CC BY
8
УДК 577.15.08+606.61
Ванюшенкова А.А., Ханафина А.А., Иванова С.Н., Досадина Э.Э., Белов А.А.
ДЕЙСТВИЕ ПРОДУКТОВ ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ ДЕСТРУКЦИИ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ И ЕЕ ПРОИЗВОДНЫХ НА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА КРАБА
Ванюшенкова Анна Алексеевна, студент 3-го курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Ханафина Анна Андреевна, студент 4-го курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Иванова Светлана Николаевна, главный специалист ЦКП им. Д.И. Менделеева; Досадина Элина Эльдаровна, кафедра биотехнологии;
Белов Алексей Алексеевич, д.т.н., профессор кафедры биотехнологии, E-mail: ABelov2004@ yandex.ru Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
В работе изучено действие продуктов гидролитической деструкции целлюлозы и ее производных на протеолитическую активность ферментов протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба при различной инкубации в жидкой среде (до 552 ч, Т 37°С, рН 6,2). Было установлено, что продукты деструкции исследованных образцов материалов, за исключением ДАЦ (1,20), не оказывают существенного влияния на ферментативную активность ферментов ПК при комнатной температуре в течении 2 часов, но повышают значения эффективных констант скорости термоинактивации (25,37,45°С, рН 6,2, 48 часов).
Ключевые слова: диальдегидцеллюлоза, протеиназы, хитозан, гидролитическая деструкция, материалы для ранозаживления.
PRODUCTS EFFECT OF CELLULOSE AND ITS DERIVATIVES HYDROLYTIC DESTRUCTION ON THE PROTEOLYTIC ACTIVITY OF THE PROTEOLYTIC COMPLEX ENZYMES FROM CRAB HEPATOPANKRAS
Vaniushenkova A.A., Khanafina A.A., Ivanova S.N., Dosadina E.E., Belov A.A.*
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. *e-mail: abelov2004@ yandex.ru
This article has studied the products effect of cellulose and its derivatives hydrolytic degradation on the proteolytic activity of the proteolytic complex enzymes of crab hepatopancreas during prolonged incubation in a liquid medium (up to 552 h, T 37 ° С, pH 6.2). It was found that the degradation products of the studied samples of materials, with the exception of DAC (1.20), do not have a significant effect on the enzymatic activity of PC, but increase the values of the effective inactivation rate constants.
Keywords: proteinases, chitosan, hydrolytic destruction, materials for wound healing
При использовании в медицинской практике иммобилизованных препаратов разнообразных терапевтических агентов (ТА) необходимо знать механизмы их работы и утилизации в организме. Выбор в качестве биодеградируемых и биосовместимых носителей диальдегидцеллюлозы (ДАЦ) и хитозана (Хт) подробно нами обоснован в [1,2].
В то время, как целлюлоза нерастворима в воде и устойчива к действию слабых растворов кислот и щелочей, диальдегидцеллюлоза (ДАЦ -продукт перйодатного окисления целлюлозы) и ее производные подвергаются разрушению в воде и слабокислых и сильнее слабощелочных растворах [2]. Этот процесс называется гидролитической деструкцией. Кинетика гидролитической деструкции описывается полулогарифмической анаморфозой, что позволяет рассчитать константы скоростей гидролитической деструкции как константы скоростей реакций первого порядка. Можно
рассчитать (и самое главное регулировать) за какое время половина всех способных к переходу в растворимое состояние фрагментов ДАЦ-ТА диффундирует в раневой экссудат. Это чрезвычайно важно с точки зрения практического применения терапевтических систем в медицинской практике. Целлюлоза (Ц) - стереорегулярный высокоориентированный кристаллический полимер. Степень кристалличности хлопка 65 - 70%. При перйодатном окислении в ДАЦ превращается, в первую очередь, аморфная часть. Кристаллическая часть остается каркасом, который при относительно невысоких степенях окисления обеспечивает достаточную механическую прочность ДАЦ [2]. То же относится и к производным ДАЦ содержащих различные ТА (терапевтические агенты).
