CC BY
9
УДК 577.15.08+606.61
Ванюшенкова А.А., Тузова Е. С., Белов А.А.
ТЕРМОИНАКТИВАЦИЯ БРОМЕЛАИНА В ПРИСУСТВИИ РАЗЛИЧНЫХ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ АГЕНТОВ И МОЧЕВИНЫ
Ванюшенкова Анна Алексеевна - студентка 1-го курса магистратуры факультета биотехнологии и промышленной экологии;
Тузова Екатерина Сергеевна - студентка 3-го курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Белов Алексей Алексеевич - д.т.н., профессор кафедры биотехнологии, ABelov2004@ yandex.ru Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
Изучено действие на ферментативные активности бромелаина, как непосредственно мочевины, так и других терапевтических агентов (ТА), входящих в состав разрабатываемого препарата . Было установлено, что мочевина способствует термоинактивации бромелаина, при изученных условиях. Показано, что цистеин и хитозан не предотвращают ее инактивирующее воздействие на ферментативную активность. Ключевые слова: бромелаин, мочевина, термоинактивация фермента, препараты для ранозаживления.
BROMELAIN THERMAL INACTIVATION IN THE PRESENCE OF VARIOUS THERAPEUTIC AGENTS AND UREA
Vaniushenkova A.A., Tuzova E.S., Belov A.A.*
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. *e-mail: abelov2004@ yandex.ru
The effect on the enzymatic activities of bromelain was studied, both directly of urea and other therapeutic agents (TA), which are part of the developed drug. It was found that urea promotes thermal inactivation of bromelain under the conditions studied. It was shown that cysteine and chitosan do not prevent its inactivating effect on enzymatic activity. Keywords: bromelain, urea, thermal inactivation of the enzyme, wound healing dressings.
Введение.
Кожа человека - самый обширный по занимаемой площади орган. Она обеспечивает множество жизненно важных функций: защитную, экскреторную, рецепторную, дыхательную и эндокринную, а также поддерживает терморегуляцию
[1]. В условиях повреждения эпителиальных тканей, кожа способна к заживлению и восстановлению целостности собственного покрова. Именно ряд данных последовательных стадий, согласованный и скоординированный и называется процессом ранозаживления и представляет особый интерес для исследователей. На протекание этапов раневого процесса влияет большое количество как внутренних, так и внешних факторов, таких как этиология, вид повреждающего агента, патогенетические аспекты альтерации, особенности репаративных свойств кожи
[2]. Помимо этого существенную роль играют такие явления как нейропатия при сахарном диабете, заболевания сердечно-сосудистой системы, болезни иммунодефицита, расстройства пищевого поведения и заболевания наследственного характера. К факторам, снижающим ранозаживление и пролонгирующим этап воспаления можно отнести бактериальную контаминацию, наличие некротизированных тканей, недостаточная гигиена раны, неполное кровоснабжение и насыщение кислородом тканей раны. Полноценное заживление ран во многом зависит от оксигенации тканей, особенно у краевой зоны раневого канала [3,4]. В связи с этим, разрабатываемое перевязочное средство должно обеспечивать достаточный газообмен раневого ложа с окружающей средой.
В терапии принято придерживаться правила T.I.M.E.-tissue debridement, inflammation/infection, moisture imbalance, epithelial edge advancement [5]. То есть для правильного течения раневого процесса необходимо обеспечить должную санацию раневого канала, нивелировать воспалительные процессы и купировать развитие патогенной микрофлоры, скорректировать режим влажности и предотвратить избыточную грануляцию тканей в ходе смещения краевой зоны эпителия.
В процессе вазодилатации происходит выделение раневого экссудата [4]. При длительном течении раны его содержание в раневом канале интенсифицируется, в связи с чем, встает необходимость его сорбции для поддержания подходящего режима влажности, снижения мацерации и предотвращения зуда. Для этого в качестве материала основы ранозаживляющего препарата подбирают материал, обладающий хорошими сорбционными свойствами. Биополимеры, чаще всего полисахариды, часто используются при лечении гнойных ран за счет их биосовместимости, биодеградируемости и низкой токсичности. В наших предыдущих работах был обоснован выбор диальдегидцеллюлозы в качестве матрицы для иммобилизации последующих терапевтических агентов [6].
