CC BY
77
УДК 616-018
М.Н. МИХАЙЛОВА, Г.Ю. СТРУЧКО, Л.М. МЕРКУЛОВА,
О.Ю. КОСТРОВА, Е В. МОСКВИЧЕВ, Е.Г. ДРАНДРОВА,
И.С. СТОМЕНСКАЯ
УЧАСТИЕ ДЕНДРИТНЫХ И НЕЙРОЭНДОКРИННЫХ КЛЕТОК ТИМУСА В РАЗВИТИИ ЕГО ИНВОЛЮЦИИ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ОПУХОЛИ ТОЛСТОЙ КИШКИ*
Ключевые слова: дендритные клетки, тимус, акциденталъная инволюция, спленэктомия.
С помощью ряда иммуногистохимтеских и люминесцентно-гистохимических методов исследования выявлено, что использование 1,2-диметилгидразина приводит к развитию акцидентальной инволюции тимуса на фоне роста злокачественной опухоли. При этом процесс развивается раньше и более выражен в группе животных со спленэктомией. На это указывают характерная цитоморфология тимусной дольки, уменьшение размеров коркового и диаметра мозгового вещества на фоне разрастания соединительной и жировой тканей, увеличение тучных клеток с преобладанием молодых недегранулированных форм, СВ68+-клеток и клеток АПУД-серии. Отмечены достоверное увеличение уровня гистамина, дисбаланс содержания серотонина, катехоламинов в дендритных клетках и тимоцитах мозгового и коркового вещества.
M.N. MIKHAYLOVA, G.Yu. STRUCHKO, L.M. MERKULOVA, О.Yu. KOSTROVA,
E.V. MOSKVICHEV, E.G. DRANDROVA, I.S. STOMENSKAYA INVOLVMENT OF DENDRITIC AND NEUROENDOCRINIC CELLS OF THYMUS IN THE DEVELOPMENT OF ITS INVOLUTION AGAINST THE FORMATION OF EXPERIMENTAL COLON CANCER
Key words: dendritic cells, thymus, accidental thymic involution, splenectomy.
Through a series of immunohistochemical and luminescent-histochemical methods of investigation revealed that the use of 1,2-dimethylhydrazine leads to accidental thymic involution against tumor growth. The process develops earlier and is more marked in the group of animals with splenectomy. This is indicated by the characteristic citomorphology of thymus lobes, reducing the size of the cortical and medullar diameter against proliferation of connective and adipose tissue, an increase of mast cells with a predominance of young non degranulated forms, CD68 +-cells and APUD series. In addition, as there was a significant increase in the level of histamine, an imbalance of serotonin, catecholamines in dendritic cells and thymocytes and cerebral cortex
Онкологические заболевания как причина смерти в развитых странах занимают одно из первых мест в мире. По мере старения людей опухолевые заболевания, особенно рак, учащаются. В последние десятилетия наблюдается тенденция к росту числа этих заболеваний среди лиц молодого возраста, поэтому проблема рака в настоящее время - одна из наиболее актуальных и сложных в медицине [3].
Канцерогенез - процесс многофакторный и многостадийный, включающий в себя цепь генетических и негенетических повреждений клетки, обратимый на ранних стадиях и прогрессирующий лишь у людей, подверженных риску [5, 9].
Иммунная реакция на опухолевый рост - сложный контролируемый процесс, обеспечиваемый слаженной работой ряда клеточных популяций и молекулярных медиаторов [4]. Важнейшая роль в противораковом иммунном ответе принадлежит тимусу, в котором происходит дифференцировка основных популяций Т-лимфоцитов при регулирующем влиянии эпителиальных и
Исследование выполнено по госконтракту № 02.740.11.0708 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.
