CC BY
21
10. Лысенок Л.Н. Клеточные аспекты замещения дефектов костной ткани стеклокристаллическими материалами // Клиническая имплантология и стоматология. 2001. № 3-4. С. 109-111. [Lysenok L.N. Cellular Aspects of Substitution of Bone Defects with Glass Crystal Materials. Clinical Implantology and Dentistry. 2001;3-4:109-111. (in Russ.).]
11. Павленко А. В., Горбань С.А., Илык Р.Р., Dr. Shterenberg A. Остеопластические материалы в стоматологии: прошлое, настоящее, будущее // Дента Блщ. 2008. № 5 (26). С. 17-23. [Pavlenko A. V., Gorban S.A., Ilik R. R., Dr. Shterenberg A. Osteoplastic materials in dentistry: past, present, future. Denta Blits. 2008;5 (26):17-23. (in Russ.).]
12. Чумакова Ю.Г. Патогенетическое обоснование методов комплексного лечения генерализованного паро-донтита: автореф. дис... д-ра мед. наук. Одесса, 2008. 37 с. [Chumakova Yu.G. Patogeneticheskoe obosnovanie metodov kompleksnogo lecheniya generalizovannogo parodontita [dissertation]. Odessa, 2008. 37 p. (in Russ.).]
13. Гизатуллин Р. А. Средства для оптимизации остеогенеза в стоматологии: область примене-
УДК 616.314.17-008.1:612.112.3
ния, актуальность проблемы и перспективы разработок и внедрения новых препаратов. М., 2007. 115 с. [Gizatullin R.A. Sredstva dlya optimizatsii osteogeneza v stomatologii: oblast' primeneniya, aktual'nost' problemy i perspektivy razrabotok i vnedreniya novyh preparatov. Moscow, 2007. 115 р. (in Russ.).]
14. Giampietro P.F., Peterson M., Schneider R., Davis J. G., Raggio C., Myers E., Burke S., Boachie-Adjei O., Mueller C.M. Osteoporos. Int. 2003;14(7):559-563.
15. Поворознюк В. В., Мазур И. П. Костная система и заболевания пародонта. К., 2003. 446 с. [Povoroznyuk V. V., Mazur I. P. Kostnaya sistema i zabolevaniya parodonta. K., 2003. 446 p. (in Russ.).]
16. Размыслов А. В., Минкин А. У. Использование аутогенного костного трансплантата при увеличении альвеолярного гребня перед имплантацией. // Пародонтология. 2010. № 3(56). С. 54 - 58. [Razmyslov A. V., Minkin A. U. Use of an autologous bone graft with an increase in the alveolar ridge before implantation. Periodontology. 2010;3 (56):54-58. (in Russ.).]
ВЛИЯНИЕ РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ МАКРОФАГОВ НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ТКАНЕЙ ПАРОДОНТА У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ПАРОДОНТИТОМ
'Юсупова Ю. И., 'Румянцев В. А., 2Шиманский Ш.Л., 'Егорова Е.Н., 'Будашова Е. И.
'ФГБОУ ВО Тверской государственный медицинский университет Минздрава России, г. Тверь, Россия (170100, Тверь, ул. Советская, 4), e-mail: [email protected]
2ФГБОУ ВО Московский государственный медико-стоматологический университет им. А. И. Евдокимова Минздрава России, г. Москва, Россия (127473, Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр.1), e-mail: [email protected]
Целью исследования явилась оценка влияния репрограммирования макрофагов у больных хроническим генерализованным пародонтитом средней степени тяжести на морфофункциональные изменения в тканях пародонта.
Контролируемое гистологическое и иммуноферментное исследование было выполнено у 56 пациентов в возрасте от 35 до 44 лет. При этом у 44 из них проводили курс репрограммирования макрофагов (основная группа), а у 12 - традиционное показанное в каждом случае консервативное пародонтологическое лечение (группа сравнения). Образцы биопсии тканей пародонта, а также венозной крови и смешанной слюны были взяты в начале и через 30 дней использования клинического метода репрограммирования макрофагов in vivo.
