Иммобилизация бромелаина на целлюлозные носители Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 577.15.08+606.61

Э.Э. Досадина, А. А. Белов*

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20 , корп. 1 * e-mail: abelov2004@ yandex.ru

ИММОБИЛИЗАЦИЯ БРОМЕЛАИНА НА ЦЕЛЛЮЛОЗНЫЕ НОСИТЕЛИ

В ходе данной работы были разработаны и синтезированы иммобилизованные препараты, содержащие хитозан и комплекс протеолитических ферментов бромелаин, изучены свойства полученных систем (добавление цистеина в качестве стабилизатора ферментов, термоинактивация препаратов, влияние способа иммобилизации на биологическую активность, падение активности при хранении материалов). Исследуемые системы при дальнейшей их разработке могут быть успешно использованы в будущем в медицине в качестве ранозаживляющих препаратов, обладающих всеми необходимыми параметрами подобных материалов.

Ключевые слова: протеолитические ферменты, бромелаин, иммобилизация, хитозан, целлюлоза, лечение ран, разработка новых материалов.

В современной медицине до сих пор остро стоит проблема создания универсального заживляющего средства для ожоговых и гнойно-некротических ран. Ряд требований, предъявляемых к подобным препаратов, весьма большой, а именно: неаллергенность, нетоксичность, биосовместимость и биодеградируемость, необходимость удаления раневого экссудата, предотвращение контаминации раневой поверхности, защита от механических повреждений и высыхания, ускорение сроков заживления посредством введения дополнительных лекарственных веществ, сохранение лечебного эффекта на протяжении всего срока хранения. Многочисленные разработанные сегодня ранозаживляющие препараты не обладают всеми вышеперечисленными свойствами, что делает дальнейшую разработку новейших подобных материалов актуальной и важной задачей современной науки и медицины.

Системная энзимотерапия в целом представляет собой метод лечебного воздействия с помощью составленной смеси чаще всего гидролитических ферментов растительного или животного происхождения, которые могут оказывать комплексное действие на основные

физиологические процессы. Такие

комбинированные ферментные препараты нашли свое применение в первую очередь в лечении заболеваний хирургическим методом [1]. В ответ на некоторое повреждение организм способен проявлять ответные неспецифичные защитные реакции. Последствием различных заболеваний, в особенности ранений и травм, является чаще всего воспалительный процесс, который может протекать с разной интенсивностью в зависимости от характера повреждения и особенностей организма. Препараты системной энзимотерапии способны ускорять процесс репарации тканей благодаря их способности уменьшать выраженность, а также оптимизировать непосредственно ход воспаления [1].

Бромелаин - это комплекс протеолитических ферментов растительного происхождения, выделяемый из стебля ананаса Ananas comosus. Он использовался как медицинское растение во многих племенах регионов с тропическим и субтропическим климатом, то есть при оптимальных условиях для роста ананаса. Лекарственные свойства растения приписываются также и бромелаину: комплекс обладает фибринолитическим, противоотечным, антитромбическим, а также противовоспалительным действием in vitro и in vivo [2]. По своему химическому составу бромелаин представляет собой высокомолекулярный гликопротеид [3]. Данный ферментный комплекс состоит из 4 цистеиновых протеиназ с похожей, но несколько различающейся аминокислотной последовательностью, что также влечет за собой и различие в протеолитической специфичности и чувствительностью к инактивации [2]. В клинических условиях использование бромелаина способно повышать скорость заживления ран, пролежней, трофических язв по средством очищения их от девитализированных тканей. В жизнеспособных тканях человека находятся ингибиторы протеаз, которые способны нивелировать действие ферментного комплекса, тем самым позволяя бромелаину расщеплять исключительно нежизнеспособные белковые массы и выделяемый детрит, оставаясь безопасным для здоровых тканей [3].

Одним из самых распространенных видов ранозаживляющих материалов являются покрытия на основе целлюлозы или ее модификаций [4]. Модификация целлюлозных носителей проводится с целью придать материалу новые химические свойства, например ввести определенные функциональные группы, упрощающие

иммобилизацию лекарственных средств за счет возникновения взаимодействия между носителем и активным веществом [4]. Также одним из самых перспективных на сегодняшний день полимеров, в который возможна иммобилизация ферментов и

других биологически активных веществ для дальнейшего их использования в лечении ожоговых и гнойно-некротических ран, является хитозан. Хитозан является биосовместимым,

биодеградируемым, нетоксичным материалом. разрешенным к медицинскому применению. который также обладает антибактериальной активностью [5].

Из литературы [6] известно, что многие ферменты активируются в присутствии специальных соединений (активаторов). Для протеолитических тиоловых ферментов таковыми являются вещества. содержащие свободные БИ-группы (глутатион или цистеин). Активирующее действие подобных веществ заключается в их способности восстанавливать дисульфидные связи фермента с образованием БИ-групп, необходимых для проявления его каталитической активности. Цистеин является активатором для ряда ферментных препаратов растительного происхождения, таких как папаин, фицин и бромелаин, относящихся также к тиоловым протеиназам (содержащих в активном центре цистеин).

Была установлена оптимальная концентрация цистеина для исследуемых условий, а также определено, что способ иммобилизации также влияет на сохранение активности системы. Была установлена оптимальная схема совместной иммобилизации хитозана, бромелаина и цистеина.

