CC BY
9
УДК 577.15.08+606.61
Ванюшенкова А.А., Тузова Е.С., Панюкова Н.С., Белов А.А.
ВЛИЯНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, В ПРИСУТСТВИИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ АГЕНТОВ, НА СТРУКТУРУ КОЛЛАГЕНА, КАК НА МОДЕЛЬ КОЖИ
Ванюшенкова Анна Алексеевна - студентка 2-го курса магистратуры факультета биотехнологии и промышленной экологии;
Тузова Екатерина Сергеевна - студентка 4-го курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Панюкова Наталья Сергеевна - инженер подразделения Центр коллективного пользования им. Д.И. Менделеева; Белов Алексей Алексеевич - д.т.н., профессор кафедры биотехнологии, ABelov2004@ yandex.ru Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
Изучено влияние протеолитических ферментов на структуру коллагена, как на модель кожи человека. Показано, что используемые нами ферментные препараты, за исключением протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба не повреждают матрикс третичной структуры. Установлено, что введение хитозана в систему предотвращает проникновение фермента вглубь макрофибриллы, а включение лидокаина не разрушает третичной структуры коллагена.
Ключевые слова: протеолитические ферменты, коллаген, терапевтические агенты, препараты для ранозаживления.
PROTEOLYTIC ENZYMES' INFLUENCE ON THE COLLAGEN' STRUCTURE AS A SKIN MODEL IN THE PRESENCE OF THERAPEUTIC AGENTS
Vaniushenkova A.A., Tuzova E.S., Panyukova N.S., Belov A.A.*
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia.
*e-mail: abelov2004@ yandex.ru
The influence of proteolytic enzymes on the collagen' structure, as a model of human skin, has been studied. It has been shown that the enzyme preparations used by us, with the exception of the proteolytic complex from crab hepatopancreas, do not damage the matrix of the collagen' tertiary structure. It has been established that the introduction of chitosan into the system prevents the enzyme from penetrating deep into the macrofibril, and the inclusion of lidocaine does not destroy the tertiary structure.
Keywords: proteolytic enzymes, collagen, therapeutic agents, wound healing dressings.
Введение
На современном этапе развития медицины, распространенность различных повреждений кожного покрова, включая хронические и гнойно-некротические, остаётся на достаточно высоком уровне. Особенную тяжесть ранения и травмы, полученные возрастными пациентами, а также повреждения, возникшие в ходе дисфункций иммунной системы. Сложность процесса ведения подобных ран серьезно сказывается на качестве жизни пациента, а также ложится экономическим бременем на медицинские учреждения [1]. Большинство перевязочных средств представленных на современном фармацевтическом рынке обладают только одним или двумя свойствами, необходимыми для полноценного ранозаживления. В связи с чем, получение нового комплексного препарата для заживления ран все еще остается важной темой исследований.
Кожа человека обширна и состоит из четырех основных клеточных слоев: рогового слоя, жизнеспособного эпидермиса, дермы и подкожных тканей. Процесс воспаления, в большинстве случаев, затрагивает элементы непосредственно дермы, так как она представляет собой основную часть жизнеспособных клеток эпителия. Она обеспечивает поддержание эластичности кожного покрова и его механической прочности, главным образом за счет
структурных белков и фибробластов. Дерма включает в себя волосяные фоликулы, сальные и потовые железы, высоко иннервирована и содержит множество макрофагов, обеспечивающих иммунный ответ.
Коллаген является одним из самых распространенных белков живых организмов [2]. Являясь кором соединительных тканей, он обеспечивает прочностные и эластические свойства, способствует снижению микробной контаминации кожных ранений, поддерживает синтез микрососудов и локализацию фибробластов в очаге ранения.
Под коллагеном принято понимать семейство белков схожего фибриллярного, а точнее
тропоколлагенового строения. Тропоколлаген - это структура, состоящая из трех левозакрученных а-цепей полипептидов. Подобное расположение нитей вызывает образование симметричного узора, где образующиеся цепи, немного смещаются вправо, генерируя «суперспираль» с шагом около 86 А [3]. Эта структура поддерживает конформационную устойчивость за счет водородных связей. Помимо вышеописанного существуют также и надмолекулярные структурные паттерны, такие как макрофибриллы, которые впоследствии агрегируют в коллагеновые волокна, скрепляясь ковалентными связями [2]. Дальнейшие надмолекулярные
изменения фибраиилярного волокна происходят за счет включения ряда гликопротеинов и протеогликанов [3,4].