В конце исследования не было выявлено гистологически изменений со стороны эпителия и признаков воспаления, отмечено полное созревание соединительной ткани. При хроническом пародонтите функциональная активность нейтрофилов увеличена. Наблюдается увеличение концентрации нейтрофиль-ной эластазы в ротовой жидкости, но не в крови. В дальнейшем этот показатель уменьшался в отличие от традиционного консервативного лечения. Это говорит о нормализации под воздействием аутологич-ной сыворотки локального клеточного иммунитета в тканях пародонта и восстановлении их структуры. По-видимому, это происходит под влиянием репрограммирования макрофагов из фенотипа М1 в фенотип М2, снижения продукции провоспалительных цитокинов.
Ключевые слова: хронический пародонтит, репрограммирование макрофагов, активность нейтрофилов.
INFLUENCE OF MACROPHAGE REPROGRAMMING ON MORPHOLOGICAL AND FUNCTIONAL CHANGES IN THE PERIODONTAL TISSUE IN CHRONIC PERIODONTITIS
'Yusupova Yu.I., 'Rumyantsev V. A., 2Shimansky Sh.L., 'Egorova E.N., 'Budashova E.I.
'Tver State Medical University, Tver, Russia (170100, Tver, Sovetskaya Street, 4), e-mail: [email protected] 2Moscow State University of Medicine and Dentistry by A. I. Evdokimov, Moscow, Russia (127473, Moscow, Delegatskaya Street, 20, building 1), e-mail: [email protected]
The aim of the study was to assess the influence of macrophage reprogramming in patients with chronic generalized periodontitis (moderate severity) on morphological and functional changes in periodontal tissues.
Controlled histological and immuno-enzyme test was performed in 56 patients aged 35-44 y.o. At the same time, 44 of them underwent a course of macrophage reprogramming (the main group), and 12 of them underwent the standard conservative periodontal treatment indicated in each case (the comparison group). Biopsy samples of periodontal tissue, as well as venous blood and mixed saliva were taken for analysis at the beginning and after 30 days of using the clinical method of reprogramming of macrophages in vivo.
At the end of the study, no histological changes were detected on the part of the epithelium and no signs of inflammation, complete maturation of the connective tissue was noted. In chronic periodontitis, the functional activity of neutrophils is increased. There is an increase in the concentration of neutrophilic elastase in the oral fluid, but not in the blood. Later on this figure decreased in contrast to traditional conservative treatment. This suggests normalization under the influence of autologous serum of local cellular immunity in periodontal tissues and restoration of their structure. Apparently, this happens under the influence of macrophage reprogramming (M1 to M2 phenotype) reducing the production of pro-inflammatory cytokines.
Key words: chronic periodontitis, macrophage reprogramming, the activity of neutrophils.
Введение
Важная роль в патогенезе хронического генерализованного пародонтита (ХГП), как и любых других воспалительных заболеваний, принадлежит клеточным механизмам защиты. Это прежде всего фагоцитирующие клетки - макрофаги и нейтрофилы. Их активностью, главным образом, определяются интенсивность и характер воспалительного процесса в тканях пародонта [1, 2]. В последние годы сформировалось представление о способности макрофагов проявлять как про-, так и противовоспалительную активность [3]. Выделяют два полярных типа активированных макрофагов: М1 и М2. Классически в очаге воспаления под воздействием провоспалитель-ных факторов формируется фенотип М1 [4]. Такие макрофаги поддерживают Thl-зависимый иммунный ответ. Открыта и альтернативная активация макрофагов в фенотип М2 под влиянием IL-ip, IL-4, IL-10, IL-13 и иммунных комплексов. Макрофаги фенотипа М2 поддерживают ThZ-зависимый иммунный ответ, подавляя воспалительную реакцию и способствуя восстановлению ткани [5, 6].
Значимыми маркерами воспаления тканей пародонта при тяжелой степени пародонтита являются нейтрофилы. Однако представляется очевидным, что нейтрофилы - клеточные факторы врожденного иммунитета - не могут не реагировать при менее выраженной воспалительной реакции. Оценка их функционального состояния в ротовой жидкости (РЖ) и кровеносном русле может оказаться информативным тестом для определения эффективности проводимого лечения и прогнозирования течения пародонтита.
