями Lactobacillus delbrueckii в присутствии солодовых ростков и нейтрализацию образующейся МК. Способ отличается тем, что питательную среду готовят из смеси гидролизата крахмала и сахара-песка в соотношении от 60 : 40 до 40 : 60 мас.% по внесённому количеству редуцирующих сахаров и из солодовых ростков, обработанных раствором МК концентрацией 0,8- 1,0%, а при нейтрализации поддерживают титруемую кислотность на уровне 0,7-1,0%. Это позволяет:
- сократить продолжительность процесса на 39-53 ч;
- увеличить выход МК от введённого сахара на 1,6-3,7% и среднесуточное накопление лактата кальция на 0,5-0,7% С.
Кендзи с соавторами предлагают способы получения МК, лактида и полимолочной кислоты (ПМК) путём непрерывной ферментации микроорганизмами, обладающими способностью молочнокислого брожения; двухстадийной фильтрации ферментационной среды через мембрану со средним размером пор от 0,01 мкм до 1 мкм при разности трансмембранного давления от 0,1 до 20 кПа и нанофильтра-ционную мембрану. Затем осуществляют дистилляцию полученного фильтрата при давлении от 10 Па до 30 кПа и температуре от 25°C до 200°C для извлечения молочной кислоты. Молочную кислоту каталитически превращают в лактид, либо в ПМК путём прямой дегидратационной поликонденсации. В конечном итоге, возможно получение МК с оптической чистотой до 99% и выходом до 60-92%, и ПМК с улучшенными свойствами - термостабильностью, механической прочностью и цветом [9].
А. П. Бочкова с соавторами предлагают способ получения МК сбраживанием сахарсодержащей среды молочнокислыми бактериями штамма Lactobacillus delbrueckii ВКПМ В-8744 (возраст культуры 48-72 ч) в присутствии солодовых ростков (12-15 г/л), обработанных водой, подкисленной МК до рН 4,0-5,0 и ферментным препаратом ксилоглю-канофоетидином (200-600 ед./л ксиланазной активности). Среда содержит мел в количестве 60% от общего количества, питательные соли и дрожжевой экстракт. В качестве питательных солей используют цитрат аммония, сульфаты марганца, железа и магния, одно- и двузамещённые фосфаты калия. Нейтрализацию образующейся МК проводят через 24 ч. после начала процесса брожения введением 40% оставшегося мела. Данный способ позволяет повысить выход МК на 8% и общую продуктивность процесса брожения в среднем на 236%. [10].
Существенным недостатком описанных способов получения МК является длительность процесса биосинтеза, а с этим связаны довольно большие затраты энергоресурсов, необходимые для поддержания требуемого температурного режима, а также малая оборачиваемость производственного оборудования (коэффициент использования оборудования).
В настоящее время одним из перспективных направлений является использование в качестве продуцента МК кокковых форм молочнокислых бактерий, которые способны расти при повышенной температуре. Среди кокковых форм молочнокислых бактерий также имеются термотолерантные и термофильные культуры.
Д. М. Исакова предлагает способ получения МК с использованием кокковых форм молочнокислых бактерий (Str. falcium, L.acidophillus v. coccoideus, Str. Therniophullus), способных расти при повышенных температурах. Автор показала, что в отличие от палочковидных форм кокковые формы молочнокислых бактерий обладают более высокой скоростью роста. Так, максимально возможное количество МК - 150-170 г/л - накапливается у кокковых форм в
течение первых суток. Термотолерантные палочки за двое суток накапливают 115 г/л МК, а термофильные палочки всего 30 г/л, т.е. в 5-6 раз меньше. Продуктивность кокковых форм по удельному выходу молочной кислоты выше в 1,5-4,0 раза. Культивирование осуществляют на традиционно используемых для выращивания молочнокислых бактерий питательных средах, в качестве источника углерода могут быть использованы лактоза, сахароза, глюкоза, а в качестве источника азота - автолизаты дрожжей (БВК, пекарские, пивные). Среда может быть дополнена стимулирующими рост бактерий и биосинтез МК добавками, такими как солодовые ростки, кукурузный экстракт. Выращивание осуществляют при 40-45°С или 48-50°С в случае термотолерантных или термофильных организмов, соответственно, в традиционных для данных микроорганизмов условиях. Биосинтезируемая МК в процессе культивирования нейтрализуется с помощью Са(ОН)2 или СаО. Длительность ферментации составляет 12-20 ч и накопление в ферментационной среде МК достигается 150-170 г/л. Выделение МК из ферментационной среды осуществляют переводом лактата кальция в МК с использованием Н^04 [11,12].