Для сохранения нормального содержания коллагеновых волокон и предотвращения образования рубцовых тканей, в организме существует целый каскад различных реакций, обеспечивающий денатурацию коллагенового волокна. В норме нативный коллаген не подвержен гидролизу пептидгидролазами, в связи с чем, естественный процесс его деградации протекает в несколько этапов.
На первой стадии происходит деградация коллагена под воздействием коллагеназ, выделяющихся в межклеточный матрикс. В ходе гидролиза изменяется множество значимых параметров полимера - длина и толщина волокна, упорядоченность конформационных элементов в пространстве фибриллы, а самое главное -нарушение третичной структуры коллагена и переход значимой его части в денатурированную форму - желатину [3]. В последствии к процессу подключается пул выделившихся матриксных металлопротеиназ, расщепляющих доступную для гидролиза денатурированную фракцию.
Завершаются вышеописанные процессы при помощи внутри- и внеклеточного протеолиза денатурированных фрагментов до олигомерных пептидов [5].
Помимо прочего, коллаген способен деструктурировать посредством неферментативных процессов. Коллаген кожных покровов способен к образованию структурных разрывов и появлению новых межмолекулярных сшивок под действием ультрафиолетового излучения [6]. Кроме того, денатурация коллагена под воздействием тепла или химикатов, не провоцирующая сдвиги в естественных метаболитических путях, а влияющая непосредственно на готовую макромолекулу может привести к разрушению спиральной структуры и «усадке» в направлении продольной оси волокна. Тепловая денатурация молекулы коллагена приводит к ускорению ее превращения в конформацию «случайного клубка», за счет температурного разрыва связей [3,7].
Использование различных вспомогательных веществ и биополимеров в разработанных препаратах способствует более быстрому и успешному проникновению терапевтических агентов (ТА) в кровоток и различные органы человека. Вполне возможно, что некоторые ТА могут вызвать временную (проходящую) денатурацию кожного покрова, в результате чего может происходить разъедание кожи используемыми ферментами [8]. Для подтверждения выдвинутого тезиса о том, что используемые при разработке ранозаживляющих препаратов ферменты, как в присутствие, так и в отсутствие ТА, не действуют на неповрежденную кожу и живые клетки, а разрушению подвергается только денатурированные (мертвые) фрагменты был проведен ряд физико-химических анализов.
Экспериментальная часть.
Для определения вышеописанных изменений, происходящих в препаратах коллагена при выдерживании в модельной среде, характерной для гнойной раны (37оС, фосфатный буферный раствор (ФБ) рН 6,2), а также при введении терапевтических агентов (ТА), включая ферменты и ферментные препараты, были получены данные сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Полученные данные показывают отсутствие нарушений структуры коллагенового после экспозиции в модельных условиях. При добавлении ряда ферментов значительные изменения были детектированы только при взаимодействии с протеолитическим комплексом из гепатопанкреаса краба (ПК), содержащим в своем составе истинные коллагеназы.
Для более подробного изучения видоизменения структуры коллагена при описанных выше условиях был проведен ряд исследований методом ИК-спектроскопии. ИК-спектры были получены с помощью ИК-Фурье спектрометра Nicolet 380 с приставкой НПВО (Thermo Scientific, США) в диапазоне 550 - 4000 см-1, где в качестве оптического материала использовался кристалл из селенида цинка. Исследования по методу ИК-спектроскопии выполнялись на оборудовании Центра коллективного пользования РХТУ им. Д.И.Менделеева. Данные ИК-спектроскопии представлены на рисунках 1-3.
Согласно полученным данным, третичная структура молекулы сохраняется при помещении коллагена в модельные условия вплоть до 72 часов -максимального времени экспозиции
разрабатываемого препарата на ране. Для образцов коллагена, подверженных добавлению ферментов, наблюдается различие в спектральных картинах. Для образцов, в которые был добавлен протеолитический комплекс, отмечается уменьшение этого соотношения, что позволяет предполагать частичное разрушение третичной структуры. При экспозиции с трипсином, как с оптимальной моделью протеолитического монофермента, нарушений в структуре коллагенового волокна не наблюдается, как и при анализе с папаином.
Рисунок 1. ИК-спектры коллагена в 1/15М ФБ 6,2 при 37°С при различном времени экспозиции.
