CC BY
42
Е. В. Москвичев1, Л. М. Меркулова2, Г. Ю. Стручко2
ВЛИЯНИЕ ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНОДЕФИЦИТА НА АПОПТОЗ И КЛЕТОЧНУЮ ПРОЛИФЕРАЦИЮ В ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЯХ*
1 Республиканский клинический онкологический диспансер Министерства здравоохранения Чувашской республики
2 ГОУ ВПО Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова, Чебоксары
Ведение. В здоровом организме постоянно происходят различные хромосомные мутации, которые, однако, не приводят к развитию онкологических заболеваний. Это обусловлено регулирующей деятельностью генов апоптоза ^53, p21, p27 и др.), а также кодируемых ими белков. При повреждении ДНК эти белки запускают либо репарацию и последующую репликацию ДНК с ее «выздоровлением», либо, при необратимом повреждении, запрограммированную гибель клетки [1]. Бесконтрольное деление опухолевой клетки начинается в том случае, если гены апоптоза перестают распознавать мутированные участки ДНК либо наступает их блокада. К веществам, блокирующим апоптоз, реализуемый геном p53, относятся белки Ьо1-2, MDM-2, некоторые цитокины, вирусы и др. [2]. Помимо механизма запрограммированной клеточной гибели, регулируемого p53, существуют альтернативные пути запуска апоптоза. Установлено, что апоптоз могут инициировать цитокины (трансформирующий фактор, эпидермальный фактор роста, фактор некроза опухолей) и интерфероны, продуцируемые клетками иммунной системы [3]. Таким образом, программа запрограммированной гибели клетки является многоуровневым механизмом защиты для поддержания клеточного гомеостаза организма, который регулируется как внутриклеточными, так и внеклеточными факторами при участии иммунокомпетентных клеток [4].
Считается, что снижение защитных сил организма является предрасполагающим фактором к развитию онкозаболеваний [5]. Однако в доступной нам медицинской литературе мы встретили лишь единичные работы, посвященные изучению канцерогенеза при иммуносупрессии [6]. В основном описывались наблюдения за отдельными пациентами, которые не проводились серийно, что, конечно, не может достоверно отражать взаимосвязь этих процессов. В наших предыдущих работах было показано, что удаление селезенки приводит к выраженному изменению показателей системы крови, угнетению иммунитета и развитию акцидентальной инволюции центрального органа иммуногенеза — тимуса [7]. Поэтому целью нашего эксперимента явилось исследование канцерогенеза опухолей желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) у крыс, индуцированных 1,2-диметилгидрозином в условиях приобретенного иммунодефицита после удаления селезенки.
Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 60 белых крысах-самцах. Уход и содержание животных проводили в соответствии с правилами содержания лабораторных животных. Крысы были разделены на 4 группы. Первая — ин-тактные животные (15 крыс), вторая — животные после удаления селезенки (15 крыс). Крысам первой и второй групп (контрольные животные) вводили изотонический рас-
* Исследование проведено при поддержке гранта Президента РФ МД-5000.2008.7.
© Е. В. Москвичев, Л. М. Меркулова, Г. Ю. Стручко, 2010
твор хлорида натрия. Третья группа — интактные животные с внутрибрюшинным введением канцерогена (1,2-диметилгидразин) из расчета 20 мг/кг 1 раз в неделю в течение четырех недель (15 крыс). Четвертая группа — спленэктомированные животные, которым через 30 суток после операции вводили канцероген в вышеуказанной дозе и интервалах (15 крыс). Выведение животных третьей и четвертой групп (опытные животные) из эксперимента проводилось через 90 и 150 суток после окончания введения курса канцерогена. Объектом исследования служили внутренние органы и новообразования.
В работе использованы следующие методы:
1. Иммуногистохимический метод [8] с использованием моноклональных антител к белку апоптоза p53.
2. Иммуногистохимический метод с использованием моноклональных антител к маркерам клеточной пролиферации PCNA и Ki-67. Для выявления иммуногистохи-мических реакций в работе применялась система визуализации LSAB-2. В качестве внутреннего контроля реакции служила неиммунизированная кроличья сыворотка. Результаты реакций оценивали, подсчитывая количество окрашенных ядер на 100 ядер в трех полях зрения и выражая полученные результаты в процентах.
3. Окраска гематоксилином-эозином [9] для изучения общегистологической картины и проведения морфометрических исследований. На светооптическом микроскопе оценивали степень дифференцировки опухоли, характер изменений покровного эпителия, желез согласно рекомендациям ВОЗ (2005).
4. Морфометрический метод [10] с использованием пакета программ Sigma Scan Pro, для определения ядерно-цитоплазматического соотношения и количественных характеристик иммуногистохимических реакций.
5. Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программ Microsoft Office 2007, статистическая значимость определялась по t-критерию Стьюдента.
