CC BY
21О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
ЕА.Хромова, ИА.Семочкин, Э.А.Ахматова, В.Н.Сталпникова, СА.Сходова, Е.В.Сорокина, Н. К Ахматова, М.П.Костинов
СРАВНИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ВАКЦИН ПРОТИВ ГРИППА: ВЛИЯНИЕ НАСУБПОПУЛЯЦИОННУЮ СТРУКТУРУ ЛИМФОЦИТОВ
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва
Цель. Исследование субпопуляционной структуры лимфоцитов у здоровых лиц под воздействием различных вакцин против гриппа в системе in vitro. Материалы и методы. Проводили оценку иммунофенотипических особенностей мононуклеарных лейкоцитов периферической крови, активированных in vitro иммуноадъювантными и безадьювантны-ми вакцинами против гриппа у здоровых лиц с использованием метода проточной цито-метрии. Результаты. Вакцина Гриппол плюс оказывала более выраженное стимулирующее действие по сравнению с субъединичной и сплит-вакцинами на NK-клетки, клетки с марке-ром ранней активации CD45/CD25, индуцировала численность естественных регуляторных клеток (CD4/CD25/Foxp3), нарастание количества В-клеток и уменьшала число клеточных типов с маркером апоптоза CD45/CD95. Заключение. Иммуноадъювантная вакцина Гриппол плюс индуцировала формирование эффекторов как врожденного, так и приобретенного иммунитета и обладала наиболее мощным потенциалом в отношении активации различных типов иммунокомпетентных клеток по сравнению с безадъювантными вакцинами.
Журн. микробиод., 2016, № 6, С. 61—65
Ключевые слова: иммуноадъювантные и безадъювантные вакцины против гриппа, суб-популяционная структура лимфоцитов
EA.Chromova, lA.Semochkin, EAAkhmatova, V.N.Stolpnikoya, SA.Skhodova, E. V.Sorokina, N.KAkhmatova, M.P.Kostinov
COMPARATIVE ACTIVITY OF INFLUENZA VACCINES: EFFECT ON LYMPHOCYTE SUBPOPULATION STRUCTURE
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia
Aim. Study subpopulation structure of lymphocytes in healthy individuals under the effect of various influenza vaccines in an in vitro system. Materials and methods. Evaluation of immune-phenotype features of PBMCs, activated in vitro by immune-adjuvanted and unadjuvanted vaccines against influenza in healthy individuals, was carried out by using flow cytometry method. Results. Grippol plus vaccine caused a more pronounced stimulating effect compared with subunit and split-vaccines on NK-cells, cells with markers of eariy activation CD45/CD25, induced the quantity of natural regulatory cells (CD4/CD25/Foxp3), increase of the number of B-cells and reduced the amount of cell types with apoptosis marker CD45/CD95. Conclusion. Immune-adjuvanted vaccine Grippol plus induced formation of effectors of both innate and adaptive immunity and possessed the most powerful potential regarding activation of various types of immune-competent cells compared with unadjuvanted vaccines.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2016, No. 6, P. 61—65
Key words: immune-adjuvanted and unadjuvanted vaccines against influenza, lymphocyte sub-population structure
ВВЕДЕНИЕ
По своей социальной значимости грипп находится на первом месте среди инфекционных болезней человека. Заболеваемость гриппом и острыми респираторными инфекциями (ОРИ) превышает суммарный показатель по всем
остальным инфекциям. Единственным способом эффективного ограничения распространения гриппа и уменьшения тяжести его последствий является широкий охват вакцинацией групп риска населения — детей раннего возраста, пожилых людей и беременных [9]. На сегодняшний день существует более десятка разновидностей российских и зарубежных вакцин против гриппа как живых, так и инактивированных. Наибольшее применение, в силу своей высокой эффективности и малой реактогенности, получили инактивированные вакцины против гриппа, содержащие фрагменты вируса гриппа, а также им-муномодуляторы. Данные препараты хорошо зарекомендовали себя, т.к. имеют минимальное количество противопоказаний (в основном это аллергические реакции на отдельные их компоненты), и их применение возможно с 6-месячного возраста, в т.ч. и у беременных женщин. В настоящее время отсутствует информация о сравнительной активности адъювантных и безадъю-вантных вакцин и их влиянии на врожденные и приобретенные эффекторы иммунной системы на молекулярно-клеточном уровне.