Рисунок 2. ИК-спектры коллагена, при добавлении различных ферментов, а именно Тр, Пап и ПК в 1/15М ФБ 6,2 при 37°С при различном времени экспозиции.
Рисунок 3. ИК-спектры коллагена, при добавлении различных ферментов, а именно Тр, Пап и ПК в 1/15М ФБ 6,2 при 37°С при различном времени экспозиции.
Из полученных данных, видно, что при введении в систему хитозана происходит стабилизация макромолекулы и не происходит значительных колебаний соотношения величин поглощения амида III и характеристической полосы на 1456 см-1. Помимо этого, характерной областью исследований ИК-спектров желатины является пик вблизи 800 см-1, которого не наблюдается на спектрах нативного коллагена [9]. По его образованию и увеличению интенсивности можно отслеживать процессы деструкции, не затрагивающие третичной структуры. Характерные изменения в данной области были отмечены у образцов коллагена, помещенных в модельные условия на 24, 48 и 72 часа, а также подверженных добавлению ПК. При этом, при внесении Хт в систему наблюдается снижение желатинового пика. Добавление лидокаина, напротив, повышает пик в области 800 см-1, но не влияет на показатели, отвечающие за третичную структуру. Данное явление, предположительно, связано с повышением доступности для ферментов структур на поверхности макрофибриллы при ее взаимодействии с лидокаином.
Кроме этого, было определено действие протеаз на частично денатурированный коллаген. Данный анализ проводился с применением нингидриновой методики с контролем всех составных элементов композиции. Согласно полученным данным, у некоторых из анализируемых ферментов обнаружена эластолитическая активность (при использовании субстрата БосЛ1аОКр) и все ферменты имели
активность по азоколлу. Введение в систему различных добавочных терапевтических агентов, за исключением хитозана, не влияло на степень деструкции коллагена. Заключение
Но основе полученных данных можно сделать вывод, что используемые нами ферментные препараты, за исключением протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба не повреждают матрикс третичной структуры, а воздействуют только на денатурированную его часть - желатину. Введение хитозана в систему предотвращает проникновение фермента вглубь макрофибриллы и последующую ее денатурацию, а включение лидокаина не разрушает третичной структуры, но делает частично денатурированную часть коллагенового волокна более доступной для ферментных препаратов. Все перечисленное позволяет использовать разрабатываемые перевязочные препараты на стадии новообразования коллагенового матрикса без угрозы его деструкции.
Список литературы
[1]. Umar N. M., Parumasivam T., Toh S. M. An Overview of Cutaneous Wounds and the Beneficial Roles of Medicinal Plants in Promoting Wound Healing //Pharmaceutical Sciences. - 2021.
[2]. Linsenmayer T. F. Collagen //Cell biology of extracellular matrix. - Springer, Boston, MA, 1991. - P. 744.
[3]. Nimni M. E., Harkness R. D. Molecular structure and functions of collagen //Collagen. - CRC Press, 2018. -P. 1-78.
[4]. Boot-Handford R. P., Tuckwell D. S. Fibrillar collagen: the key to vertebrate evolution? A tale of molecular incest //Bioessays. - 2003. - Т. 25. - №. 2. - P. 142-151.
[5]. Mirastschijski U. et al. Matrix metalloproteinase-3 is key effector of TNF-a-induced collagen degradation in skin //International journal of molecular sciences. - 2019. -Т. 20. - №. 20. - P. 5234.
[6]. Rabotyagova O. S., Cebe P., Kaplan D. L. Collagen structural hierarchy and susceptibility to degradation by ultraviolet radiation //Materials Science and Engineering: C. - 2008. - Т. 28. - №. 8. - P. 1420-1429.
[7]. Miles C. A., Bailey A. J. Thermal denaturation of collagen revisited //Proceedings of the Indian Academy of Sciences-Chemical Sciences. - Springer India, 1999. - Т. 111. - №. 1. - P. 71-80.
[8]. Тузова, Е. С., Белов. А. А. Действие на коллаген протеаз в присутствии различных терапевтических агентов. // Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. Сборник тезисов. XXXIII Зимняя международная молодёжная научная школа. -Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва. -2021- С. 224-224.
[9]. Пчелин В.А., Салимов М. А. О взаимодействии желатины с формальдегидом. //Высокомолекулярные соединения. - 1959. - Т. 1. - №. 5. - С. 682-687.