Применение энзиматического метода при лечении ран, т.е. удаление тканей с помощью ферментов и ферментных препаратов, является наиболее эффективным и при этом наименее болезненным для пациентов [7,8]. Для очищения девитализированных тканей сегодня используют протеолитические ферменты, которые являются наиболее лабильной
составляющей комплексных препаратов. Лечебное действие ферментных препаратов осуществляется через влияние на стадию воспаления. Ферментативные комплексы снижают инфильтрацию интерстиция плазматическими белками,
способствуют выведению белкового детрита с раневой поверхности. Одновременно с этим повышается снабжение прилегающих тканей кислородом и повышение циркуляции физиологических жидкостей. Системные гидролазы реализуют механизм дренажирования венозной и лимфатической системы, не давая сместиться раневому процессу в сторону хронического течения [9,10].
Бромелаин (Бр) - фермент: высокомолекулярный гликопротеид, получаемый путем экстракции из сока зеленых плодов ананаса. Расщепляет белки до поли-олигопептидов. В отличие от протеиназ животного происхождения, бромелаин активен при достаточно широком диапазоне рН (3,0-8,0). Бромелаин, согласно литературе [11,12], деполимеризует межклеточные структуры и способствует изменению проницаемости сосудов; оказывает
противовоспалительное и иммунокорригирующее действие. Данные свойства обусловлены его воздействием на метаболизм арахидоновой кислоты. Все вышеперечисленное делает его подходящим агентом для очищения и заживления гнойно-некротических ран и трофических пролежней. Мочевина - хорошо известное вещество, достаточно давно применяющееся в фармакологии. В литературе показано [13] что, мочевина разрушает водородные и дисульфидные связи, обусловливающие вторичную и третичную структуры белковой молекулы, при этом происходит изменение конфигурации белковых молекул, распад молекул на отдельные крупные фрагменты. Мочевина известна как сильный денатурирующий агент для белков [14], поэтому ее применяют при лечении гнойных ран в качестве средства с кератолитическим действием [15]. При действии на протеазы денатурирующих реагентов типа мочевины или гуанидина гидрохлорида одной из причин быстрой инактивации является ускорение автолиза, что обусловлено увеличением денатурированной формы фермента, которая быстро гидролизуется нативным ферментом [14]. Однако клинические испытания первязочных средств содержащих мочевину показали их высокую эффективность при лечении трофических язв и ожоговых ран [13,15], что объясняется способностью мочевины увеличивать отток жидкостей из межклеточного пространства, обеспечивая противоотечный эффект [16]. Особый интерес представляет использование препаратов с мочевиной в случаях, когда избыточный гиперкератоз препятствует проникновению патогенетических наружных средств в кожу в местах её поражения или мешает удалению поражённых участков, например, при гиперкератотической форме микозов гладкой кожи [16,17].
Экспериментальная часть.
Исследованный ферментный комплекс - бромелаин представляют собой смесь различных ферментов. Как уже было отмечено ранее, очищение ран от раневого экссудата осуществляется преимущественно за счет действия протеолитических ферментов.
Использованный для исследования метод ИК-спектрометрии является чувствительным к наличию различных примесей, что осложняло изучение ферментных комплексов. Приведенные на рисунке 1 спектры бромелаина, а также его смеси с хитозаном являются малоинформативными в связи с присутствием широкого ряда соединений в ферментных комплексах и низкой концентрацией анализируемых веществ, недостаточной для установления наличия взаимодействий и их характера. В связи с чем, было необходимо провести дальнейшие исследования по изучению взаимодействия бромелаина с ТА.
мм «00 МСО ЖЮ 2000 1500 1000 5011
Рисунок 1. ИК-спектры пленок хитозана, бромелаина, бромелаин-цистеин, бромелаин-хитозан-цистеин.