В пародонтологии не так давно, но используется и становится популярной методика плазмолифтин-га, в которой используется обогащенная тромбоцитами аутоплазма крови с целью стимуляции в тканях пародонта репаративных процессов. Она заключается в получении с помощью специального протокола центрифугирования в пробирках, содержащих антикоагулянт, аутоплазмы крови - биологического стимулятора регенерации, содержащего факторы роста, гормоны, белки и витамины в естественной комбинации.
Клиническая методика репрограммирования макрофагов in vivo существенно отличается от метода плазмолифтинга. Она апробирована и усовершенствована Ш.Л. Шиманским и Е.И. Будашовой [1, 4, 7]. Венозная кровь при этом забирается в вакуумные пробирки без антикоагулянта, что позволяет получить не плазму, а сыворотку. Разработан специальный двухэтапный алгоритм центрифугирования с «мягким стартом» для деликатного отделения клеточных
элементов крови. В сыворотке после центрифугирования остаются только низкомолекулярные факторы активации макрофагов фенотипа М2 (IL-4, IL-10, IL-13, TGF-P, CSF-1). Их низкая концентрация в составе сыворотки способствует достаточно быстрому репрограммированию макрофагов тканей пародонта в фенотип М2. Именно этот эффект мы попытались использовать в ходе исследования. Такое воздействие на клеточный иммунитет тканей пародонта должно приводить к снижению воспалительной реакции. На этом фоне можно ожидать положительных изменений в морфофункциональном состоянии тканей па-родонта.
Целью исследования явилась оценка влияния метода репрограммирования макрофагов у больных ХГП средней степени тяжести на морфофункцио-нальные изменения в тканях пародонта.
Материал и методы
В исследовании участвовали 56 больных ХГП средней степени тяжести (24 мужчины и 32 женщины в возрасте от 35 до 44 лет - средняя возрастная группа ВОЗ). При этом у 44 из них проводили курс репрограммирования макрофагов (основная группа), а у 12 - традиционное показанное в каждом случае консервативное пародонтологическое лечение (группа сравнения). Последнее включало в себя периодическую ирригацию пародонтальных карманов растворами антисептиков и использование лечебных повязок. Диагноз больным ставили на основании клинического (рис. 1), включая применение компьютерной системы «Florida probe», и рентгенологического (ортопантомограмма) обследований.
Первичное обследование проводили до начала комплексного пародонтологического лечения. У больных основной группы в стерильные вакуумные пробирки забирали по 7-10 мл венозной крови, специальным образом получали обедненную клетками аутосыворотку (двукратное центрифугирование с «мягким стартом» при скорости 3000 об./мин.). Подготовленную сыворотку набирали в шприц и вводили ее подслизисто в области переходной складки по 1 мл на уровне всех премоляров слева и справа. Инъекции проводили троекратно с интервалом 7-10 суток. Другого лечения в этой группе не осуществляли.
Венозную кровь и смешанную слюну у больных основной группы, а также биопсийные образцы тканей пародонта у больных обеих групп забирали в начале исследования и спустя 30 суток от начала лечения. При этом биопсийные образцы до лечения забирали в области премоляров справа, а после лечения - слева.
<Щ кш
Рис. 1. Состояние тканей пародонтау больных хроническим генерализованным пародонтитом средней степени тяжести в основной группе (А - больной К.А.Н., 40 лет) и группе сравнения (Б - больной С.В.Я., 36 лет)
В исследовании участвовали 36 биоптатов, забранных у больных, соответственно по 18 до и после лечения. Морфологический материал был разделен на три группы:
1. Материал от больных обеих групп до лечения.
2. Материал от больных основной группы после курса аутосеротерапии.
3. Материал от больных группы сравнения после традиционного лечения.