дендритных клеток. Развитие опухоли происходит в результате неэффективности иммунного ответа или «ускользания» малигнизированных клеток от механизмов протовоопухолевого надзора [13, 19]. Известно, что при росте злокачественных опухолей паренхима тимуса замещается жировой и соединительной тканью [14]. Считается, что при развитии опухолей инволюция тимуса и связанное с ней нарушение пополнения периферических Т-лимфо-цитов лежат в основе развития Т-клеточного иммунодефицита [7]. Однако до сих пор ученые пытаются ответить на вопрос, что является причиной инволюции тимуса при опухолевом росте. Существуют гормональные и цитоки-новые гипотезы; предполагают также, что инволюцию тимуса могут вызывать продукты распада опухоли, компоненты внеклеточного матрикса, метаболические факторы, а также ростовой фактор сосудистого эндотелия, который продуцируется опухолевыми клетками [20].
Известно, что у лиц с различными формами иммунодефицитов отмечается повышенная заболеваемость злокачественными опухолями. Однако в литературе имеются лишь единичные работы, посвященные механизмам канцерогенеза на фоне иммунологической недостаточности [2]. В наших предыдущих работах было показано, что удаление селезенки приводит к развитию акцидентальной инволюции тимуса и угнетению иммунитета [12].
Поэтому всестороннее изучение акцидентальной инволюции тимуса в условиях развития опухоли является актуальным и перспективным и дает новое, более целостное представление о патогенезе злокачественного роста, что в дальнейшем позволит разработать более эффективные методы прогнозирования, мониторирования и лечения новообразований.
Цель исследования - оценка морфофункционального состояния тимуса при канцерогенезе на фоне иммунодефицита, вызванного удалением селезенки.
Материал и методы. Эксперименты выполнены на 68 белых нелинейных крысах-самцах массой 180-220 г, которые содержались в стандартных условиях вивария. Животные были разделены на три группы. Первая - ин-тактные крысы, которым для контроля вводили изотонический раствор хлорида натрия. Вторая группа - животные с внутрибрюшинным введением канцерогена (1,2-диметилгидразина) из расчета 20 мг/кг 1 раз в неделю в течение четырех недель. Третья группа - спленэктомированные животные, которым через 30 суток после операции вводили канцероген по такой же схеме. Выведение животных из эксперимента проводилось через 1, 2, 3, 4 месяца после окончания введения канцерогена. Объектом исследования служил тимус. При патоморфологическом исследовании учитывались частота развития новообразований у крыс, их локализация, морфологические особенности.
В работе использовались следующие методы:
1. Люминесцентно-гистохимический метод Фалька-Хилларпа - для избирательного выявления катехоламинов (КА) и серотонина (СТ) и метод Кросса, Еве-на, Роста - для избирательного выявления гистамина (ГСТ) в биоаминсодержащих структурах тимуса. Уровень биоаминов определяли с помощью микроскопа ЛЮМАМ-4 с использованием спектрофлуориметрической насадки ФМЭЛ-1А. Для оценки суммарно-направленного действия биогенных аминов использова-
лось соотношение (СТ+ГСТ)/КА, увеличение которого косвенно свидетельствует о подавлении функциональной активности клеток, снижение - о стимуляции.
2. Иммуногистохимические методы с использованием антител на С0-68. белок 8-100, синаптофизин. Материал для исследования фиксировали 10%-ным нейтральным формалином в течение 24 ч, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4 мкм, которые наносили на высокоадгезивные стекла и высушивали при температуре 37°С в течение 18 ч. Восстановление антигенной активности осуществлялось в цитратном буфере pH 6,0 в автоклаве при температуре 96°С в течение 20 мин с последующим остыванием в течение 90 мин. Для выявления иммуно-гистохимических реакций в работе применялась система визуализации Ь8АВ-2. В качестве внутреннего контроля реакции служила неиммунизированнная кроличья сыворотка. Результаты реакций оценивали, подсчитывая среднее количество единиц в 10 полях зрения.
3. Метод окраски полихромным толуидиновым синим по Унна для избирательного окрашивания тучных клеток тимуса.
4. Морфометрический метод с использованием программы Микро-Анализ для измерения размеров люминесцирующих гранулярных клеток, толщины коркового и площади мозгового вещества тимуса, а также количественных характеристик иммуногистохимических реакций.