Для исследования кинетики гидролитической деструкции материалов, нами было изучено изменение различных физико-химических параметров носителей и продуктов деструкции
(растворы в которые они были помещены). Навеску материала заливали 1/15М ФБ рН 6.2 при гидромодуле =50, и помещали в водяной термостат (37°С) при периодическом перемешивании, через заданные интервалы времени определяли необходимый параметр. Как видно из представленных данных и [1,3] деструкция ДАЦ начинается сразу при помещении ее или препаратов на ее основе в раствор (37°С, рН 6,2) и это отражается на УФ-Вид спектрах растворов, в которые помещается ДАЦ [1]. Что может быть связано с разрывом, как связей носитель-ТА (носители ДАЦ, Ц, Хт), так и деструкция самого носителя. В условиях организма к этому может присоединиться и биологическая деструкция -деструкция (как носителей, так и иммобилизованных ТА) под действием ферментов организма. На рисунке 1 представлены УФ-спектры растворов целлюлозных носителей после 552ч инкубации в 1/15М ФБ 6,2 при 37°С. Так как содержание продуктов деструкции, обладающих интенсивным поглощением в исследуемой области, для образца ДАЦ (1,20) слишком велико, чтобы увидеть спектральную картину нам пришлось разбавить исходную пробу 1/15М ФБ 6,2 в 10 раз (ДАЦ (1,20) р
Рисунок 1. УФ спектры растворов целлюлозных носителей после 552ч инкубации в 1/15М ФБ 6,2 при 37°С
Таблица 1. Влияние продуктов деструкции целлюлозных
носителей на ферментативную активность (субстрат казеин) ферментов, входящих в состав ПК, в зависимости
На рисунках 2 и 3, в качестве примера, приведены ИК-спектры образцов Ц и ДАЦ (0,28) до и после выдерживания в течение 48 часов в 1/15М ФБ (рН 6,2) при 37°С. Для образцов после выдерживания (ак) в растворе 1/15М ФБ содержатся продукты деструкции целлюлозных препаратов. Как видно из полученных данных, в первую очередь для образцов ДАЦ, в области 1800-1600 см-1 видны значительные изменения в спектре. В литературе было показано [4], что данная область спектра соответствует альдегидным группам,
образовавшимся в результате перйодатного окисления целлюлозы.
Как нами было установлено ранее продукты гидролитической деструкции ДАЦ обладают «интересными» и полезными, с точки зрения лечения ран, свойствами [1]. Они обладают антиоксидантными свойствами и замедляют рост таких патогенных микроорганизмов как St.aureus и Е.соЫ. Продукты гидролитической деструкции исследованных целлюлозных материалов не влияют на протеолитическую активность ферментов ПК (за исключением ДАЦ (1,20)), но происходит увеличение эффективных констант скорости инактивации в их присутствии при термоинактивации образцов ПК при 25,37,45°С, рН 6,2, до 48 часов. По всей видимости альдегидсодержащие фрагменты носителя или иные «активные» вещества образовавшиеся в ходе деструкции носителя модифицируют
(инактивируют) молекулу белка, причем в процессе термоинактивации продуктами деструкции прослеживается четкая зависимость увеличения инактивирующего действия во времени, а также с увеличением степени модификации (количества альдегидных групп) и температуры, аналогичная раствору формальдегида. Глюкоза не инактивирует ферменты ПК.
от времени инкубации в 1/15М ФБ 6,2 при 37°С.
Образец Время, ч А/Ао
Целлюлоза(0,08) 2 1,39
24 1,49
48 1,245
552 1,13
ДАЦ(0,28) 2 1,25
24 1,41
48 1,15
552 1,09
ДАЦ(0,28)-Хт 2 1,43
24 1,46
552 1,14
ДАЦ(1,20) 48 0,80
552 0,99
Рисунок 2. ИК спектры образцов Целлюлозы до и после выдерживания (Се1 иН) в 1/15М ФБ (рН 6,2) при 37°С 48ч
Список литературы
1. Ванюшенкова А.А., Досадина Э.Э., Белов А.А. и др. Синтез и исследование свойств композиционных материалов на основе целлюлозы и хитозана содержащие различные терапевтические агенты. Часть 2. Влияние хитозана на деструкцию целлюлозных носителей и кинетику выхода терапевтического агента в модельной среде ПБутлеровские сообщения. 2019. Т.57. №3. С.105-119.
2. Белов А.А. Разработка промышленных технологий получения новых медицинских материалов на основе модифицированных
волокнообразующих полимеров, содержащих биологически активные белковые вещества. Дисс. на соис. ученой степ. доктора технич. наук М.: РХТУ. 2009. С.385.
3. Досадина Э.Э., Бркич Л.Л., Пятигорская Н.В. и др. Использование хитозана в качестве носителя протеиназ и мирамистина для получения ферментсодержащего геля ПБутлеровские сообщения. 2016. Т.48. №10. С.49-59.
4. Fan Q. G., Lewis D. M., Tapley K. N., Characterization of Cellulose Aldehyde Using Fourier Transform Infrared Spectroscopy, ¡¡Journal of Applied Polymer Science, 2001, Vol. 82, Р. 1195-1202,