Многочисленные исследования, проводимые во Франции, Англии, США, Германии, Японии, Польше, Нидерландах, Китае, Египте, России направлены, как правило, на совершенствование методов биосинтеза МК и поиск условий, при которых достигаются наибольшие значения определяемых технико-экономических показателей.
При производстве МК в качестве побочных продуктов образуются щавелевая, винная, муравьиная, лимонная, пировиноградная, уксусная, пропионовая и другие кислоты, а также маннит, глицерин, неорганические ионы и т.д. Поэтому, товарная молочная кислота после выделения и очистки может содержать все эти примеси в количестве до 10%.
Одним из важных этапов получения МК является её выделение и очистка. Производственные способы выделения и очистки, применяемые в других областях промышленности, не могут быть использованы в производстве пищевой МК как с экономической, так и с точки зрения безопасности продукта. При анализе доступных литературных источников, отмечены единичные исследовательские работы по очистке лактатсодержащих растворов и растворов МК.
Ферментационный раствор содержит ряд примесей, таких как остаточные сахара, питательные вещества, органические кислоты и др. Извлечение из него МК осуществляют несколькими способами, например в виде лактата кальция. Для этого раствор нейтрализуется карбонатом кальция, для улучшения качества продукта в раствор после нейтрализации вводится кремниевая кислота в количестве 60-80 мг/л, образовавшийся осадок удаляется центрифугированием. В дальнейшем производится омагничи-вание надосадочной жидкости, разложение лактата кальция серной кислотой и фильтрование МК на вакуум-фильтре [13].
Учёными из Белоруссии предложен способ выделения молочной кислоты из многокомпонентного водного раствора - экстракцией в кислой среде 50%-ным раствором триоктиламина в октане с добавлением 5-10 об % октанола с последующей реэкстрак-цией из органической фазы в виде лактата натрия водным раствором гидроксида натрия [14].
Известен способ выделения МК из растворов с глюкозосодержащим субстратом сорбцией в виде лактат-ионов на сильноосновном гелевом анионите. Используется анионит в С1- или ОН- формах, а элюирование МК осуществляется раствором соляной кислоты с концентрацией 0,15-0,5 моль/л или 0,5-1,0 молярными растворами щелочей (№ОН или КОН). Ряд авторов предлагают извлекать МК экстракцией 0,1 молярным раствором три-п-октилфосфиноксида (ТОФО) в гексане при рН равновесной водной фазы равной 3,5. Реэкстракцию рекомендовано проводить растворами гидроксида натрия, с получением реэкстрактов, содержащих 6070 г/л МК.
Ещё одним способом получения МК является экстракция при рН 5,5-6,5, в качестве экстрагента при этом используют 0,2 молярный раствор триок-тилметиламмоний хлорида (ТОМАХ) в олеиловом спирте. Реэкстракцию МК рекомендовано проводить раствором хлорида натрия с концентрацией 1,0 моль/л, при этом одновременно происходит регенерация экстрагента в С1-форму. Процесс экстракции молочной кислоты проводится в цикле с процессом брожения, при этом рафинат (водная фаза после экстракции МК) и экстрагент после реэкстракции являются оборотными, т.е. рафинат после укрепления по глюкозе вновь направляется на стадию брожения, а регенерированный экстрагент - на стадию экстракции. С учётом того, что при рН > 5,0 МК в воде практически вся диссоциирована и находится в виде лактата, процесс экстракции молочной кислоты ТОМАХ (^N0) может быть описан как реакция межфазного анионного обмена (уравнение 1):
^а(0) + ~Я4М(0) + а-(В) (1)
где индексы (о) и (в) означают органическую и водную фазы, соответственно, а процесс реэкстракции описывается уравнением 2:
Я4М(о) + №С1(в) ~ Я4^1(о) +NaL(в) (2)
Для повышения степени извлечения МК из ферментационных растворов и предотвращения попадания хлорид-иона в водную фазу после экстракции, ряд авторов предлагает извлекать МК из растворов брожения экстракцией солью четвертичного аммониевого основания в сульфатной форме [(Я4№)^04] в разбавителе и реэкстракцию кислоты - растворами гидроксида натрия [13].