Результаты. При исследовании органов ЖКТ у интактных крыс эпителий пищевода, желудка, тонкой и толстой кишки дает позитивную иммуногистохимическую реакцию к маркерам клеточной пролиферации в виде равномерного окрашивания ядер клеток. В желудке позитивная реакция выявлялась в покровном эпителии и, в меньшей степени, в собственных железах слизистой оболочки. В эпителии тонкой и толстой кишки реакция ядер отмечена в железах ворсинок и крипт. В пищеводе маркеры клеточной пролиферации давали позитивную реакцию лишь в клетках базального слоя. Наибольшая интенсивность реакции (до 30% эпителиальных клеток) отмечена в тонкой и толстой кишке, наименьшая — в эпителии пищевода (менее 5%). Белок апоптоза p53 выявляется в виде равномерного окрашивания ядер в единичных клетках базального слоя эпителия и клетках стромы всех отделов ЖКТ крыс (рис. 1).
Введение канцерогена существенно изменяет морфологическую картину органов у животных обеих экспериментальных групп. Через 3 месяца в эпителии толстой кишки отмечается формирование пролифератов крипт с признаками клеточной дисплазии различной степени. В подслизистом слое вокруг пролифератов отмечается выраженная воспалительная инфильтрация с образованием лимфоидных узелков. В дистальном отделе пищевода наблюдается очаговая лейкоплакия с признаками вирусного поражения эпителия в виде койлоцитоза и избыточного накопления гранул кератогиалина в цитоплазме клеток, аналогичные таковым у человека при инфицировании вирусом папилломы (рис. 2). Иммуногистохимическая реакция к маркерам клеточной пролиферации демонстрирует яркую позитивную реакцию в ядрах железистых пролифератов.
Рис. 1. Ядерная реакция единичных базальных клеток к p53 у неопериро-ванных крыс через 90 суток после введения канцерогена. 1-единичные p53 позитивные клетки. Иммуногистохимическая реакция к белку p53. Увеличение 400
Рис. 2. Грубая лейкоплакия и койлоцитоз эпителия пищевода у спленэктомиро-ванных крыс через 90 суток после введения канцерогена. 1 — лейкоплакия, 2 — гранулярные включения в цитоплазме клеток, 3 — койлоциты.
Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение 400
Ю-67 выявляется более чем в 30% клеток, PCNA — более чем в 50%. Пролиферация клеток эпителия пищевода также значительно выше, чем у интактных крыс. У сплен-эктомированных животных отмечается увеличение экспрессии белка апоптоза p53, который выявляется в ядрах желез пролифератов, а также очагово в эпителии пищевода, окрашивая до 15% ядер (рис. 3). В эпителии желудка достоверных отличий морфологического строения по сравнению с животными контрольных групп не выявлено.
Рис. 3. Повышенная реакция к p53 в эпителии пищевода у спленэктоми-рованных крыс через 90 суток после введения канцерогена. 1 — p53 позитивные ядра. Иммуногистохимическая реакция к белку p53. Увеличение 400
Рис.4. Гиперэкспрессия белка p53 в ядрах аденокарциномы толстой кишки у спленэктомированных крыс через 150 суток после введения канцерогена.
1 — p53 позитивные ядра. Иммуногистохимическая реакция к белку p53. Увеличение 400
Через 5 месяцев у крыс экспериментальных групп формировались от одной до трех макроскопически определяемых опухолей проксимального отдела толстой кишки размером от 0,4 до 0,6 см. Гистологически новообразования имели структуру высокодифференцированной аденокарциномы. Отмечалась глубокая инвазия опухолевых клеток в стенку кишки с переходом на околокишечную клетчатку. У двух спленэктомирован-ных животных (13%) обнаружены метастазы в печень, тогда как у неоперированных
крыс метастазы не определялись. Регионарные лимфатические узлы у животных обеих групп были интактны. Иммуногистохимическое исследование опухолей толстой кишки выявило повышенную ядерную реакцию к p53 у 74% спленэктомированных крыс и лишь у 42% неоперированных животных (рис. 4). Белок p53 был также выявлен в метастазах опухоли. Маркеры клеточной пролиферации демонстрировали яркую реакцию ядер —100% клеток к PCNA и 56% — к Ю-67. Почти у половины крыс после спленэк-томии (46%) помимо опухолей толстой кишки отмечены множественные изъязвления слизистой оболочки дистального отдела пищевода. При микроскопическом исследовании в них выявлялись признаки грубой лейкоплакии с папилломатозом и акантозом, а также тяжелой дисплазии многослойного плоского эпителия. У двух животных (13%) изменения соответствовали внутриэпителиальному плоскоклеточному раку с очагами микроинвазии (рис. 5). При иммуногистохимическом исследовании белка p53 в зоне лейкоплакии пищевода отмечена яркая реакция ядер в базальном и парабазальном слое эпителия. В участках дисплазии и внутриэпителиальной карциномы — диффузная реакция 45% эпителиальных клеток.
