CC BY
66УДК 663.1
Г.Г. Няникова1, С.М. Комиссарчик2, М.В. Хрусталёва3
Введение
Молочная кислота (оксипропионовая, СНзСН(ОН)СООН) образуется в процессе молочнокислого брожения. Она содержится в вине и пиве, прокисшем молоке, квашеной капусте, силосе и т.д. Молочная кислота обнаружена в тканях животных и человека, в растениях и микроорганизмах.
Молочная кислота применяется в пищевой промышленности в качестве регулятора кислотности, консерванта, усилителя вкуса, структурообразователя [1]. В животноводстве и птицеводстве молочную кислоту применяют с целью снижения заболеваемости и повышения продуктивности животных и птицы. В последнее время к перспективной области применения молочной кислоты относят производство на ее основе полилактатов - био-разлагаемых заменителей традиционных пластмасс [2-4]. Молочную кислоту также используют в текстильной, кожевенной, парфюмерно-косметической и фармацевтической промышленности, в изготовлении растворителей и пластификаторов. Всё вышеперечисленное позволяет констатировать, что рыночная потребность в молочной кислоте велика.
Тем не менее, на сегодняшний день Задубров-ский завод сухого крахмала и молочной кислоты ООО «СКиМК» - единственное российское предприятие, выпускающее молочную кислоту. Дефицит молочной кислоты различные отрасли отечественной индустрии удовлетворяют за счет импорта (80 % этого продукта в Россию поступает из-за рубежа). Очевидно, что существует необходимость интенсификации действующего и строительства новых высокотехнологичных предприятий по производству молочной кислоты.
В производственных условиях молочную кислоту получают путем молочнокислого брожения, осуществляемого бактериями. К молочнокислым относят бактерии родов: Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus и Leuconostoc. Традиционно для производства молочной кислоты в промышленных масштабах применяют термофильные гомо-ферментативные лактобациллы (Lactobacillus delbrueckii),
ИССЛЕДОВАНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ RHIZOPUSORYZAE ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ И БИОСОРБЕНТА
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), 190013, Санкт-Петербург, Московский пр., д. 26
Исследованы условия биосинтеза молочной кислоты грибом Rhizopus oryzae F-814. Подобран состав питательной среды, обеспечивающий наибольший выход целевого продукта при эффективной конверсии углеродного компонента. Изучен характер роста гриба и активность ки-слотообразования на картофельных отходах. По результатам капиллярного электрофореза, выход молочной кислоты составил 95-98% от общей суммы органических кислот культуральной жидкости. Предложено использовать биомассу гриба Rhizopus oryzae для получения биосорбента.
Ключевые слова: Rhizopus oryzae, молочная кислота, биосорбент, картофельные отходы.
отличающиеся высокой активностью кислотообразования. Ферментацию лактобактерий проводят в анаэробных условиях при температуре 49-50°С. Лактобактерии довольно требовательны к питательным средам - им необходимы витамины группы В, пурины и пиримидины, определенные аминокислоты и др. [5]. Традиционная технология получения молочной кислоты включает предварительный гидролиз сырья. Данная стадия необходима вследствие отсутствия у молочнокислых бактерий необходимых гидролитических ферментов. Согласно ГОСТ 490-2006 «Кислота молочная пищевая. Технические условия», пищевая молочная кислота, продуцируемая бактериями рода Lactobacillus в результате сбраживания углеводсодержащего сырья, представляет собой смесь изомеров: D(-)- , L(+)- и DL- молочные кислоты [6]. Разработана также технология получения молочной кислоты с помощью Streptococcus ther-mophilus, однако она не нашла широкого применения.
В то же время известно, что мицелиальные грибы являются продуцентами органических кислот, ферментов и других ценных метаболитов. При этом они не требуют сложных питательных сред, устойчивы к неблагоприятным внешним воздействиям. Перспективным продуцентом молочной кислоты является гриб Rhizopus oryzae. Получаемая с помощью данного гриба молочная кислота является оптически чистой (97-99 % L(+)-формы) [7-9]. Также привлекательным является то, что состав питательных сред для культивирования R. oryzae проще и доступнее, чем для бактерий, а благодаря наличию у данного гриба амилолитических ферментов не требуется предварительного гидролиза крахмалсодержащего сырья. По сравнению с молочнокислыми бактериями Rhizopus oryzae имеет большую скорость роста на бедных азотом средах при достаточно высоком выходе молочной кислоты [10, 11].
