CC BY
18© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
ЕЛ.Хромова, Э.А.Ахматова, С.А.Сходова, ИА.Семочкин, В.Г.Хоменков, Н.К.Ахматова, М.П.Костинов ,
ВЛИЯНИЕ ПРОТИВОГРИППОЗНЫХ ВАКЦИН НА СУБПОПУЛЯЦИИ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК КРОВИ
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва
Цель. Исследование влияния сплит-вакцины Ваксигрип, субъединичной Инфлювак и иммуноадъювантной вакцины Гриппол плюс на содержание в крови миелоидных (mDC) и плазмацитоидных (pDC) дендритных клеток (ДК) у вакцинированных здоровыхженщин. Материалы и методы. Исследовали кровь 30 здоровых женщин 18 — 50 лет через 7 и 30 дней после вакцинации. Проводили иммунофенотипирование pDC (CD14+CD16-/ CD85k(ILT3)-PE/CD123-PC5) и mDC (CD14+CD16-/CD85k(ILT3)-PE/CD33-PC5) с использованием МКАТ (Beckman Coulter, Франция) на проточном цитометре Cytomix FC-500 (Beckman Coulter, США). Результаты. Использование безадьювантных вакцин Ваксигрип и Инфлювак приводило к повышению численности mDC и pDC (р<0,05) в крови вакцинированных только на 7 сутки наблюдения. Гриппол плюс приводил к более существенному (в 2,2 — 3,6 раза, р<0,05) увеличению субпопуляций ДК (по сравнению сбезадью-вантными вакцинами) как на 7 сутки, так и через месяц после вакцинации. Заключение. Вакцинация гриппозными вакцинами активирует врожденные эффекторы — первое звено на пути проникновения инфекции — дендритные клетки как миелоидного, так и лимфоидного происхождения. При этом более выраженный и продолжительный эффект такой активации наблюдается при использовании иммуноадъювантной вакцины по сравнению с субъединичной и сплит.-вакцинами.
Журн. микробиол., 2016, № 5, С. 23—28
Ключевые слова: гриппозные иммуноадъювантная и безадъювантная вакцины, миелоид-ные и плазмацитоидные дендритные клетки
E.A.Chromova, Е.A.Akhmatova, S.A.Skhodova, I.A.Semochkin, V.G.Khomenkov, N.K.Akhmatova, M.P.Kostinov
EFFECT OF INFLUENZA VACCINES ON SUBPOPULATIONS OF BLOOD DENDRITIC CELLS
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia
Aim. Study the effect of\^xigrip split, Influvac subunit and Grippol plus immune-adjuvanted vaccines on the content of myeloid (mDC) and plasmacytoid (pDC) dendritic cells (DC) in blood ofvaccinated healthy women. Materials and methods. Blood of 30 healthy women aged 18-50 years was studied at days 7 and 30 after the vaccination. pDC (CD14+CD16-/CD85k(ILT3)-PE/ CD123-PC5) and mDC (CD14+CD16-/CD85k(ILT3)-PE/CD33-PC5) immune phenotyping was carried out using mAbs (Beckman Coulter, France) and flow cytometer Cytomix FC-500 (Beckman Coulter, USA). Results. Use of unadjuvanted vaccines \&xigrip and Influvac resulted in an increase of the numbers of mDC and pDC (p<0.05) in blood of the vaccinated only at day 7 of the observation. Grippol resulted in a more significant (2.2 — 3.6 times, p<0.05) increase of DC subpopulations (compared with unadjuvanted vaccines) at both day 7 and a month after the vaccination. Conclusion. Influenza vaccination activated innate effectors — the first component on the way of infection penetration — dendritic cells of both myeloid and lymphoid origin. Wherein, a more pronounced and prolonged effect of such activation is observed when immune-adjuvanted vaccine is used compared with subunit and split vaccines.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2016, No. 5, P. 23-28
Key words: influenza immune-adjuvanted and unadjuvanted vaccines, myeloid and plasmacytoid dendritic cells
ВВЕДЕНИЕ
Несмотря на то, что вакцинация от гриппа считается наиболее эффективным методом профилактики, использование субъединичных или расщепленных вакцин, особенно среди лиц пожилого возраста, может оказаться не вполне эффективным [8]. Для этой возрастной группы рекомендуется инак-тивированная вакцина против гриппа, которая содержит вирусный гемагглю-тинин (НА), белки трех или четырех циркулирующих штаммов гриппа H1N1, H3N2 и штамма В. Низкая эффективность гриппозной вакцины у пожилых по сравнению с молодыми была связана с иммунологическим старением [2], таким как нарушение генерации клеток, секретирующих антитела (ASCs) [8], Т-клеток памяти CD8 + [13] и CD4 + Т-клеток [5]. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе сниженной эффективности вакцины, остаются не исследованными.