Иссекали биоптаты многослойного плоского не-орошвевающего эпителия десны с подлежащими тканями. После этого их фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина (рН=7,2), затем проводили в изоприловом спирте с добавлением «IsoPrep» и заливали в гомогенизированную парафиновую среду HISTOMIX, формируя блоки. Из парафиновых блоков изготавливали гистологические препараты толщиной 5-6 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином. Кроме этой методики применяли гистохимическую окраску по Вейгерт-Ван-Гизону. Микроскопическое исследование, фоторегистрацию и морфометрические исследования проводили с применением исследовательского тринокулярного микроскопа «Nikon Eclipse 50i», специализированной цифровой фотокамеры «Nikon DS-Fi2», персонального компьютера с операционной системой Windows 7, специализированных морфометрических программ NIS-Elements и Bio Vision Professional. При этом определяли плотность воспалительного инфильтрата (путем подсчета количества клеток в гистологических препаратах в 10 полях зрения при увеличении микроскопа х400), состав клеточного инфильтрата с каждого микропрепарата с подсчетом нейтрофильных лейкоцитов, лимфоцитов, фибробластов, фиброцитов, плазматических клеток и макрофагов (в %) в 10 полях зрения при увеличении микроскопа х40 - х400. При изучении микроскопических препаратов оценивали динамику изменений воспалительной реакции и особенности регенерации тканей.
В крови и РЖ определяли количество эластазы нейтрофилов методом иммуноферментного анализа с применением тест-системы производства «Bender MedSystems GmbH» (Австрия), в крови микроскопически оценивали результаты иммуноцитохимиче-ского теста с нитросиним тетразолием (НСТ-тест): % формазан-позитивных клеток (НСТ+) и индекс активации нейтрофилов (ИАН) в спонтанном и индуцированном тестах. Для оценки референтных значений показателя провели дополнительное обследова-
ние 10 практически здоровых добровольцев того же возрастного диапазона, не имеющих признаков воспаления в тканях пародонта.
Статистическую обработку результатов провели с применением критерия \ Стьюдента. Рассчитывали средние значения показателей и среднеква-дратическое отклонение (М±т). Все исследования реализованы на кафедре пародонтологии, одобрены Этическим комитетом ТГМУ
Результаты и их обсуждение
Морфологические изменения в тканях пародонта.
До лечения в многослойном плоском неорого-вевающем эпителии наблюдали акантоз и паракера-тоз. В ряде наблюдений отмечали истинные эрозивные дефекты с тканевым детритом на поверхности. В подлежащей соединительной строме наблюдали выраженную воспалительную инфильтрацию, выявляли отек, полнокровные сосуды и очаговые кровоизлияния. Плотность клеточного инфильтрата составляла 483±12,4 клетки в поле зрения (нейтрофильные лейкоциты - 37,7±1,61%, лимфоциты - 41,1±1,22%, плазматические клетки - 11,7±0,84%, фибробласты -8,1±0,31% и макрофаги - 1,4±0,40%). Процентное соотношение макрофагов М1/М2 по морфологическим признакам составило 36,2% к 63,8%.
После проведенного лечения методом репро-граммирования макрофагов (основная группа) патологических изменений в многослойном плоском неороговевающем эпителии не выявляли. В подлежащей строме воспалительная инфильтрация не наблюдалась. При окраске по Вейгерт-Ван-Гизону выявлялись зрелые коллагеновые волокна и фиброциты. На рисунке 2 приведены примеры результатов микроскопического исследования препаратов тканей паро-донта до и после проведения лечения этим методом.
Плотность клеточного инфильтрата составляла 85±2,7 клетки в поле зрения (нейтрофильные лейкоциты - 3,7±0,91%, лимфоциты - 25,9±1,13%, плазматические клетки - 1,5±0,30%, фибробласты -12,9±1,07%, фиброциты - 49,4±1,96%, макрофаги -6,6±0,44%). Процентное соотношение макрофагов М1/М2 составило 17,7% к 82,3%.
После лечения традиционным методом в стро-ме под многослойным плоским неороговевающим эпителием выявляли полнокровные сосуды и гиперкератоз эпителия, а также липоматоз в подлежащей строме. В ряде случаев наблюдали замедление со-
зревания соединительной ткани, в строме отмечали только формирование грануляционной ткани с умеренной воспалительной реакцией и выраженной ва-скуляризацией (рис. 3).