Для определения инактивирующего воздействия добавленного ТА он был растворен в 1/15 М растворе фосфатного буфера нужного значения рН в заданном соотношении, при необходимости полученный раствор доводили до комнатной температуры. К заданному объему раствора фермента добавляли раствор ТА в ФБ. Выдерживали при заданной температуре и времени, и определяли остаточную ферментативную активность. За 100% принимали значение активности до воздействия ТА и (или) температуры. Полученные данные приведены в таблицах 1-4.
Таблица 1. - Действие растворов Ь-цистеина на
ферментативную активность немодифицированногоБрм* (субстрат казеин)
Ссуз, мМ 0 0,73 5,08 10,9 14,52
А1/Ао 1,0 2,81 4,07 4,38 4,17
*0,1 мг Брм в пробе.
Таблица 2. - Действие растворов мочевины на
ферментативную активность немодифицированногоБрм* (субстрат казеин)
Таблица 3. - Действие растворов мочевины на
ферментативную активность немодифицированного Брм* (субстрат BApNA)
Таблица 4. - Действие растворов мочевины на ферментативную активность Брм*, модифицированного Cys 10 mM (субстрат BApNa)
*2 мг Брм в пробе.
Как видно из полученных данных цистеин активирует молекулу Брм. Действие мочевины при использовании синтетического субстрата ингибирует
ферментативную активность. При использовании белкового субстрата (казеина) происходит возрастание активности, за счет разрыхления структуры казеина и его большей доступности. Хт не влияет на ферментативную активность Брм (массовое соотношение до 10:1, субстрат казеин). Было рассмотрено влияние различной температуры и длительности ее воздействия на инактивацию Брм в присутствии различных ТА. Температура - один из важнейших факторов, влияющих на ферментные препараты, также с помощью повышения температуры на определенной время можно спрогнозировать стабильность препарата при условиях хранения в течение срока годности (метод «ускоренного старения»).
Инактивация ферментов при повышенных температурах рассматривается как реакция первого порядка с эффективной константой скорости инактивации к инь Белок необратимо переходит в денатурированную форму. Нами была выбрана температура 55 °С для определения границ устойчивости препарата. Полученные данные представлены в таблице 5.
0 - коэффициент стабилизации равный отношению эффективной константы скорости термоинактивации Брм в присутствии того или иного агента, и без него (0 = кт/ кт Брм). Если 0 меньше 1 происходит стабилизация фермента.
Как видно из полученных данных мочевина способствует инактивации Брм. Ни хитозан, ни цистеин (в исследованных концентрациях) не обладают протекторным действием Брм от воздействия мочевины.
Смоч, М 0 0,405 4,05 8,1 12,1500
Смоч, М/проба 0 0,198 2 4,05 6
Ai/Ao 1 0,97 1,27 1,6100 1,92
*2 мг Брм в пробе.
Смоч, М 0 0,405 4,1 8,3 12,4
Смоч, М/проба 0 0,202 2,070 4,14 6,210
Ai/Ao 1 0,9 0,66 0,5100 0,44
*2 мг Брм в пробе.
Смоч, М 0 0,405 4,1 8,3 12,4
Смоч, М/проба 0 0,202 2,070 4,14 6,210
Ai/Ao 1 0,94 0,8 0,6300 0,48
Таблица 5 - Термоинактивация р-ров Бромелаина, как нативного так и с модификацией активатором, в
присутствии р-ра мочевины различных концентраций.
Система Концентрация Brm, мг/мл Концентрация Моч, М pH Температура, °С в
Brm-Моч 0,4 - 8,0 55 1
0,4 0,3 8,0 55 1,11
4 - 8,0 55 1,06
4 3 8,0 55 1,26
Brm-Хт-Моч 0,4 - 8,0 55 3,02
0,4 0,3 8,0 55 2,96
4 - 4,0 55 0,68
4 3 4,0 55 0,89
Brm-Cys-Моч 0,2 - 8,0 55 1,42
0,2 0,15 8,0 55 0,96
0,4 - 8,0 55 1,30
0,4 0,3 8,0 55 0,60
4 - 8,0 55 0,66
4 3 8,0 55 1,31
Вгт-Моч-Cys 0,2 - 8,0 55 1,42
0,2 0,15 8,0 55 2,33
4 - 8,0 55 0,85
4 3 8,0 55 1,42
Заключение
На основе полученных данных можно сделать вывод, что мочевина способствует термоинактивации Брм (55°С, рН 6,2). А такие ТА, как цистеин и (или) Хт, не предотвращают ее инактивирующее воздействие на ферментативную активность.