Особенно это касается использования в составе вакцин адъювантов. Адъюванты обычно повышают иммуногенность совместно вводимых антигенов, но к сожалению, также мало известно о механизмах их действия. Поэтому в данной работе мы попытались выяснить влияние сплит-вакцины Ваксигрип, субъединичной Инфлювак и иммуноадъювантной вакцины Гриппол плюс на содержание в крови дендритных клеток миелоидного и плаз-мацитоидного происхождения у иммунизированных лиц.
Дендритные клетки (ДК) являются специализированными антиген-представляющими клетками (АРС), которые играют ключевую роль в иммунном ответе, являясь связующим звеном между врожденным и адаптивным иммунитетом [15]. Они созревают при распознавании патогенов и сверхрегу-лируют экспрессию МНС молекул и костимулирующих рецепторов для активации антиген-специфических CD4 (+) и CD8 (+) Т-клеток. В настоящее время установлено, что ДК являются неоднородной популяцией, состоящей из различных субпопуляций со специализированными функциями в иммунном ответе на конкретные патогены. При вирусных инфекциях, плазмацито-идные ДК (pDCs) быстро продуцируют большое количество IFN-a, который обладает мощным противовирусным эффектом и активирует несколько типов других иммунных клеток. Но, тем не менеее, pDCs могут индуцировать толе-рогенный цитокин IL-10 CD4 (+) Т-клетками. В противоположность им, миелоидные Д К (mDCs) являются очень мощными АРС и обладают уникальной способностью праймировать наивные Т-клетки и, следовательно, инициировать первичный адаптивный иммунный ответ. Были определены различные субпопуляции mDCs со специализированными функциями. Установлено, что CD8a (+) mDCs захватывают антигенный материал от некротических клеток, секретируют высокий уровень IL-12, а также праймиру-ют Thl и цитотоксические Т-клетки для контроля за внутриклеточными патогенами. С другой стороны, CD8a (-) mDCs преимущественно праймируют CD4 (+) Т-клетки и способствуют Th2 или Thl7 дифференциации. BDCA-3 (+) mDC2 являются человеческим гомологом CD8a (+) mDCs, так как они разделяют экспрессию нескольких ключевых молекул, способность к кросс-презентации антигенов CD8 (+) Т-клеткам и продуцируют IFN-X, [3]. Показано, что pDCs могут координировать события при вирусной инфекции, атопии, аутоиммунных заболеваниях и раке [9].
Цель статьи — определение субпопуляций дендритных клеток в крови женщин, иммунизированных адъювантной и безадъювантными вацинами против гриппа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследовании принимали участие 30 здоровых женщин 18 — 50 лет, которых иммунизировали адьювантной (Гриппол плюс) и безадъювантными (Ваксигрип и Инфлювак) вакцинами против гриппа. Исследовали кровь через 7 и 30 дней после вакцинации.
Забор крови у женщин осуществляли строго натощак из локтевой вены обследуемых в стерильных условиях. Исследовали кровь с раствором антикоагулянта — динатриевой соли ЭДТА (Serva) в конечной концентрации 0,26%. Кровь инкубировали с МкАТкплазмацитоидным (CD14+CD16-/CD85k(ILT3)-PE/CD123-РС5) и миелоидным (CD 14+ CD16-/CD85k(ILT3)-PE/CD33-PC5) ДК. Все процедуры по иммунофенотипированию ДК проводили согласно и" --рукции производителя (Beckman Coulter, Франция). Пробы анализировали на проточном Cytomix FC-500 (Beckman Culter, США) в течение 6 часов после иммунного окрашивания. Гейт (окно) популяции клеток устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. Сначала гейтировали область всех лейкоцитов (РВМС), затем выстраивали значения всех гейтированных событий так, чтобы FL4 (CD123-PC5) отображалось против SS. Лейкоциты гейтировали регионом А, а регионом В отсекали все С0123-негативные клетки. События по FL1 (CD14+CD16)-FITC) располагали против FL2 (ILT3-PE). Выделяли регион С с CD(14+16)-/ ILT3 + клетками. Визуально эозинофилы отображались в правом нижнем углу области С. После чего события гейтировали по регионам А и В и С: FL4 (CD 123-РС5) располагали против FL2 (ILT3-PE). Регион D ограничивал CD123bright/ ILT3bright события. Процент ДК среди РВМС рассчитывался путем деления числа событий в гейте D на число событий в гейте РВМС.