Целью наших исследований было изучение влияния состава питательных сред и условий культивирования Rhizopus oryzae на его рост и кислотообразование для получения молочной кислоты и биосорбента.
Экспериментальная часть
1 Няникова Галина Геннадьевна, канд. биол. наук, доцент каф. технологии микробиологического синтеза, galanyan@mail.ru
2 Комиссарчик Софья Марковна, канд. хим. наук, мл. науч. сотр. каф. технологии микробиологического синтеза, sonyakom@mail.ru
3 Хрусталева Мария Викторовна, студ. каф. технологии микробиологического синтеза, mahryutka2007@yandex.ru
Дата поступления - 5 июля 2012 года
Объектом исследования был штамм Rhizopus oryzae F-814, полученный из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Согласно Сан-Пин 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», Rhizopus oryzae входит в список микроорганизмов, разрешенных к применению в пищевой промышленности.
Гриб Rhizopus oryzae относится к классу Zygomycetes, порядку Mucorales, семейству Mucoraceae. Имеет хорошо развитый несептированный мицелий, над которым возвышаются плодоносящие гифы - спорангие-носцы, несущие шарообразные спорангии, внутри которых находятся споры. Попав в благоприятные условия, споры прорастают в мицелий. Бесполое размножение мукоровых грибов может происходить также оидиями, которые образуются путем распада гифов при попадании мицелия в жидкую питательную среду с недостаточным притоком воздуха.
Рост Rhizopus oryzae и биосинтез молочной кислоты
Культивирование Rhizopus oryzae проводили в качалочных колбах вместимостью 750 мл на картофельно-глюкозной (КГС) и глюкозо-пептонной (ГПС) средах, в условиях перемешивания при температуре 28°С в течение 4-7 суток. В процессе ферментации в культуральную жидкость вносили стерильный мел для корректировки рН, поскольку значение pH снижалось по мере накопления кислот. На четвертые сутки культивирования было отмечено практически полное потребление углеводов как на глюкозно-картофельной, так и на глюкозо-пептонной питательных средах. При этом количество биомассы на КГС составило (5,1 ± 0,4) г/л, тогда как на ГПС - (3,3 ± 0,3) г/л. Скорость потребления углеводов на КГС была выше, чем на ГПС (рисунок 1).
0 12 3 4
Время культивирования, сут
Рисунок 1. Динамика накопления биомассы и потребления углеводов на картофельно-глюкозной и глюкозо-пептонной средах
В дальнейших экспериментах по мере исчерпания глюкозы в культуральную жидкость дробно вносили раствор глюкозы с тем расчетом, чтобы довести концентрацию углеводов в пересчете на глюкозу примерно до 70 г/л. Более высокая концентрация может привести к неполной утилизации сахаров и накоплению токсичных продуктов, что может негативно повлиять на рост гриба и накопление молочной кислоты. В результате дополнительного внесения глюкозы на 7-е сутки выход биомассы на КГС составил (18,1 ± 0,5) г/л, на ГПС - (11,1 ± 0,4) г/л.
Очевидно, что не только дополнительное внесение глюкозы в ходе культивирования, но и увеличение ее количества в исходной среде позволит получить больше целевого продукта. Поэтому были приготовлены среды на основе картофельных отходов с добавлением глюкозы. За основу брали картофельный отвар (фильтрованный и нефильтрованный) с различным содержанием крахмала. В качестве дополнительного источника азота использовали сульфат аммония в различных концентрациях (таблица 1).