Статистический анализ полученных цифровых результатов показал наличие значимых различий между показателями до и после лечения во всех случаях (р<0,0001).
Изменения функционального состояния ней-трофилов.
В крови концентрация эластазы нейтрофилов до лечения у больных хроническим пародонтитом в среднем составила 38,9±7,31 нг/мл и практически не отличалась от значений у здоровых добровольцев -35,1±11,15 нг/мл (р>0,05). При этом в РЖ концентрация эластазы нейтрофилов у них была достоверно повышена в среднем до 466,2±58,42 нг/мл по сравнению с таковыми показателями у лиц без патологии пародонта: 223,4+82,44 нг/мл (р<0,02).
Проведенное лечение методом репрограммиро-вания макрофагов выявило достоверное снижение концентрации эластазы нейтрофилов РЖ до 245,6±91,83 нг/мл (р<0,05), то есть данные показатели практически достигли значений, характерных для здоровых лиц. Показатели спонтанного НСТ-теста до лечения
были достоверно выше референтных значений, а после проведенного курса лечения снизились: % НСТ + клеток в среднем с 17,0±1,42% до 13,2±1,00% (р<0,04) и ИАН с 0,18±0,022 ед. до 0,12±0,014 ед. (р<0,03). Показатели индуцированного НСТ-теста: % НСТ + клеток и ИАН до лечения соответствовали референтным значениям и после проведенного лечения достоверно не изменились (НСТ + 61,6±2,73% и 60,2±2,33%, р>0,05; ИАН с 0,72±0,040 ед. и 0,74±0,033 ед., соответственно, р>0,05).
В группе сравнения, где использовали традиционное лечение, также наблюдали снижение показателей концентрации эластазы нейтрофилов РЖ до 401,3±69,45 нг/мл, но не достоверное статистически (р>0,05). % НСТ + клеток у них в среднем уменьшился с 17,5±1,72% до 15,6±1,22% (р>0,05) и ИАН с 0,18±0,061 ед. до 0,14±0,034 ед. (р>0,05). Показатели индуцированного НСТ-теста также достоверно не изменились.
Выводы
После проведенного лечения пародонтита методом репрограммирования макрофагов гистологически наблюдаются отсутствие изменений со стороны эпителия, стихание воспалительной реакции, полное
Рис. 2. Гистопрепараты тканей пародонта до (А, ув.^400) и после (Б, ув.^40) проведения курса репрограммирования макрофагов у больного К.А. Н. 38 лет с хроническим генерализованным пародонтитом
средней степени тяжести (гематоксилин-эозин)
Рис. 3. Гистопрепараты тканей пародонта до (А, ув.х40) и после (Б, ув.^40) проведения традиционного консервативного пародонтологического лечения у больной Г.М. А. 44 лет с хроническим генерализованным пародонтитом средней степени тяжести (гематоксилин-эозин)
созревание соединительной ткани с формированием полноценного соединительнотканного матрикса в подлежащей строме. При развитии хронического па-родонтита функциональное состояние нейтрофилов повышается, что может быть выявлено с помощью определения показателей спонтанного НСТ-теста в крови. При этом наблюдается достоверное нарастание концентрации эластазы нейтрофилов в РЖ, но не в крови. Функциональная активность нейтрофилов в РЖ под влиянием курса лечения новым методом снижается в отличие от традиционного консервативного лечения, что подтверждается достоверным уменьшением концентрации эластазы нейтрофилов. Эта находка говорит о нормализации под влиянием аутологичной обедненной клетками сыворотки крови местного клеточного иммунитета в полости рта и о том, что эта методика способна снижать воспалительную реакцию пародонта и восстанавливать его структуру. Это происходит под влиянием репро-граммирования тканевых макрофагов пародонта из фенотипа М1 в фенотип М2, уменьшения продукции провоспалительных цитокинов.