Статистическая значимость различий'уровня ДК между группами оценивали непараметрическии методами исследования с помощью критерия Манна—Уитни. Статистически достоверными считали различия при Р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Как видно из табл., содержание плазмацитоидных ДК (pDC) в группе лиц, вакцинированных Ваксигрипом, на 7 сутки (0,712%) повышалось по сравнению с группой до вакцинации (0,381%) в 1,87 раза, миелоидных дендритных клеток (mDC) (1,366%) в 2,96 раза, р<0,05, соответственно повышались их абсолютные показатели с 8,51 до 9,16 кл/мл (pDC) и с 10,23 до 12,94 кл/мл (mDC). Через месяц после вакцинации все эти показатели практически возвращались к уровню нормальных.
Инфлювак по механизму действия мало отличался от Ваксигрипа, но все же проявлял тенденцию к меньшему нарастанию численности как pDC, так и mDC по сравнению с последним.
Вакцинация Грипполом плюс более существенно (р<0,001) по сравнению с исследуемыми безадъювантными вакцинами повышала уровень ДК в крови. Через 7 дней уровень pDC достигал 1,61%/16,16 кл/мл в группе с Грипполом (больше уровня в группе с Ваксигрипом в 2,26/1,76 раза, в группе с Инфлюваком в 3,12/1,83 раза), а через месяц — 1,414%/15,76 кл/мл (больше уровня в группе с Ваксигрипом в 3,52/1,79 раза, в группе с Инфлюваком в 3,58/1,85 раза).
Уровень mDC у вакцинированных Грипполом плюс также был выше по сравнению с группой с Ваксигрипом и Инфлюваком. Через 7 дней: соответственно выше в 1,68/1,5 раза (2,3%/19,38 кл/мл) и 3,95/1,55 раза (0,582%/
12,48 кл/мл); через 1 мес. — 2,89/1,7 раза (1,734%/18,74 кл/мл) и в 3,67/1,77 раза (0,472%/10,6 кл/мл).
ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что продуктивный иммунный ответ определяется клональ-ной экспансией антиген-специфических Т- и/или В-клеток. Этот процесс изначально требует представления антигена наивным Т-клеткам с участием ТСИб или В-клеткам, экс-прессирующих иммуноглобулиновые рецепторы. Но кроме этих условий для формирования полноценного адаптивного ответа небходимы еще и другие сигналы: доставка костиму-ляторных молекул или цитокинов антигенпрезентирующими клетками для праймирования Т-хелперов. Эти процессы запускают антиген-специфическую помощь для В-клеток и цито-токсических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) [15].
Все эти факторы должны учитываться при конструировании вакщш. В настоящее время для профилактики гриппозной инфекции используют как адъювантные, так и безадъювант-ные вакцины. В отсутствие адъюванта может возникнуть слабый иммунный ответ, и наивные антиген-специфические Т-клетки при распознавании антигена могут стать толероген-ными.
Как видно из наших исследований, использование сплит-вакцины Вакси-грип приводило к повышению численности Д К (р<0,05) в крови вакцинированных (с небольшим перевесом в сторону клеток миелоидного происхождения) только на 7 сутки наблюдения. Через месяц эти показатели уже не отличались от исходного уровня. Аналогичная картина наблюдалась и в отношении субъединичной вакцины Инфлювак. Ее активность даже была несколько ниже Ваксигрипа, что, вероятно, можно объяснить содержанием в сплит-вакцине более широкого набора вирионных белков.