Таблица 1. Количество биомассы и молочной кислоты на четвертые сутки культивирования ЯЬ'яорш огуїае на картофельно-глюкозной _________________________________________________________среде
Вариант среды Картофельный отвар Исходное общее содержание углеводов, г/л (NH4)2SO4, г/л Выход биомассы, % Выход молочной кислоты, %
1-П нефильтрованный 57,5±3,9 10 27,7±2,4 32,5±1,7
2-П нефильтрованный 57,5±3,8 5 21,5±1,3 38,4±2,5
3-С фильтрованный 53,5±2,8 5 14,4±1,2 46,5±3,3
4-С фильтрованный 53,5±2,7 0 7,8±0,7 62,4±4,0
Известно, что, изменяя соотношение углерода и азота в составе среды, можно влиять на выход целевого продукта. На рисунке 2 представлена динамика накопления биомассы и молочной кислоты на четырех средах, указанных в таблице 1.
0 12 3 4 5 6 7
Время культивирования, сут
Рисунок 2. Динамика накопления биомассы ЯКиориэ огугэе и молочной кислоты на различных средах
Установлено, что на нефильтрованном картофельном отваре гриб растет в виде пеллет (П), а на фильтрованном - в виде сгустка (С). При росте пеллетами обеспечивается лучший массообмен, поэтому количество биомассы в 2,0-2,5 раза больше, чем при росте сгустком. С другой стороны, установлено, что для преимущественного конвертирования углеводов в молочную кислоту необходимо создать условия для роста гриба сгустком. При этом следует учитывать не только наличие в среде твердых частичек для иммобилизации гриба, но и способ внесения посевного материала.
С целью подбора недорогого и доступного сырья для культивирования гриба Я. огухав исследовали его рост на различных картофельных отходах (кожуре, мякоти, картофельном отваре без добавления и с добавлением крахмала). Во все среды дополнительно вносили глюкозу. Культивирование проводили в условиях перемешивания при температуре 28°С в течение 3 суток. В таблице 2 представлены данные по степени конверсии углеводов (в расчете на глюкозу) на третьи сутки, когда остаточная концентрация редуцирующих сахаров составляла менее 1 г/л. Приведены минимальные и максимальные средние значения для 5 ферментаций.
Таблица 2. Рост Шпорив огугэе на картофельных отходах
Вид картофельных отходов Исходное общее содержание углеводов, г/л Характер роста: С-сгусток, П-пеллеты Коэффициент трансформации углеводов в биомассу, %
Картофельный отвар 22,7^31,6 С 7,0^10,2
П 15,2^20,5
Картофельный отвар, мякоть картофеля 42,5^61,4 С 7,2^9,9
П 17,5^20,3
Картофельный отвар, измельченные очистки картофеля 40,1^51,7 С 7,3^9,5
П 16,4^19,9
Картофельный отвар, мякоть картофеля, крахмал водорастворимый 65,3^76,5 С 7,1^9,1
П 16,1^20,6
Картофельный отвар, измельченные очистки картофеля, крахмал водорастворимый 53,0^71,8 С 5,9^9,2
П 18,1^21,0
Как и следовало ожидать, на средах с наличием взвеси гриб рос пеллетами, а на фильтрованном отваре -сгустком. Как видно из таблицы 2, несмотря на то, что кожура картофеля, мякоть и отвар отличаются по составу, при одном и том же характере роста гриба коэффициент трансформации сахаров изменялся незначительно. При выборе сырья необходимо также учитывать возможность отделения биомассы, которую нами предложено применять как основу биосорбента [12].
Схема метаболических процессов, происходящих при утилизации глюкозы грибом Rhizopus огухав, представлена на рисунке 3. При регулировании условий культивирования можно направлять метаболизм Rhizopus огухав в сторону увеличения выхода того или иного из указанных продуктов [13].
Лактат Этанол Малат —► Фу марат
Лактат Этанол Малат Фумарат Культуральная
жидкость
Рисунок 3. Метаболизм глюкозы у гриба ЯЬ '^орш огуїае [14]
Молочная кислота образуется из пирувата под действием фермента лактатдегидрогеназы. Известно, что у Rhizopus огухав есть несколько типов лактатдегидроге-наз, зависимых и не зависимых от НАД. Восстановленный НАД образуется в процессе гликолиза и частично идет в цепь дыхания, а частично - на образование молочной кислоты. Поскольку Я. огухав F-814 является промышленным продуцентом молочной кислоты, активность его лак-
татдегидрогеназ высока, и большая часть восстановленного НАД идет на образование молочной кислоты.