Список литературы
[1] Snyder D, Sullivan N, Margolis D, Schoelles K. Skin Substitutes for Treating Chronic Wounds. Rockville (MD): Agency for Healthcare Research and Quality (US); 2020.
[2] Childs DR, Murthy AS. Overview of Wound Healing and Management. Surg Clin North Am. 2017;97(1):189-207.
[3] de Smet GHJ, Kroese LF, Menon AG, et al. Oxygen therapies and their effects on wound healing. Wound Repair Regen. 2017; 25(4):591-608.
[4] Gantwerker EA, Hom DB. Skin: histology and physiology of wound healing. Facial Plast Surg Clin North Am. 2011;19(3): 441-453.
[5] Schultz GS, Sibbald RG, Falanga V, et al. Wound bed preparation: A systematic approach to wound management. Wound Repair Regen. 2003;11(Suppl 1):P.1-P.28.
[6] Новые текстильные перевязочные материалы на основе биодеградируемых полимеров, содержащих протеиназы, для лечения ран и ожогов / А. А. Белов, А. А. Ванюшенкова, Э. Э. Досадина и др. // Раны и раневые инфекции. — 2018. — Т. 5, № 1. — С.16-26.
[7] Белов А.А. Текстильные материалы, содержащие иммобилизованные гидролазы для медицинских и косметологических целей. Получение. Свойства. Применение. //LAP LAMBERT Acad. Pub., GmbH &Co. KG, Germany. 2012. - 242 c.
[8] Sinclair R., Ryan T. Proteolytic enzymes in wound healing: the role of enzymatic debridement. // The
Australasian journal of dermatology, 1994. - V. 35. -Р.35-41.
[9] Desser L., Rehberger A., Paukovits W. Proteolytic enzymes and amylase induce cytokine production in human peripheral blood mononuclear cells in vitro // Cancer Biotherapy. 1994. Vol. 9. № 3, p. 253263. 140.
[10] Ефименко Н.А., Новожилов А.А., Кнорринг Г.Ю. Системная энзимотерапия в гнойной хирургии. // Стационарозамещающие технологии: Амбулаторная хирургия. 2005. № 3. С. 51
[11] Фидоровская Ю. С., Швыдкова Д. А., Медушева Е. О. Создание лечебных материалов на основе природных полимеров с использованием растительных протеиназ //Физика волокнистых материалов: структура, свойства, наукоемкие технологии и материалы (SMARTEX). - 2020. - №. 1. - С. 421-426.
[12] Максименя ГГ. Клинико-фармакологическая характеристика препаратов для обработки ран. Воен Медицина. 2014;(2):105-14.
[13] Юданова, Т.Н. Полимерные раневые покрытия с ферментативным и антимикробным действием: Дис. ... д-ра хим. наук: 02.00.06 / Т.Н. Юданова.- М., 2004.- 409 с.
[14] Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. -М.: Наука, 1971.- 404 с.
[15] Белов А.А. Разработка промышленных технологий получения новых медицинских материалов на основе модифицированных волокнообразующих полимеров, содержащих биологически активные белковые вещества // Дисс. на соис. уч. степ. докт. техн. наук М., РХТУ, 2009. 385 с.
[16] Машковский М.Д. Лекарственные средства. В двух частях. М.: Медицина, 1993. Часть 1. С.587-589.
[17] Альбанова В. И. Применение мази с мочевиной 30% в дерматологической практике //Бабухинские чтения - 2009. - Т. 4. - С. 83.
