CC BY
24
УДК 577.15.08+606.61 Матиев О.В, Белов А.А.
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ПАПАИНА НА ХИТОЗАН
Матиев Олег, студент 2-го курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Белов Алексей Алексеевич, д.т.н., профессор кафедры биотехнологии, *E-mail: ABelov2004@ yandex.ru Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
Изучено действие на ферментативные активности папаина, как самого хитозана так и его структурных единиц . Было установлено, что глюкозоамин и хитозан активируют энзим . Установлено, что иммобилизация папаина на хитозане способствует стабилизации ферментативной активности при термоинактивации . Ключевые слова: хитозан, папаин, глюкозоамин, инактивация, активация, материалы для ранозаживления.
IMMOBILIZATION OF PAPAINE ON CHITOSAN
Matiev O., Belov A.A.*
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. *e-mail: abelov2004@ yandex.ru
The effect of both chitosan itself and its structural units on the enzymatic activities of papain has been studied. It was found that glucosamine and chitosan activate the enzyme. It was found that the immobilization of papain on chitosan promotes the stabilization of enzymatic activity during thermal inactivation.
Keywords: chitosan, papain, glucosamine, inactivation, activation, materials for wound healing
Введение
В последнее время большое внимание уделяется применению протеолитических ферментов в комплексной терапии различных заболеваний [1,2]. Отечественной и мировой промышленностью выпускается большое количество лекарственных препаратов содержащие как индивидуальные ферменты, так и их природные и искусственные смеси [3]. Папаин (Пап) в качестве терапевтического агента используется в различных медицинских и косметологических средствах, благодаря широкой субстратной специфичности, доступностью и невысокой стоимости. Папаин разрушает белковые токсины многих возбудителей инфекционных заболеваний, в том числе столбняка [2]. Полисахариды широко используются в качестве носителей лекарственных средств [1]. В настоящее время во всем мире отмечается возрастание интереса специалистов к препаратам на основе хитина (в основном ракообразных), его производным и возможностям их использования в различных областях медицины, биотехнологии, сельском хозяйстве и др. Для практического применения наиболее важным производным хитина, является хитозан (Хт), который в отличие от хитина, растворим в разбавленных кислотах, что расширяет возможности его практического применения. Благодаря своей химической природе, хитозан способен к различным видам взаимодействия с образованием 4 основных типов связей: ионных, водородных, гидрофобных, связей по типу комплексообразования, в котором Хт выступает в роли комплексообразователя [4]. Для биомедицины, особую актуальность приобретает целенаправленное изучение закономерностей получения
хитозансодержащих ферментных материалов, а также поиск путей регулирования ферментативной
устойчивости материалов, полученных на основе хитозана и различных терапевтических агентов (ТА). Экспериментальная часть
Ферментативные активности определяли аналогично [1] используя в качестве субстрата либо, казеин, либо азоколл, либо BApNa в 1/15М фосфатном буферном растворе (ФБ) рН-8,0. Иммобилизацию в хитозан проводили аналогично [1], смешивая растворы Хт заданной концентрации и ТА (время взаимодействия не менее 15-20 минут). Для получения препаратов в виде пленок, раствор необходимого состава наносили пипетманом (50-200мкл) на чистую полиэтиленовую подложку и высушивали на воздухе, хранили в закрытом виде при комнатной температуре, в темноте. В специально проведенных опытах было установлено отсутствие влияния полиэтиленовой подложки на ферментативные активности использованных энзимов. УФ-Вид измерения выполнялись с помощью регистрирующего спектрофотометра фирмы Shimadzu ЦУ-2600 (Япония).
Было установлено что, глюкоза и К-ацетил глюкозамин (возможные структурные единицы Хт) не оказывают влияние на ферментативные активности папина (время взаимодействия 0,15-1,0 ч при 25°С). Для папаина глюкозамин является активатором. На рис.1 приведены полученные данные о влиянии Хт на ферментативную активность папаина. Как видно Хт является активатором Пап, аналогично глюкозамину рис.2. В литературе показана активация папаина различными веществами [5]. Механизм активации неактивного (малоактивного) фермента связывают в основном с восстановлением сульфгидрильной связи.
На рис. 3 приведены UV-Vis спектры растворов Пап и Хт. Как видно из полученных данных наличие в исследуемом спектре всей совокупности полос с
совпадающими (с точностью до 1 нм) положениями максимумов и значениями максимальных коэффициентов экстинкции (с точностью до 10%) свидетельствует о тождественности исследуемого и сравниваемого соединений. Появление лишних полос или увеличение интенсивности отдельных максимумов может быть вызвано наличием
межмолекулярных взаимодействий в исследуемом растворе. Небольшой сдвиг в области 200нм может происходить в следствии локального изменения рН, либо отражает слабые невалентные взаимодействия, либо образование олигохитов вследствие деполимеризации Пап хитозана.