Нами были изучены рост гриба и накопление молочной кислоты в аэробных и анаэробных условиях. Очевидно, что для жизнедеятельности Я. огухав необходим доступ кислорода. При изменении условий аэрации (в модельных опытах это достигалось за счет различных объемов питательной среды в колбе: от 150 до 500 мл при вместимости качалочной колбы 750 мл) происходили некоторые изменения в соотношениях биомасса/молочная кислота. При увеличении доступа кислорода (снижении объема питательной среды в колбе от 500 до 150 мл при одной и той же скорости перемешивания - 220 об/мин) концентрация молочной кислоты повышалась в среднем на 13,5 ^ 18,8 %, а концентрация биомассы при этом закономерно снижалась.
В условиях без доступа кислорода рост гриба практически отсутствовал. Максимальное количество биомассы составило (0,75 ± 0,07) г/л, молочная кислота также не накапливалась. Аэрация культуральной жидкости необходима для выведения образующегося лактата. Известно, что переносчику лактата требуется энергия АТФ, в основном образующейся в аэробных условиях при окислительном фосфорилировании. В анаэробных условиях Я. огухав образует АТФ только посредством субстратного фосфорилирования, а восстановленный НАДН+ идет на накопление этилового спирта, подавляющего активность ферментов, обеспечивающих рост гриба.
Для поддержания оптимальных условий роста Я. огухае. необходима постоянная корректировка pH среды в процессе культивирования. Результаты исследования влияния pH среды на рост Я. огухав показали, что оптимальным для роста гриба является значение pH в пределах 4,5-6,0. Проведен подбор корректирующих рН реагентов, необходимых для связывания выделяющейся молочной кислоты. Для корректировки pH использовали карбонат кальция, гидроксид кальция, гидрокарбонат натрия и гидроксид натрия. Установлено, что вид нейтрализующего агента не влияет на сорбционные свойства препаратов, полученных в дальнейшем из высушенной измельченной биомассы. Для целей автоматизированного культивирования предпочтительно применять гидрокарбонат натрия (поскольку он растворяется в питательной среде, и биомасса не требует дополнительной промывки). При отсутствии возможности автоматизированной корректировки pH целесообразно применять карбонат кальция, плавно корректирующий pH при одноразовом внесении. Дополнительным преимуществом гидрокарбоната натрия является то, что карбонат-ионы подавляют образование этанола, что способствует повышению выхода молочной кислоты.
Необходимо иметь в виду, что при корректировке pH культуральной жидкости с помощью карбоната кальция необходима тщательная промывка биомассы, используемой в дальнейшем в качестве биосорбента.
Анализ культуральной жидкости
Образцы культуральной жидкости гриба Яhizopus огухае, выращенного на четырех средах (состав их приведен в таблице 1), анализировали методом капиллярного электрофореза на приборе Капель 105М. В результате было определено процентное соотношение органических кислот в анализируемых образцах (таблица 3). Содержание молочной кислоты во всех образцах имело значения в пределах 95-98 % от общей суммы органических кислот. На фильтрованном картофельном отваре, при росте гриба сгустком также была обнаружена янтарная кислота в количестве 1 % и яблочная - в количестве 0,4-0,7 %. На нефильтрованном картофельном отваре (рост гриба пел-летами) при дополнительном внесении сульфата аммония
были обнаружены также лимонная кислота и уксусная кислота.
Таблица 3. Соотношение органических кислот в образцах
Яблоч- Лимон- Молоч- Янтар- Уксус-
Среда ная ная ная ная ная
кислота кислота кислота кислота кислота
1-П 1,0 1,1 96,2 1,3 0,4
2-П 0,7 3,4 94,9 0,9 0,1
3-С 0,7 н/о 98,3 1,0 н/о
4-С 0,4 н/о 98,4 1,0 н/о
*Относительная погрешность определения не превышала 5 %
На рисунке 4 представлена электрофореграмма образца культуральной жидкости при культивировании Яhizopus огухае. на картофельно-глюкозной среде (КГС 1-П).