Результаты исследования. При обработке срезов тимуса люминесцентногистохимическими методами у интактных крыс паренхима имеет желто-зеленую люминесценцию: мозговое вещество долек - более темную, корковое - более яркую. В паренхиме органа хорошо визуализируются яркие люминесцирующие гранулярные клетки (ЛГК), содержащие в своей цитоплазме гранулы беловатожелтого свечения. ЛГК кортико-медуллярной зоны более крупные, имеют неправильную овальную или полигональную форму. Диаметр этих клеток составляет в среднем 13,4 мкм. ЛГК располагаются в один ряд вокруг мозгового вещества в виде ободка. По локализации они соответствуют расположению клеток, дающих положительную реакцию на белок 8-100 -маркер дендритных клеток. По периферии дольки, в субкапсулярной зоне разбросаны более мелкие, беспорядочно расположенные ЛГК с гранулами зеленовато-желтого свечения. Диаметр субкап-сулярных клеток составляет в среднем 5,9 мкм. Параллельная постановка иммуногистохимических реакций показывает разнородность этих клеток: часть из них дают позитивную реакцию на СБ68, характерный для макрофагов, а другая часть положительна на синаптофизин, являющийся маркером нейроэндокринных клеток АПУД-серии.
Нами установлено, что изолированное введение канцерогена в 55,4% случаев приводит к формированию от одной до трех макроскопически визуализирующихся опухолей толстой кишки размером от 0,3 до 1 см. У спленэк-томированных животных частота развития опухолей возрастает до 64,3%. Гистологически новообразования имеют структуру высокодифференцированной аденокарциномы. Развитие опухоли сопровождается значительными изменениями морфологии и функционального состояния клеток тимуса.
Через 1 месяц после окончания курса изолированного введения канцерогена цитоархитектоника тимуса незначительно отличается от интактных жи-
вотных: в дольках хорошо визуализируется граница между корковым и мозговым веществом, ЛГК кортико-медуллярной зоны расположены не рядами, а небольшими скоплениями по 2-4 клетки. Иммуногистохимическая реакция не дает достоверных отличий в количестве клеток по сравнению с аналогичным показателем у интактных крыс соответствующего возраста.
Через 2 месяца количество ЛГК снижается, корковое и мозговое вещество плохо дифференцируются. Использование моноклональных антител на белок 8-100 и синаптофизин дает достоверное увеличение количества дендритных клеток и клеток АПУД-серии, в то время как число СБ68 клеток не отличается от нормы.
Через 3 месяца после введения канцерогена выявляются первые признаки акцидентальной инволюции тимуса: дольки деформируются, приобретают веретенообразную форму. Отмечается уменьшение размеров коркового и мозгового вещества, часто граница между ними не определяется, увеличиваются междоль-ковые септы, паренхима замещается жировой и соединительной тканью. Кроме того, значительно увеличивается количество мелких клеток кортико-медул-лярной и субкапсулярной зон, которые располагаются хаотично, иногда отдельными скоплениями до 10 клеток в поле зрения. При этом отмечается увеличение количества 8-100+ клеток на 36%, синаптофизин-позитивных клеток - более чем в 2 раза, в то время как число СБ68 клеток по сравнению с таковыми у интактных животных того же возраста достоверно не изменяется.
На более позднем сроке - через 4 месяца после введения канцерогена - при люминесцентной микроскопии на фоне деформации долек выявляется множество скоплений крупных ярко-желтых, наполненных гранулами ЛГК кортикомедуллярной зоны, наибольший диаметр которых достигает 22,3 мкм. Количество 8-100+ клеток возрастает в 3,8 раза. В субкапсулярной зоне увеличивается число ярких мелких клеток, вследствие чего люминесцентная картина напоминает «звездное небо». При этом иммуногистохимическими методами выявлено увеличение числа С068 в 1,7 раза, синаптофизин-позитивных клеток - в 3,3 раза, что напрямую коррелирует с увеличением количества ЛГК в тимусе.