Цель статьи — исследование субпопуляционной структуры лимфоцитов у здоровых лиц под воздействием иммуноадъювантных и безадьювантных вакцин против гриппа в системе in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследовании приняли участие 16 здоровых женщин репродуктивного возраста (18 — 50 лет), у которых исследовали образцы венозной крови. Проводили оценку иммунофенотипических особенностей мононуклеарных лейкоцитов периферической крови (МЛПК), активированных in vitro им-муноадъювантными и безадъювантными вакцинами против гриппа. МЛПК выделяли с помощью одноступенчатого градиента плотности фи-колл-урографина по. методу [5] путем центрифугирования. Лейкомассу разводили средой 199 в 2 раза (ПанЭко, Россия), содержащей 25 ЕД/мл гепарина (Sigma), затем наслаивали на градиент плотности фиколл-урографина плотностью 1,077 г/смЗ (Pharmacia) с последующим центрифугированием при 400 g 40 мин. МЛПК, образовавшие интерфазное кольцо, собирали и трехкратно отмывали в среде 199. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждали центрифугированием при 250 g.
Клетки (106 кл/мл) инкубировали в СОг инкубаторе в течение 96 часов в присутствии различных вакцин (10 мкл/мл) против гриппа. Исследовали активность следующих вакцин; Инфлювак (субъединичная), Ваксигрип и Ультрикс (сплит-вакцины), Гриппол плюс (иммуноадъ-ювантная). '
Исследование субпопуляционной структуры лимфоцитов периферической крови проводили методом проточной цитометрии на приборе FC-500 (Beckman Culter, США) с использованием FITC- и РЕ-меченных МАТ к CD45/CD3, CD3/CD4, CD3/CD8, CD16/56, CD3/CD16/56, CD45/CD20, CD45/HLA-DR, CD45/CD25, CD4/CD25/Foxp3, CD45/CD95. Изменение данных показателей после инкубации с различными вакцинами соотносили с контролем после инкубации без присутствия вакцины.
РЕЗУЛЬТАТЫ |
Изучение изменения субпопуляций МЛПК у здоровых женщин детородного возраста показало отсутствие каких-либо статистически значимых различий между образцами, культивируемыми с различными видами вакцин, и
Влияние ядьювантной и безадъювантных вакцин на субпопуляционную структуру лимфоцитов в культуре МЛПК у здоровых женщин
Содержание лимфоцитов, % (М±а)
Показатель Контроль Инфлювак Гриппол плюс Ваксигрип Ультрикс Различия межу группами
CD45/CD3
CD3/CD4
CD3/CD8
CD 16/56
CD3/CD16/56
CD45/CD20
CD45/HLA-DR CD45/CD25
CD4/CD25/Foxp3
CD4/CD8
CD45/CD95
73,55±4,08 45,54±2,15 19,18±1,69 4,34±0,61 2,05±0,76 6,77±0,56
14,86±0,27 3,23±0,42
1,48±0,54 2,71±0,33 . 6,17±0,64
68,99±2,05 43,88±3,52 18,16±1,58 12,38±0,69* 4,00±0,58* 16,69+1,93*
20,03±1,63* 6,88±0,49*
' J " *
1,69±0,53 2,33±0,29 7,13±0,63
64,б7±6,06 42,57±3,84 18,99±1,62 14,54±0,62* 4,34±0,17* 10,49±1,79*
31,26±1,14* 9,19±0,59*
2,53±0,73* 2,26±0,28 5,12±0,28*
^2,49±2,66 46,44±4,03 20,92±1,33 13,36±0,81* 4,64±0,66* 8,48±1,31
27,90±2,58* 6,63±0,46*
1,99±0,59 2,7±0,35 6,24±0,42
68,23±2,67 41,10±2,85 18,09±2,02 10,70±0,68* 4,05±0,34* 9,14±1,35 •.
30,05±2,80* 6,64±0,63*
1,86±0,57 1,92±0,37 5,98±0,67
р1и2-5 >0,05 Р1н2-5 >0,05 Р1и2-5>0,05 Р 3и1.2,4,3 <0.03 Р 2.3,4,5 я 1 <0,05 Р2и1,3-5 <0,05; Р Зн1,4,5<0,05 Р 2иЗ-5 <0,05
P2nU<0,05;
Р3и1,2,4,5<0,05 Р 3и1 <0,05 Р!н2-5 >0,05 Р3*1,2,5<0,05;
Примечание. * р<0,05 — достоверность различий с контрольной группой (Mann-Whitney U test).