& в
В
я Я
в с
X &
а в
о. в в
I
I г
о
ч а
3-1
о оо
ЙО
оч >.
г- ^ чо о
оо —
оо 2
-ч V
Я. о о +1
о с
т . о
2-Х
О "Л
+|чо «е
о I-о
+1
ОО О
£ гл «л
+'3 1Г) оо О м -Н о
гч Д г- о
осГ^ 2 2
ос о'ч о
ОС
г^ос •0 1^
* # — 40 1 О ' * * 1 # ■— оо^
гч оо ■Н ^Ч I о ^
-Н С N0 — +1 -
чо ^ ГЧ Н
— ^ чо
—н О
о\ г сч I —"«Л
т о*
О о* •И ™
О СЗ
•Л
ч. ОО
о»
оо
ор 5 ¡§11
*
т сг
гч ^ — »
О Я ^ §
—^ т с ОН |
+ ^ 5 ¡2
— оо 2
00[3 оиЬ
+1
оо о
О +1
ТГ —
Г-
00 —: о\ о »о
ОЙ о
О с^)
-н
-I
ЧО О О ¡С
5 1
ОО —
с
Д ое
оо""-;
-Ноо
■
— о-
о
■Но Оч —
2 |
■ч- о о I
-Н М "-г
о
1§1 Я" а
а*
— С1 а
оь §
ой §
оа|
ооь
| « — оэ
о а
V я О. К : я
5 о £ *
И
* 3
«I
8 3 ва
в *
о 1
э « -1 £
* & В о
« со
я Й
ее О.
8 и
Ч О
и С
8 7
п
I л
"Я
X 4» и . „ Я В
Во в я
се
§3
в е р
Рв
II
5 Я
5 ™ •е.«
м О
к с « «
в в
Й я
Й «>
о. 3*
0 м
1 К I р>
X
я я
, в а ■ а а
II
с ^
С 2
с с
Гриппол плюс приводил к более существенному (р<0,001) увеличению субпопуляций ДКтакже на 7 сутки, но при этом отмечалось сохранение этого уровня практически через 1 мес. после вакцинации.
Этот факт, вероятно, можно объяснить с позиций концепций иммуноген-ности. Во-первых, связанных с понятием географической обусловленности иммунной реактивности, где индукция иммунного ответа критически зависит от антигена (сигнал 1), достигшего регионарных лимфоидных органов. Антиген, который не достигает дренирующих лимфатических узлов, является неотвечающим [7].
Во-вторых, теории эффекта депо, которая подчеркивает важность локализации антигена в течение продолжительного периода времени после иммунизации для активации Т-клеток в лимфатических узлах; удержание антигена на фолликулярных ДК внутри лимфоузла отвечает за стимулирование продолжительной продукции антител [14].
В-третьих, парадигма, когда адьюванты действуют как сигнал 0; то есть распознавание консервативных микробных структур, так называемых патоген-ассоциированных микробных структур (PAMPs) [6], при помощи патоген-распознающих рецепторов (PRRs), которые конститутивно экспрессируются на клетках врожденной иммунной системы [4]. В отличие от клонально экс-прессированных гипервариабельных антиген-специфических рецепторов на Т- и В-клетках, генерированных случайными генными реаранжировками, распознавание молекул врожденными иммунными клетками (PRRs) кодируется нереаранжируемыми генами, которые не отличаются генетической пластичностью и зависят от половых мутаций. Поскольку PRRs играют важную роль в формировании сигнала 2 на APCs, они направляют иммунный ответ таким образом, что клетки приобретенной иммунной системы получают «инструкцию», когда, где и как реагировать [9].
Было высказано предположение, что адьюванты могут имитировать микробные структуры, а также было выдвинуто предположение, что в основе их иммуногенности может быть распознавание определенных микробных дериватов по филогенетически древним PRRs, присутствующих на клетках врожденного иммунитета [7]. Это, вероятно, относится к адъювантам на основе микробных компонентов, таких как коклюшный токсин, микобактерии, му-рамилпептиды, LPS, липид А или CpG-богатые мотивы. C3d компонент комплемента, конъюгированный с антигеном, также активно стимулирует антиген-специфический антительный ответ, и может рассматриваться как молекулярный адъювант врожденного иммунитета [1].