У животных после удаления селезенки и введения канцерогена отмечаются выраженные морфологические изменения в тимусе. Уже через 2 месяца выявляются деформация долек, замещение паренхимы жировой и соединительной тканью, резкое увеличение числа мелких ЛГК субкапсулярной зоны - до 15 клеток в поле зрения. ЛГК кортико-медуллярной зоны на этом сроке расположены отдельными крупными скоплениями, диаметром до 20,7 мкм, плотно заполненными гранулами. Такая же картина отмечается у спленэктомирован-ных крыс и через 3 месяца после окончания курса введения канцерогена. Однако через 4 месяца в данной группе крыс наблюдается совершенно иная морфология ЛГК тимуса по сравнению с таковой при изолированном введении канцерогена: они становятся более разрыхленными, некоторые полностью распадаются на отдельные гранулы, сливающиеся с фоновым свечением тимоци-тов. На этом сроке дольки тимуса значительно деформированы, плохо определяются границы между корковым и мозговым веществом, большая часть паренхимы замещена жировой и соединительной тканью.
Среди биоаминсодержащих клеток в дольках тимуса всегда встречаются тучные клетки. При люминесцентной микроскопии эти клетки отличаются от других Л ГК тимуса. Они имеют овальную форму и обычно не люминесцирую-щее эксцентрично расположенное ядро. В цитоплазме различимы беловатожелтые гранулы одинакового размера. Для спленэктомированных животных характерны увеличение количества тучных клеток и повышение интенсивности их люминесценции через 2 и 3 месяца эксперимента. Окраска полихромным толуи-диновым синим показала достоверное увеличение в тимусе в первые три месяца эксперимента у спленэктомированных крыс по сравнению с группой с изолированным введением канцерогена недегранулированных Т-0 форм тучных клеток на 7-11% и дегранулированных Т-2 форм на 10-20%.
Проведенная цитоспектрофлуориметрия показала возрастание уровня биогенных аминов во всех исследуемых группах: при изолированном введении канцерогена максимальное увеличение уровня всех биогенных аминов (БА) в ЛТК кортико-медуллярной зоны и тучных клетках отмечается через 3 месяца, у спленэктомированных крыс в этих же клетках - уже через 2 месяца. ЛТК суб-капсулярной и корковой зон реагируют несколько иначе: изолированное введение канцерогена приводит к максимальному возрастанию в них серотонина (СТ) и катехоламинов (КА) через 2 месяца, гистамина (ГСТ) - через 3 месяца, в то время как на фоне удаления селезенки уровень всех БА максимален через 2 месяца, причем уровень ГСТ в них остается таким же высоким во все последующие сроки исследования. Следует отметить, что на поздних сроках после введения канцерогена на фоне спленэктомии, когда ЛГК кортико-медуллярной зоны разрыхляются и распадаются на отдельные гранулы, в ЛГК субкапсуляр-ной и корковой зон и тучных клетках наблюдается повторный значительный рост уровня ГСТ (в 2,03 и 2,29 раза, соответственно).
Несмотря на разнонаправленные изменения биогенных аминов в структурах тимуса, соотношение (СТ+ГСТ)/КА у спленэктомированных животных на всех сроках после окончания курса введения 1,2-диметилгидразина значительно выше, чем при изолированным введении канцерогена, и достигает максимальных значений через 4 месяца, что, вероятно, свидетельствует о большей иммуносупрессии на фоне удаления селезенки.
Обсуждение полученных данных. Полученные нами данные свидетельствуют о развитии акцидентальной инволюции тимуса на фоне роста злокачественной опухоли. При этом процесс развивается раньше и более выражен в группе животных со спленэктомией. На это указывают характерная цитоморфология тимусной дольки, уменьшение размеров коркового и диаметра мозгового вещества на фоне разрастания соединительной и жировой ткани, увеличение тучных клеток с преобладанием молодых недегранулированных форм, СБ68+-клеток и клеток АПУД-серии. Кроме того, отмечаются также достоверное увеличение уровня гистамина, дисбаланс содержания серотонина, катехоламинов в дендритных клетках и тимоцитах мозгового и коркового вещества.