Ряд авторов предлагают в качестве экстрагентов молочной кислоты использовать триоктиламин ((С^Ш [15].
Для достижения экономической эффективности процесса необходимо обеспечить высокую продуктивность процесса, высокую селективность процесса, высокую концентрацию конечного продукта в культуральной жидкости, конверсию субстрата, а также исключить дорогостоящие компоненты из состава питательных сред. Всё это требует поиска
возможных способов интенсификации процесса, который заключается в подборе штамма молочнокислых бактерий и в оптимизации процесса культивирования. Известно, что проведение культивирования в мембранном биореакторе способно значительно повысить характеристики процесса. Внедрение нанофильтрации и микрофильтрации в систему производства молочной кислоты позволяет получать 95% чистую L(+) молочную кислоту. Мембранный реактор представляет собой систему, которая состоит из биореактора с непрерывным потоком питательной среды и отводом культуральной жидкости с пропусканием её через мембранный фильтр и возвратом биомассы (рис. 3) [12,16, 17].
Рис. 3 - Получение МК с использованием мембранного реактора
Э. А. Гаджиев предлагает технологию получения МК из крахмалосодержащего сырья с использованием набухающих бентонитов для очистки сброженных лактатсодержащих растворов, что способствует увеличению биоконверсии на 15,8%, удалению потенциальных ингибиторов биосинтеза МК, обеспечивает эффективность осаждения взвешенных частиц до 99% по сравнению с 85% при традиционном способе очистки [18].
Выводы
Показано, что совершенствование технологии производства молочной кислоты должно быть основано на использовании перспективных источников углеводов для биоконверсии в целевой продукт,
оптимизация технологических параметров на всех стадиях ее получения [19].
Совершенствование методов концентрирования и очистки растворов МК, использование отходов производства позволит снизить энергоемкость производства и антропогенную нагрузку на окружающую среду.
Литература
1. В.П. Комов, В.Н. Швецова, Биохимия: учеб. Для вузов. Дрофа, Москва, 2004. 638 с.
2. ГОСТ 490-2006 Кислота молочная пищевая. Технические условия. - М.: Стандартинформ, 2007. - 27 с.
3. Е.И. Муратова, О.В. Зюзина, О.Б. Шуняева, Биотехнология органических кислот и белковых препаратов. Изд-во ТГТУ, Тамбов, 2007. 80 с.
4. S. Varadarajan, D.J. Miller , Biotechnol Progr., 15, 845854 (1999);
5. Зимагулова Л.А., Гематдинова В.М., Канарский А.В., Вестник Казанского технологического университета, 19,16, 112-114, (2016).
6. Гариева Ф.Р, Гаврилов В.И., Мусин Р.З., Кашапов А,В, Вестник Казанского технологического университета, 15,10, 177-179, (2012).