В-четвертых, гипотеза, что адьюванты индуцируют или выступают в качестве молекул опасности; сигналы опасности от стрессированных или поврежденных тканей поступают к антиген-представляющим клеткам, в результате чего усиливается экспрессия костимулйрующих молекул. При этом, передача сигналов рекомбинантных цитокинов или костимуляторных молекул имитирует классическую адьювантную активность. Этапы, связанные с передачей сигналов с PRR, сигналов опасности и доставкой костимулирующих молекул APCs способствуют презентации антигена Т- и В-клеткам с последующим их праймированием. Сигналы, идущие от APCs, в свою очередь, могут служить в качестве природных адъювантов [11,12].
Резюмируя вышеизложенное, можно сделать предположение, что вакцинация гриппозными вакцинами активирует врожденные эффекторы — первое звено на пути проникновения инфекции — дендритные клетки как миелоид-ного, так и лимфоидного происхождения. При этом, более выраженный и
продолжительный эффект такой активации наблюдается при использовании
иммуноадъювантной вакцины по сравнению с субъединичной и сплит-
вакцинами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Bergmann-Leitner E.S., Leitner W.W., Tsokos G.C. Complement 3d: from molecular adjuvant to target of immune escape mechanisms. Clin. Immunol. 2006, Nov; 121 (2): 177-185.
2. Duraisingham S.S., Rouphael N., Cavanagh M.M. et al. Systems biology of vaccination in the elderly. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2013, 363: 117-142.
3. Geginat J., Nizzoli G., Paroni M. et al. Immunity to pathogens taught by specialized human dendritic cell subsets. Front. Immunol. 2015, Oct 13; 6: 527.
4. Iwasaki A., Medzhitov R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nat. Immunol. 2015, Apr; 16 (4): 343-353.
5. Kang I., Hong M.S., Nolasco H. et al. Age-associated change in the frequency of memory CD4+ T cells impairs long term CD4+ T cell responses to influenza vaccine. J. Immunol. 2004, 173:673-681.
6. MartinsK.A., BavariS.,SalazarA.M.\&ccineadjuvantusesofpoly-ICandderivatives. Expert. Rev. Vaccines. 2015, Mar; 14 (3): 447-459.
7. Moyer T.J., Zmolek A.C., Irvine D.J. Beyond antigens and adjuvants: formulating future vaccines. J. Clin. Invest. 2016, Mar 1; 126 (3): 799-808.
8. Sasaki S., Sullivan M., Narvaez C.F. et al. Limited efficacy of inactivated influenza vaccine in elderly individuals is associated with decreased production of vaccine-specific antibodies. J. Clin. Invest. 2011, 121:3109-3119.
9. Schenten D., Medzhitov R. The control of adaptive immune responses by the innate immune system. Adv. Immunol. 2011, 109:87-124.
10. Schettinil J., Mukherjee P. Physiological role ofplasmacytoid dendritic cells and their potential use in cancer immunity. Clin. Dev. Immunol. 2008;2008:106321. doi: 10.1155/2008/106321.
ll.Schijns V. Immunological concepts of vaccine adjuvant activity. Commentary. Curr. Op. Immunol. 2000, 12:456-463.
12. Trumpfheller C., Longhi M.P., Caskey M. et al. Dendritic cell-taigeted protein vaccines: a novel approach to induce T-cell immunity. J. Intern. Med. 2012, Feb; 271 (2): 183-192.
13. W&gar L.E., Gentleman В., Pircher H. et al. Influenza-specific T cells from older people are enriched in the late effector subset and their presence inversely correlates with vaccine response. PLoS ONE. 2011,6: e23698.
14.W&ng C., Liu P., Zhuang Y. et al. Lymphatic-targeted cationic liposomes: a robust vaccine adjuvant for promoting long-term immunological memory. \&ccine. 2014, Sep 22; 32 (42): 5475-5483.
15. Yoo S., Ha S.J. Generation of tolerogenic dendritic cells and their therapeutic applications. Immune Netw. 2016, Feb; 16 (1): 52-60.
Поступила 23.03.16
Контактная информация: Ахматова Нелли Кимовна,
105064, М.Казенный пер., 5а, р.т. (495)917-07-74