Рисунок 4. Электрофореграмма культуральной жидкости М/трив огупае
Таким образом, на кислотообразование Я. огухае влияет состав питательной среды, условия культивирования и характер роста продуцента.
Для выделения молочной кислоты культуральную жидкость обрабатывали Са(0^г, доводя значение рН до 8-10; затем отфильтровывали полученный лактат кальция на вакуум-фильтре. Фильтрат упаривали, охлаждали и проводили повторное отделение лактата кальция. К объединенному осадку лактата кальция добавляли ^БО* Полученную смесь фильтровали, молочную кислоту очищали активированным углем. Осветленную молочную кислоту отфильтровывали на вакуум-фильтре и упаривали на роторном испарителе до достижения концентрации 50 %.
Получение биосорбента
Изучено влияние солей аммония на рост гриба и сорбционные свойства биомассы. Культивирование проводили на нефильтрованной картофельно-глюкозной среде с добавлением глюкозы.
Показано, что внесение сульфата аммония в питательную среду в концентрации от 2,5 до 15 г/л повышает количество биомассы с 7,5 до 18,2 г/л в среднем. Установлено, что при добавлении в качестве источника азота нитрата аммония снижается скорость роста гриба. Пшеничная мука является как источником азота, так и дополнительным источником крахмала. Ее добавление целесообразно для повышения амилолитической активности культуральной жидкости. Таким образом, для культивирования Я. огухае с целью получения биомассы как основного продукта рекомендуется вносить в картофельно-глюкозную среду 10 г/л сульфата аммония, а для получения молочной кислоты добавление сульфата аммония нецелесообразно.
Сорбционные свойства биомассы незначительно изменялись при внесении дополнительных источников
азота в исследуемых концентрациях. Тем не менее, на сорбционные свойства оказывал влияние характер роста гриба. Получение биосорбента из биомассы проводили путем обработки биомассы раствором NaOH в различных концентрациях. Нерастворимый в щелочи осадок промывали водой и использовали в качестве биосорбента. Для улучшения сорбции синтетических красителей нами предложено проводить обработку полученного биосорбента 1М раствором HCl [12].
Таким образом, согласно результатам проведенных исследований, получение молочной кислоты и биосорбентов при культивировании Яhizopus огухае. рекомендуется производить по схеме, представленной на рисунке
5.
Приготовление и стерилизация питательной среды Подготовка посевного материала
Глубинное культивирование Иііігория огугае при перемешивании и аэрации
Фильтрование
У X
Фильтрат культуральной жидкости Биомасса
і 1
Выделение и очистка Выделение и очистка
Молочная кислота
Биосорбснг
Рисунок 5. Принципиальная схема получения молочной кислоты и биосорбента
Согласно данной схеме, для получения молочной кислоты и биосорбента готовили и стерилизовали питательную среду, вносили посевной материал Яhizopus огухае и проводили культивирование гриба при температуре 28°С в условиях постоянного перемешивания и аэрации.
После окончания ферментации культуральную жидкость из ферментатора подавали на барабанный вакуум-фильтр, где происходило отделение биомассы.
Выделение молочной кислоты проводили из фильтрата культуральной жидкости по традиционной схеме, включающей, как описано выше, обработку Са(0^г с получением лактата кальция, фильтрование, обработку серной кислотой, фильтрование, осветление молочной кислоты активированным углем и концентрирование.
Отделенную биомассу подавали в аппарат с мешалкой, в котором осуществляли промывку биомассы водой. Промытую на фильтре биомассу измельчали и подавали в аппарат, работающий под давлением, где проводили обработку биомассы раствором №0К
После окончания обработки нерастворимый в щелочи осадок отделяли на фильтре и промывали водой. При необходимости кислотной активации промытый осадок отделяли на фильтре и подавали в аппарат с мешалкой для обработки раствором ИС1. После обработки раствором HCl нерастворимый в кислоте остаток отделяли на фильтре и направляли в сушилку, где осуществляли сушку продукта в потоке воздуха при температуре 50°С. Высушенный продукт измельчали.
Полученный биосорбент предложено применять для селективной сорбции синтетических красителей и тяжелых металлов [12, 15].