Разработанные гелевые системы далее были иммобилизованы на различные целлюлозные носители: целлюлозу, окисленную целлюлозу -диальдегидцеллюлозу (ДАЦ). Для определения необходимых для производства технологических параметров, таких как время взаимодействия растворов систем с носителями была изучена кинетика иммобилизации этих систем на целлюлозные матрицы.

На окисленную целлюлозу иммобилизуется наибольшее количество фермента, что объясняется тем, что связывание бромелаина с матрицей носителя происходит в большей степени за счет образования ковалентных связей, а не физической сорбции. В случае иммобилизации

немодифицированного Брм на ДАЦ(0,26)-Хт связывание фермента происходит не только с матрицей носителя, но и с аминогруппами хитозана.

М/Ло

гель Хт-Брм

10

20

30

40

50

60

70

Сеу8, мМ

Рис.1. Зависимость относительной ферментативной активности системы от концентрации цистеина (Суз)

1.2 1

0.8

0.6 0.4 0.2 0

Л/Ло

- Брм

Ц(0,008)

ДДАЦ(0,26)

ХДАЦ(0,26)-Хт

ДАЦ(0,26)*

0.5

1.5 2 2.5 3 время, час

3.5

4.5

Рис.2. График зависимости изменения ферментативной активности растворов немодифицированного Брм (в 0,1М №С1) и растворов бромелаина в присутствии целлюлозного носителя (в процессе иммобилизации на различные целлюлозные носители) во времени (* - на ДАЦ(0,26) иммобилизовали гель Хт-Брм)

6

4

2

0

0

0

1

4

5

После иммобилизации высушенные препараты хранились в темной месте при комнатной температуре. Проводились измерения

ферментативной активности материалов при хранении и рассчитаны эффективные константы инактивации (ка - при высушивании (около 20 часов), к1 - при хранении).

Таким образом была разработана оптимальная система ДАЦ-Брм-Хт-Су8 с минимальным значением эффективной константы инактивации, соответствующей наименьшему падению

ферментативной активности в заданный промежуток времени. При дальнейшей разработке и улучшении некоторых свойства полученной композиции возможно ее успешное применение в медицине в качестве лечебного слоя перевязочных материалов для ранозаживления.

Таблица 1. Величины эффективных констант скорости инактивации (мес-1) полученных препаратов в процессе высушивания и хранения (при 25°С)._

Образец kd k1

ДАЦ(0,28)-Брм 32,40 0

ДАЦ(0,28)-{Брм +Хт} 29,86 0,80

ДАЦ(0,28)-Хт-Брм 20,22 0

Ц(0,008)-Хт-Брм^ 0 3,80

ДАЦ(0,28)-Хт-Брм^ 0 0

Для альдегидсодержащих носителей в скобках приведены значения количества альдегидных групп мМ/г носителей.

Досадина Элина Эльдаровна, студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва Белов Алексей Алексеевич д.т.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И.Менделеева, Россия, Москва

Литература

1. Протеолитические энзимы в хирургии: исторические аспекты и современные представления о применении / Ефименко Н.А., Лысенко М.В., Стернин Ю.И. [и др.] // Русский медицинский журнал. -2011. - Т.19. - №5. - с. 368-372;

2. Bromelain: A natural proteolytic for intra-abdominal adhesion prevention / A. Sahbaz, O. Aynioglu, H. Isik et al. // International journal of surgery - 2015. - №14. - P.7-11;

3. Полиферментные препараты в гнойной хирургии: методические рекомендации / А.А. Новожилов, Г.Ю. Кнорринг, А.Л. Сухоруков [и др.]; под ред. проф. Н.А.Ефименко. - М.: 2005. - 30с.

4. А.А. Белов. Текстильные материалы, содержащие иммобилизованные гидролазы для медицинских и косметологических целей. Получение. Свойства. Применение. //LAP LAMBERT Acad. Pub., GmbH &Co. KG, Germany - 2012. - 242 c.;

5. S.P.Miranda Castro, E.G.Lizarraga Paulin. Is Chitosan a New Panacea? Areas of Application // Desiree Nedra Karunaratne "The Complex World of Polysaccharides" - InTech. - 2012. - P.3-46 (Chapter 1);

6. Proteinase activity and stability of natural bromelaine preparations / L.P. Hale, P.K. Greer, C.T. Trinh et al. // International Immunopharmacology. - 2005. - №5. - P. 783-793;

DosadinaElinaEldarovna, Belov Alexey Alexeevich*

D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia.

*e-mail: abelov2004@ yandex.ru

IMMOBILIZATION OF BROMELAIN ON CELLULOSE CARRIERS

Abstract

In this research we designed and synthesized immobilized materials containing chitosan and complex of proteolytic enzymes bromelain. We studied properties of obtained systems (addition of cysteine as an enzymes stabilizerm thermoinactivation of materials, effect of the way of immobilization on biological activity, activity loss during materials storing). The following researches can lead to successful using of these materials as wound healing materials in medicine in future.

Key words: proteolytic enzymes, bromelain, immobilization, chitosan, wound healing, cellulose, new materials design.