1.4 1.3 1.2 1.1 1 0.9 0.8 0.7 0.6
10 15 20 25
соотношение (масс) Хт:фермент
Рис. 1. Изменение ферментативной активности (А/Ао) при взаимодействии Хт и некоторых протеаз (субстрат казеин)
1.6 А/Ао
1.4 1.2
—Í-
■ А
0.4 0.2
Гла
Гл
▲ КГла
0 20 40 60 80 100
сотношение (масс) структ ед: папаин
Рис. 2. Изменение ферментативной активности (А/Ао) при взаимодействии растворов глюкозы или N-ацетил глюкозамина с папаином (субстрат азоколл)
2,800
2,000
1,000
0,000
250,00 300,00
нм.
Рис. 3. UV-Vis спектры растворов хитозана, папаина, цистеина и их смеси
Как следует из полученных нами данных [6], иммобилизация на Хт Пап сдвигает рН-оптимум ферментативной активности в кислую область, что может свидельствовать о наличии на матрице положительного заряда (непрореагировавшие аминогруппы хитозана). И как следствие отсутствие ион-ионного взаимодействия между ферментом и Хт. Во внешней оболочки Пап находятся положительно заряженные аминокислоты - так изоэлектрическая точка (р1) папаина составляет 8,75 [7], и это в основном остатки е-ЫИг лизина вследствие чего не возможно образование полиэлектролитного комплекса с Хт.
Одна из целей которую преследует иммобилизация ферментов, это стабилизация белка против денатурационного воздействия. Температура
является мощным фактором денатурации. Нами было исследовано влияние температуры и времени нахождения папаина и его модифицированных форм в растворе 1/15М ФБ (рН 6,2 - модель гнойной раны). Полученные данные представлены в таблице.
Таблица 1. Стабилизация (0) раствора папаина цистеином и (или) хитозаном в 1/15М ФБ (6,2) растворе при термоинактивации при 25, 37, 45°С в течении 24 часов (субстрат азоколл)
препарат температура инактивации
25 °С 37 °С 45°С
папаин 1 1 1
папаин + 5мМцис 0,04 0,5 0,75
папаин+Хт 0,33 0,05 0,24
папаин+Хт+ 0 0 0
5мМцис
0 - коэффициент стабилизации равный отношению эффективной константы скорости термоинактивации папаина в присутствии того или иного агента, и без него (0 = кт/ кт рар). Если 0 меньше 1 происходит стабилизация фермента.
Инактивация Пап характеризуется константой скорости первого порядка мономолекулярного процесса денатурации ферментов. Линейность полученных зависимостей в координатах логарифма обратной относительной активности от времени термоинактивации свидетельствуют о кинетике инактивации первого порядка.
Как отмечают многие авторы [8] Хт может деполимеризоваться протеазами. Также
деполимеризация Хт происходит и при длительном нахождении в растворе, в том числе в водном
1
0.8
0.6
0
0.5
190,00
350,00
растворе уксусной кислоты. В ходе деструкции макромолекулы Хт, становятся доступными активные группы, которые могут влиять на ферментативную активность фермента. Олигохиты это прекрасные стимуляторы ранозаживления.
Заключение
В процессе иммобилизации папаина на хитозане, возможна деполимеризация полисахарида и активация и (или) стабилизация энзима при термоденатурации и в процессе хранения.
Список литературы
[1] Белов А.А. Разработка промышленных технологий получения новых медицинских материалов на основе модифицированных волокнообразующих полимеров, содержащих биологически активные белковые вещества // Дисс. на соис. уч. степ. докт. техн. наук М., РХТУ, 2009. 385 с.
[2] Полиферментные препараты в гнойной хирургии: Методические рекомендации. / Под ред. член-корр. РАМН Н.А.Ефименко.- М., 2005.- 32 с.
[3] Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна. 15-е изд. 2006. - 1206 с
[4] Грядских Д.А. Синтез композиционных аффинных сорбентов с магнитными свойствами и их технологическое использование при изготовлении чумных иммунобиологических препаратов: дис. ... канд. биол. наук / Грядских Д.А. - Ставрополь, 2004. - С. 153.
[5] Mireille St-Vincent and Michael Dickman Chemical modification of papain and subtilisin: an active site comparison //Journal of Chemical Education, 2004. Vol. 81. No. 7 July, Р. 1048-1050.
[6] Матиев О.В., Белов А.А. Стабилизация протеаз хитозаном и различными терапевтическими агентами // Химия и технология биологически активных веществ для медицины и фармации: тезисы докладов I Школы молодых ученых - М.: РХТУ им. Д. И. Менделеева, 2021. - С. 60.
[7] Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука. 1971. 414с.
[8] Kumar A.B. Vishu, Tharanathan R.N. A comparative study on depolymerization of chitosan by proteolytic enzymes //Carbohydrate Polymers 2004, 58, Р.275-283.