Рис. 5. Участок микроинвазивной плоскоклеточной карциномы пищевода у спленэктомированных крыс через 150 суток после введения канцерогена. 1 — микроинвазивная карцинома, 2 — акантоз с дисплазией эпителия пищевода. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение 400
Обсуждение. Как показали наши исследования, злокачественные новообразования развиваются у крыс в обеих экспериментальных группах, но следует отметить, что у животных после спленэктомии канцерогенез протекает иначе, чем у неоперированных животных. Это проявляется в развитии синхронных опухолей различного гистогенеза в разных отделах ЖКТ, агрессивном морфологическом фенотипе опухолей и раннем появлении отдаленных метастазов.
По данным научной литературы, «дикий тип» — wt p53 — является одним из главных регуляторов апоптоза клеток, в том числе и опухолевых. Wt p53 является корот-коживущим белком и в норме практически не выявляется. В случае повреждения он трансформируется в «мутантный тип» — тЛ p53, который является долгоживущим и
хорошо выявляется иммуногистохимическими методами [11]. Есть данные, что гиперэкспрессия mt p53 часто сочетается с низкой дифференцировкой, высокой агрессивностью опухоли и плохим прогнозом [12].
Нами установлено, что опухоли у спленэктомированных крыс имеют гиперэкспрессию белка p53, а также повышенную реакцию к маркерам клеточной пролиферации Ki-67 и PCNA. Это согласуются с результатами Н. А. Горбань [13], где была обнаружена прямая зависимость уровня Ki-67 и PCNA от агрессивности роста опухоли. Высокую агрессивность течения опухолевого процесса подтверждают и обнаружение метастазов с аналогичным фенотипом в печени у крыс после спленэктомии, и отсутствие их у неоперированных животных.
Известно, что помимо повреждения гуморального звена иммунитета после спленэктомии отмечается дисбаланс между Th1 и Th2 Т-лимфоцитами со значительным снижением числа хелперных клеток [14]. Нарушением клеточного звена иммунитета можно объяснить массивное вирусное поражение эпителия пищевода. Вирусы содержат вещества, угнетающие деятельность wt p53, и способствуют его трансформации в mt p53 [2]. Это объясняет гиперэкспрессию белка p53 в развивающихся эпителиальных опухолях пищевода. Вероятно, спленэктомия способствует повреждению и альтернативного (цитокинового) пути запуска апоптоза через нарушение взаимодействия иммунокомпетентных клеток.
Таким образом, можно предположить, что удаление селезенки существенно изменяет и усугубляет течение опухолевого процесса через угнетение клеточного и гуморального иммунитета в сочетании с блокадой механизма запрограммированной гибели опухолевых клеток.
Литература
1. Sturnzbecher H., Deppert W. The tumors suppressor protein p53: relationship of structure to function (Review) // Oncology Reports. 1994. N1. P. 301-307.
2. Gao X., Hong K. Recessive oncogenes: current status// Pathology Oncology Research. 1995. Vol. 1, N1. P. 7-22.
3. Пальцев М.А., Иванов А. А., Северин С.Е. Межклеточные взаимодействия. 2-е изд., перераб. и доп. М., 2003. 288с.
4. Хеттс С. В. Умирать или не умирать. Описание апоптоза и его роли в протекании болезни. Журнал американской медицинской ассоциации // Россия (JAMA. Russia). 1998. №1. С. 12-26.
5. Фрейдлин И. С. Иммунная система и ее дефекты. СПб.: НТФФ «Полисан», 1998. 116 с.
6. Chung C. T., Bogart J.A., Adams J.F., Sagerman R.H., Numann P.J., Tassiopoulos A., Duggan D. B. Increased risk of breast cancer in splenectomized patients undergoing radiation therapy for Hodgkin’s disease // International Journal of Radiatherapy, Oncolology, Biology and Physiology 1997 Jan. Vol. 37, N 2. P. 405-409.
7. Стручко Г. Ю. Морфофункциональное исследование тимуса и иммунобиохимических показателей крови после спленэктомии и иммунокоррекции: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Саранск, 2003. 23 с.
8. Dabbs D. J. Diagnostics immunohistochemistry. Edinburg: Churchill Livingstone, 2002. 673 p.
9. Волкова О. В., Елецкий Ю. К. Основы гистологии с гистологической техникой. М.: Медицина, 1982. 304 с.
10. Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия. М.: Медицина, 1990. 384 с.
11. Steele R. J., Lane DP P53 in cancer: a paradigm for modern management of cancer // Surgery 2005. N 3. P. 197-205.
12. Wada R., Miwa H., Abe H. et al. The possible asoociation betweenexpression of p53 and development in depressed type colorectal carcinoma a jj Acta. Histocem.a.Cytochem. 1993. Vol. 26, N1. F. 21-26.
13. Горбань Н. А. Клинико-морфологическая и иммуногистохимическая характеристика и прогностические критерии плоскоклеточного рака гортани: Автореф. дис. . . . канд. мед. наук. М.: 2008. 25 с.
14. Павлова И. Е. Особенности функционирования иммунной системы после спленэктомии у пациентов с заболеваниями системы крови и травмами селезенки: Автореф. дис. . . . д-ра мед. наук, Санкт-Петербург, 2007. 37 с.
Статья поступила в редакцию 20 октября 2010 г.