контрольным образцом (без вакцины), в отношении общего пула Т-лимфо-цитов с фенотипом CD45/CD3, Т-хелперов (CD3/CD4) и цитотоксических (CD3/CD8) лимфоцитов (табл.).
Однако было выявлено нарастание уровня количества естественных кил-лерных клеток (NK-клетки) с маркерами CD16/56 под воздействием вакцин Инфлювак (в 2,8 раза), Гриппол плюс (в 3,3 раза), Ваксигрип (в 3 раза) и Упьтрикс (в 2,4 раза), Следует отметить, что в нашем исследовании более выраженное иммуностимулирующее действие на МЛПК оказывала иммуно-адъювантная вакцина Гриппол плюс. NK-клетки относятся к ключевым эффекторам врожденного иммунитета, функцией которых является лизис опухолевых и инфицированных вирусами клеток [7] и регуляция врожденного и адаптивного иммунных ответов [4J.
Также наблюдалось нарастание численности естественных киллерных Т-лимфоцитов (NKT), экспрессирующих молекулы CD3/CD16/56, примерно в 2 раза в образцах со всеми вакцинами: Инфлювак (в 2 раза), Гриппол плюс (в 2,1 раза), Ваксигрипп (в 2,26 раза), Ультрикс (в 2 раза).
Что же касается клеток-антителопродуцентов В-лимфоцитов с фенотипом CD45/CD20, статистически значимое увеличение было выявлено под воздействием вакцины Инфлювак (увеличение в 2,5 раза), Гриппол плюс (увеличение в 1,5 раза).
Также было отмечено увеличение содержания клеток, экспрессирующих маркеры ранней (CD25) и поздней (HLA-DR) активации, под влиянием всех исследуемых вакцин. При этом наиболее существенные изменения наблюдались в образце с иммуноадьювантной вакциной Гриппол плюс. Она повышала количество клеток с экспрессией маркера CD45/CD25 в 2,8 раза по сравнению с контролем, активность безадъювантных вакцин была ниже — Инфлювак увеличивал число клеток с данным маркером в 2,1 раза, Ваксигрип и Ультрикс — в 2 раза.
В отношении маркера CD45/HLA-DR наблюдалась следующая картина: Гриппол плюс повышал численность клеток в 2,1 раза, Инфлювак — в 1,3 раза, Ваксигрип — в 1,9 раза, Ультрикс — в 2 раза.
Одной из наиболее изученных популяций являются так называемые естественные регуляторные клетки тимусного происхождения (пТге§) с поверхностным фенотипом СБ4+СЭ25+ и конститутивной экспрессией транскрипционного фактора БохрЗ (ГогкЬеасШохрЗ), ответственного за ихрегуляторную активность. Примечательно, что в нашем исследовании мы выявили увеличение клеток, экспрессирующих данный маркер, только в одном образце с им-муноадьювантной вакциной Гриппол плюс (увеличение в 1,7 раза).
Относительно маркера апоптоза СЭ45/С095 мы выявили увеличение клеток в образце с вакциной Инфлювак (в 1,1 раза), в образцах с вакцинами Ваксигрип, Ультрикс показатели были идентичны с данными контроля, а в образце с вакциной Гриппол плюс мы обнаружили снижение количества клеток в 1,2 раза. /
ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение влияния различных вакцин против гриппа на субпопуляцион-ную структуру лимфоцитов выявила следующее. Вакцина Гриппол плюс имела более выраженное стимулирующее действие по сравнению с субъединичной и сплит-вакцинами на ЫК-клетки, клетки с маркером ранней активации СВ45/СБ25, индуцировала численность естественных регуляторных клеток (С04/С025/РохрЗ), нарастание количества В-клеток и уменьшала число клеточных типов с маркером апоптоза СБ45/СВ95. То есть иммуно-адьювантная вакцина Гриппол плюс индуцировала формирование эффекторов как врожденного, так и приобретенного иммунитета. При взаимодействии с мононуклеарами периферической крови человека полиоксидоний существенно повышает цитотоксичность ТЧК-клеток по отношению к клеткам-мишеням. Этот эффект наблюдался практически у всех исследованных доноров, причем повышающий эффект особенно выражен у индивидуумов, у которых активность МК-клеток находилась на нижней границе нормы или была понижена [2].