Таким образом, метод репрограммирования макрофагов положительно влияет на структуру и функцию тканей пародонта и потому может являться эффективным дополнением к комплексному па-родонтологическому лечению больных хроническим генерализованным пародонтитом.
Литература/References
1. Будашова Е. И., Румянцев В. А., Федотова Т. А., Се-рик Д. В. Аутосеротерапия в лечении больных хроническим пародонтитом // Материалы республиканской конференции стоматологов «Актуальные вопросы стоматологии», Уфа. -2016. - С. 196-198. [Budashova E.I., Rumyantsev V.A., Fedotova T. A., Seric D. V. Auto-serotherapy in the treatment of patients with chronic periodontitis. Materials of the Republican conference of dentists «Actual problems of dentistry». Ufa. 2016:196-198. (In Russ.).]
2. Малышева Е.В. Репрограммирование клеточных ответов макрофагов: новая стратегия управления воспалительным процессом: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Moscow. 2007. 175 с. [Malysheva E. V. Reprogramming of cellular responses of macrophages: a new strategy for control of inflammatory process [dissertation]. Moscow. 2007. 175 p. (In Russ.).]
3. Лямина С. В., Круглов С. В., Калиш С. В., Малышев И. Ю. Репрограммирование альвеолярных макрофагов - новая возможность управления иммунным ответом // Вестник ВолГМУ, 2011. № 4 (40). С. 42-46. [Lyamina S. V., Kruglov S. V., Kulish S. V., Malyshev I. Y. Reprogramming of alveolar macrophages - a new possibility to control the immune response. Bulletin of VolGMU, 2011;4 (40):42-46. (In Russ.).]
4. Шиманский Ш. Л., Чиликин В. Н., Малышев И.Ю., Суворова И. А., Румянцев В. А., Денис А. Г. Фагоцитарная защита пародонта и способы ее активации (обзор литературы) // Стоматология. 2013. № 5. С. 60-65. [Shimansky Sh.L., Chilikin V.N., Malyshev I. Yu., Suvorova I.A., Rumyantsev V.A., Denis A. G. Phagocytic protection of periodontal and ways of its activation (literature review). Stomatology. 2013;5:60-65. (In Russ.).]
5. Будашова Е. И., Юсупова Ю.И., Шиманский Ш. Л., Румянцев В. А. Аутосеротерапия при лечении больных хроническим пародонтитом: клиническая и иммунологическая эффективность // Инновационные технологии в медицине: взгляд молодого специалиста. Материалы III Всероссийской научной конференции молодых специалистов, аспирантов, ординаторов. ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России. - Рязань: ООП УИТТиОП, 2017. 189 с. [Budashova E. I., Yusupova Yu.I., Shymanski S. L., Rumyantsev V.A. Autoserotherapy in the treatment of patients with chronic periodontitis: clinical and immunological efficiency. Innovative technologies in medicine: opinion of the young specialist: materials of the III All-Russian scientific conference of young professionals, graduate students, interns. RyazGMU of the Ministry of health of Russia. 2017. 189 p. (In Russ.).]
6. Шишкина В. С. Роль про- и антивоспалительных макрофагов М1 и М2 в развитии атеросклеротического поражения: автореф. дис ... канд. биол. наук. М.: 2014. 22 с. [Shishkina V. S. The role of pro- and anti-inflammatory macrophages M1 and M2 in the development of atherosclerotic lesions [dissertation]. Moscow. 2014. 22 p. (In Russ.).]
7. Шиманский Ш.Л., Суворова И.А., Чиликин В.Н., Малышев И. Ю., Румянцев В. А. Роль фенотипа и пластичности макрофагов в развитии воспалительной реакции при экспериментальном гингивите у мышей разных генетических линий // Dental Forum, 2015. № 1 (56). С. 21-24. [Shimansky Sh.L., Suvorova I.A., Chilikin V.N., Malyshev I.Yu., Rumyantsev V. A. The role of phenotype and plasticity of macrophages in the development of inflammatory reaction in experimental gingivitis in mice of different genetic lines. Dental Forum. 2015;1 (56):21-24. (In Russ.).]