Рост злокачественной опухоли может зависеть как от клеточных, так и от гуморальных факторов тимуса [7]. Существует гипотеза о том, что при опухолевом росте может усиливаться выход незрелых тимоцитов, которые мигрируют в опухоль, где поддерживают рост трансформированных клеток -
так называемая лимфозависимая фаза роста [17]. Опухолестимулирующее влияние незрелых Т-лимфоцитов может заключаться как в усилении роста самих опухолевых клеток, так и сосудов. Рост новообразований зависит от тимуса не только как органа, продуцирующего лимфоциты, но и как от железы, синтезирующей гормоны [1].
Таким образом, тимус играет двойственную роль при неопластическом процессе. С одной стороны - это несомненное опухолевогоддерживающее влияние железы в отношении роста новообразований, с другой - образующиеся в тимусе зрелые Т-лимфоциты являются основными клетками-эффекторами, осуществляющими цитотоксические реакции противоопухолевой защиты [7].
В наших предыдущих исследованиях установлено, что у животных после спленэктомии по сравнению с неоперированными крысами опухоли имеют более агрессивный фенотип, что проявляется в гиперэкспрессии пй р53 и раннем появлении отдаленных метастазов. Кроме того, у животных этой группы выявлено формирование синхронных опухолей пищевода, имеющих морфологию плоскоклеточной карциномы на фоне массивного вирусного поражения [8]. По литературным данным, удаление селезенки может привести как к угнетению иммунной системы и агрессии опухоли, так и к торможению ее развития [15, 18].
Механизмы развития акцидентальной инволюции тимуса на фоне развития опухоли и иммунодефицита до сих пор остаются до конца не выясненными. Одним из ведущих считается недостаточное поступление клеток-предшественников в тимус, которые сохраняются в костном мозге в достаточном количестве и функционально полноценны. Считается, что это может быть следствием миграции их в опухоль [16]. Кроме того, показано, что потенциальными индукторами инволюции тимуса при неопластическом процессе могут быть глюкокортикоидные гормоны и такие цитокины, как ТЫР-а. 1Ь-1,1Ь-4, ТСР-р. УЕСР [6, 10,20].
Безусловно, патогенез развития инволюции тимуса сложен и многоступенчат, однако, по нашему мнению, основная причина - дисфункция взаимодействия в системе надпочечники-гипофиз-тимус [11]. Посредниками взаимодействия эндокринной и иммунной систем в этом случае являются дендритные клетки, способные при их стимуляции секретировать те или иные иммунорегулирующие факторы, в том числе и биогенные амины. Увеличение уровня глюкокортикоидов в крови, а также рост содержания гистамина и серотонина в тимоцитах, что и наблюдается в нашем эксперименте, запускает необратимую реакцию запрограммированной гибели клетки (апоптоза).
Литература
1. Бабаева Л.Г., Зотиков Е.А. Иммунология процессов адаптивного роста, пролиферации и их нарушений. М.: Наука, 1987. 207 с.
2. Бережная Н.М., Чехун В. Ф. Иммунология злокачественного роста. М.: Медицина, 2005. 790 с.
3. Ганцев Ш.Х., ДавыдовМ.И. Онкология. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. 920 с.
4. Глушков А.Н. Иммунология автономного поведения опухоли // Иммунология. 1991. № 5. С. 11-14.
5. Долгих В.Т. Опухолевый рост. М.: Медицинская книга, 2001. 79 с.
6. Зеленина Н.В., Марьянович А.Т., Цыган В.Н. Программированная клеточная гибель. СПб.: Наука, 1996. 89 с.
7. Киселева Е.П. Механизмы инволюции тимуса при опухолевом росте // Успехи совр. биол. 2004. Т. 124(6). С. 102-114.
8. Москвичев Е.В., Стручко Г.Ю., Меркулова Л.М., СтоменскаяИ.С. Экспериментальный канцерогенез в условиях приобретенного иммунодефицита// Морфологические ведомости. 2009. № 3-4. С. 72-75.
9. Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е. Межклеточные взаимодействия. 2-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 2003. 288 с.
10. Пинегин Б.В., Хаитов P.M., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы: руководство для врачей. М.: Гоэтар-Медиа, 2009. 352 с.
11. Стоменская И.С., Меркулова Л.М., Стручко Г.Ю., Москвичев Е.В. Роль биогенных аминов в регуляции функции надпочечников // Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей: материалы науч. конф. / Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова. СПб., 2004. С. 133-134.
12. Стручко Г.Ю., Меркулова Л.М., Стоменская И.С., Мохаммед Захид, Никифорова Н.В., Соловьева И.А. Акцидентальная инволюция тимуса после спленэктомии (иммуногистологическое исследование) // Морфология. 2001. Т. 150, № 5. С. 65-71.
13. Amanda L., Sempowski G. Cytokines, leptin, stress-induced thymic atrophy // J. Leukoc. Biol. 2008. № 84 (4). P. 923-931.
14. HammarJ. The Human Thymus at Normal and Pathological Conditions. 1929. 54 p.
15. Higashima J. et al. Effect of splenectomy on antitumor immune system in mice // Anticancer Reseatch. 2009. Vol. 29, № 1. P. 385-393.
16. Lyden D., Hattor R., Dias S. et al. Accidental involution of Thymus//Nature Med. 2001. Vol. 7, № 11. P. 1886.
17.Malinda K.M., Goldstein F.L., Grant D. S. 11 Angiogenesis: Models, Modulators and Clinical Applications / Ed. by M.E. Maragoudakis et al. 1998. Vol. 298. P. 157.
18. Prehn R.T. The paradoxical effects of splenectomy on tumor growth // Theor. Biol. Model. 2006. № 3. P. 23-32.
19.Rezzani R., Bonomini F., Rodella L. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development // Prog. Histochem. Cytohem. 2008. № 43(2). P. 73-120.
20. Ohm J.E. et al. VEGF inhibits T-cell development and may contribute to tumor-induced immune suppression // Blood. 2003. № 101(12). P. 4878-4886.
МИХАЙЛОВА МАРИНА НИКОЛАЕВНА - кандидат медицинских наук, доцент кафедры нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары.
MIKHAYLOVA MARINA NIKOLAEVNA - candidate of medical sciences, associate professor of Normal and Topographic Anatomy Department, Chuvash State University, Russia, Cheboksary
СТРУЧКО ГЛЕБ ЮРЬЕВИЧ — доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой функциональной и лабораторной диагностики, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (glebstr@mail.ru).
STRUCHKO GLEB YUREVICH — doctor of medical sciences, professor, head of Functional and Laboratory Diagnostic Department, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
МЕРКУЛОВА ЛАРИСА МИХАЙЛОВНА - доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары.
MERKULOVA LARISA MIKHAILOVNA - doctor of medical sciences, professor, head of Normal and Topographic Anatomy Department, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
КОСТРОВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА — ассистент кафедры функциональной и лабораторной диагностики, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары.
KOSTROVA OLGA YURYEVNA — assistant of Functional and Laboratory Diagnostic Department, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
МОСКВИЧЕВ ЕВГЕНИЙ ВАСИЛЬЕВИЧ - кандидат медицинских наук, доцент кафедры нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (moskvichev@rambler.ru).
MOSKVICHEV EVGENII VASILYEVICH - candidate of medical sciences, associate professor of Normal and Topographic Anatomy Department, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
ДРАНДРОВА ЕЛЕНА ГЕННАДЬЕВНА - студентка IV курса медицинского факультета, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары.
DRANDROVA ELENE GENNADJEVNA - student of Medical Faculty, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
СТОМЕНСКАЯ ИРИНА СТАНИСЛАВОВНА - кандидат медицинских наук, доцент кафедры функциональной и лабораторной диагностики, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (irina.stomenskaja@gmail.com).
STOMENSKAYA IRINA STANISLAVOVNA - candidate of medical sciences, associate professor of Functional and Laboratory Diagnostic Department, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