Нарастание численности Т-геБв, возможно, можно объяснить иммуноре-гулирующим влиянием вакцины, содержащей адъювант полиоксидоний. Иммунорегуляторная функция nTreg реализуется как посредством секреции цитокинов, таких как ТСБ-Р и ИЛ-10, так и контактного взаимодействия с эффекгорными Т-лимфоцитами и антигенпрезентирующими клетками [3].
Стимуляция субъединичной вакциной Инфлювак увеличивала количество клеток с маркером апоптоза СБ45/С095 и лучше всего стимулировала рост В-клеток. Экспрессия молекулы СБ95 указывает на готовность к апоптозу и появляется чаще на клетках властного ряда. Именно с этим явлением и связывают низкий уровень порога чувствительности пролиферирующих клеток к апоптозу под воздействием различных агентов у здоровых лиц [1]. А в отношении других популяций клеток Инфлювак в меньшей степени стимулировал нарастание числа иммунокомпетентных клеток. Известно, что в отсутствие адъюванта иногда может сформироваться слабый иммунный ответ, а при низкой концентрации антигена наивные Т-лимфоциты могут стать толеро-генными [8].
В отношении естественных киллерных Т-лимфоцитов (14КТ) с маркером СОЗДЛ) 16/56 все вакцины имели одинаковое стимулирующее действие, увеличивая численность клеток примерно в 2 раза. ЫКТ, являясь фенотипически неоднородной популяцией клеток, дублируют функции НК и являются свя-
зующим звеном между врожденным и приобретенным иммунитетом, однако их роль в настоящее время полностью не изучена [6].
Что же касается клеток с экспрессией маркера поздней активации CD45/ HLA-DR, действие иммуноадьювантной вакцины и сплит-вакцин имело схожие результаты, увеличивая численность клеток примерно в 2 раза. Несколько хуже был результат с субъединичной вакциной Инфлювак (увеличение 1,3 раза). Данный маркер является также ключевой молекулой антигенной презентации, экспрессия его может свидетельствовать об активации клеточного звена и возможности представления антигенов (АГ), входящих в состав вакцины, антиген-представляющими клетками. Известно, с сохранением нативной структуры АГ и антигенной специфичности полиоксидоний осуществляет прочное связывание с АГ различной природы, обеспечивая физическую презентацию АГ антигенпредставляющими клетками [5]. Таким ' ■ образом,'резюмируя вышеизложенное, можно заключить, что наиболее мощным потенциалом в отношении активации различных типов иммунокомпе-тентных клеток обладает иммуноадьювантная вакцина Гриппол плюс.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ахматова Н.К. Роль апоптоза лимфоцитов периферической крови вмеханизмах развития геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Дисс. к.м.н., Уфа, 2003.
2. Иванова А.С., Пучкова Н.Г., Некрасов А.В. и др. Механизмы адъювантных эффектов полиоксидония. Иммунология гемопоэза. 2015,13 (2): 30-92.
3. Казимирко Н.К., Акимова Е.Е., Завацкий В.Ю., Поляков А.С., Татаренко Д.П. Иммунология физиологической беременности. Молодой ученый. 2014, 3 (6): 132-137.
4. Biron С.А., Nguyen К. В., Pien G. С. et al. Natural killer cells in antiviral defense: function and regulation by innate cytokines. Annu. Rev. Immunol. 1999,17:189-220.
5. Boyum A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1968,267:95-99.
6. De Martino M., Rossi M.E., Azzari C. et al. Viral load and cd69 molecule expression on freshly isolated and cultured mitogen-stimulated lymphocytes of children with perinatal hiv-1 infection. Clin. Exp. Immunol. 1999,117 (3): 513-516.
7. French A. R., Yokoyama W. M. Natural killer cells and viral infections. Curr. Opin. Immunol. 2003,15:45-51.
8. Schettinil J., Mukheqee P. Physiological role of plasmacytoid dendritic cells and their potential use in cancer immunity. Clin Dev. Immunol. 2008; 2008:106321. doi: 10.1155/2008/106321.
9. Siston A.M. et al. Pandemic 2009 influenza A(H 1N1) virus illness among pregnant women in the United States. JAMA. 2010,303 (15): 1517-1525.
Поступила 27.04.16
Контактная информация: Хромова Екатерина Александровна, 105064, Москва, М.Казенный пер., 5а, р.т. (495)917-49-00
5.ЖМЭИ « N27-2016
65