7. М.Ю. Плетнев, Packaging R&D., 3, 46-51 (2007);
8. Пат. РФ 2149188 (2000);
9. Пат. РФ 2574783 (2016);
10. Пат. РФ 2306340 (2007);
11. Пат. РФ 2175014 (2001);
12. K. L. Wasewar, Chem. Biochem. Eng., № 19 (2), 159-172 (2005);
13. Пат. РФ 2513081 (2014);
14. Пат. Республика Беларусь 17968 (2014);
15. I. S. Udachan, A. K. Sahoo, Brazilian J. of Chemical Engineering., 03, 821-827 (2014);
16. А.С. Дерунец, В.Д. Смирнова, А.В. Белодед, Успехи в химии и химической технологии, Том XXVII, 8, 105111 (2013);
17. T. Ghaffar, M. Irshad, Z. Anwar, T. Aqil, Z. Zulifqar, A. Tariq, M. Kamran, N. Ehsan, S. Mehmood, J. of Radiation Research and Applied Sciences., 7, 2, April, 222-229 (2014);
18. Э.А. Гаджиев. Дисс. канд. техн. наук, Санкт-Петербургский гос. ун-т низкотемпературных и пищевых технологий, Санкт-Петербург , 2000. 134 с.
19. Отчеты Abercade: Рынок молочной и лимонной кислоты в России в 2011-2015 годах. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://biotech2030.ru/otchety-abercade-rynok-molochnoj-i-limonnoj-kisloty-v-rossii-v-2011-2015-godah/
© А. Я. Самуйленко - академик РАН, д.в.н., профессор, директор ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ВНИТИБП), nem_la53@mail.ru; В. И. Еремец - д.б.н.,профессор, зам. директора ФГБНУ ВНИТИБП, nem_la53@mail.ru; С. А. Гринь - д.б.н.,профессор, зам. директора ФГБНУ ВНИТИБП, nem_la53@mail.ru; С. М. Шинкарев - к.б.н., зав. отделом конструирования биопрепаратов ФГБНУ ВНИТИБП; Л. А. Неминущая - д. б. н., доцент, вед. научн. сотрудник отдела обеспечения качества лекарственных средств для ветеринарии ФГБНУ ВНИТИБП, nem_la53@mail.ru; Т. А. Скотникова - д. б. н., доцент, вед. научн. сотрудник отдела обеспечения качества лекарственных средств для ветеринарии ФГБНУ ВНИТИБП, ook_vnitibp@mail.ru.; С. А. Лермонтов - член-корр РАН, д.х.н., профессор, зав. лаб. новых синтетических методов , институт физиологически активных веществ (ИФАВ), nem_la53@mail.ru; А. В. Канарский- проф., д.т.н., каф. пищевой биотехнологии, КНИТУ, alb46@mail.ru; Л. А. Мингазова - аспирант кафедры пищевая инженерия малых предприятий КНИТУ, zlei-san1@mail.ru.
© A. I. Samujlenko - Academician of Russian Academy of Sciences, Doctor of Veterinary, professor, director FGBNU "All-Russian Scientific Research and Technological Institute of Biological Industry" (VNITIBP), nem_la53@mail.ru; V. I. Eremets - Ph.D., professor, deputy. Director FGBNU VNITIBP, nem_la53@mail.ru; S. A. Grin - Ph.D., professor, deputy. Director FGBNU VNITIBP, nem_la53@mail.ru; C. M. Shinkarev - PhD, Head. design department biologics FGBNU VNITIBP, nem_la53@mail.ru; L. A. Neminuschiy - d. b. Sc., Associate Professor, the Vedas. Scien. at the Department to ensure the quality of medicinal products for veterinary FGBNU VNITIBP, nem_la53@mail.ru; T. A. Skotnikova - d. b. Sc., Associate Professor, the Vedas. Scien. at the Department to ensure the quality of medicinal products for veterinary FGBNU VNITIBP, ook_vnitibp@mail.ru; S. A. Lermontov - Corresponding Member of RAS, Doctor of Chemistry, Professor, Head. lab. new synthetic methods, Institute of Physiologically Active Compounds (IPAC), A. V. Kanarskiy -Dr. Sci. (Tech.), Prof., Department of Food Biotechnology, KNRTU, alb46@mail.ru; L. A. Mingazova - Ph.D. Student, Department of food engineering in small enterprises, KNRTU, zleisan1@mail.ru.