Заключение
Таким образом, технология получения молочной кислоты с помощью гриба Яhizopus огуаае обладает рядом
преимуществ по сравнению с традиционной технологией, использующей молочнокислые бактерии, а именно:
1) получение оптически чистого продукта (только Ц+) - молочная кислота);
2) возможность использования в составе среды крахмалсодержащих отходов производств (картофельный отвар, картофельные очистки);
3) отсутствие необходимости предварительного гидролиза крахмалсодержащего сырья;
4) культивирование в мезофильных условиях;
5) возможность применения биомассы гриба в качестве биосорбента.
Таким образом, в результате проведенного исследования показано, что в подобранных условиях культивирования Rhizopus огухав возможно получать молочную кислоту и биомассу как основу биосорбента, что позволит снизить себестоимость каждого из продуктов и решить проблему утилизации фильтрата культуральной жидкости.
Работа выполнена при финансовой поддержке Комитета по науке и высшей школе Правительства Санкт-Петербурга.
Литература
1. Булдаков А.С. Пищевые добавки. Справочник. 2е изд., перераб. и доп. М.: ДеЛи принт, 2002. 436 с.
2. Евелева В.В., Кесоян Г.А. Лактаты - полифункциональ-ные пищевые добавки // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. 2003. №1. С. 38-40.
3. Плетнев М.Ю. Биополимеры как материал для экологичной упаковки // Packaging R&D. 2007. №3. С. 46-51.
4. Lu D., Yang L., Zhou T., Lei Z Synthesis, characterization and properties of biodegradable polylactic acid-p-cyclodextrin cross-linked copolymer microgels // European Polymer Journal. 2008. Vol. 44. No 7. P. 2140-2145.
5. ЕлиновН.П. Основы биотехнологии. СПб.: Наука, 1995. 600 с.
6. ГОСТ 490-2006. Кислота молочная пищевая. Технические условия. М. 2007. 31 с.
7. Zhang Zh. Yi., Jin B., Kelly J.M. Production of lactic acid from renewable materials by Rhizopus fungi // Biochemical engineering journal. 2007. No 35. P. 251-263.
8. Watanabe T., Oda Y. Comparison of sucrose-hydrolyzing enzymes produced by Rhizopus oryzae and Amylomyces rouxii // Bioscience, biotechnology, and biochemistry. 2008. Vol. 72. No 12. P. 3167-3173.
9. DongX.-Y., Bai S., Sun Y. Production of L(+)-lactic acid with Rhizopus oryzae immobilized in polyurethane foam cubes // Biotechnology letters. 1996. Vol. 18. No 2. P. 225-228.
10. Chunmei G., Yingge Y., Yonghong F., Wen L., Renrui P., Zhiming Zh., Zengliang Y. Improvement of L(+)-lactic acid production of Rhizopus oryzae by low-energy ions and analysis of its mechanism // Plasma science technologies. 2008. Vol. 10. No 1. P. 131-135.
11. Fu Y, Xu Q., Li Sh., Huang H., Chen Y. A novel multistage preculture strategy of Rhizopus oryzae ME-F12 for fu-maric acid production in a stirred-tank reactor // World journal of microbiology and biotechnology. 2009. Vol. 25. No 10. P. 1871-1876.
12. КомиссарчикС.М, Няникова Г.Г. Технология получения биосорбентов из мукоровых грибов // Естественные и технические науки. 2010. № 1. С. 357-358.
13. Wang X., Sun L., Wei D, Wang R. Reducing by-product formation in L-lactic acid fermentation by Rhizopus oryzae // Journal of industrial microbiology and biotechnology. 2005. Vol. 32. No 1. P. 38-40.
14. Longacre A., Reimers J.M., Gannon J.E, Wright B.E. Flux analysis of glucose metabolism in Rhizopus oryzae for the purpose of increasing lactate yields // Fungal genetics and biology. 1997. Vol. 21. No 1. P. 30-39.
15. Способ определения синтетических красителей в ал-
когольсодержащих напитках: пат. 2324179 Рос. Федерация. № 2006134948/13; заявл. 04.10.2006; опубл.
10.05.1008. Бюл. №13. 5 с.
