CC BY
113
УДК 591.147.3:591.434 ББК Е60*737.15*734.247.2
О.Ю. КОСТРОВА, Г.Ю. СТРУЧКО,
Л.М. МЕРКУЛОВА, М.Н. МИХАЙЛОВА, Е.В. МОСКВИЧЕВ
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ТИМУСЕ НА ФОНЕ РАЗВИТИЯ ПРЕДОПУХОЛЕВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ТОЛСТОЙ КИШКИ
Ключевые слова: канцерогенез, инволюция тимуса, тучные клетки, дендритные клетки.
Установлено, что при появлении в толстой кишке экспериментальных животных предопухолевых изменений развивается акцидентальная инволюция тимуса 1 и 2 фазы. Это выражается деформацией долек, жировым перерождением органа, дисбалансом уровня биогенных аминов, уменьшением размеров коркового и мозгового вещества на фоне параллельного снижения массы тимуса, а также увеличением количества тучных и дендритных клеток.
О. KOSTROVA, G. STRUCHKO, L. MERKULOVA, M. MIKHAYLOVA, E. MOSKVICHEV MORPHOFUNCTIONAL CHANGES IN THE THYMUS AGAINST THE DEVELOPMENT OF PRECANCEROUS DISEASES OF THE COLON Key words: carcinogenesis, thymic involution, mast cells, dendritic cells.
It is established that with the appearance in the large intestine in experimental animals precan-cerous changes develops accidental involution of the thymus1 and 2 phase. This is expressed deformation of the lobules, the fatty degeneration of the thymus, the imbalance of biogenic amines levels, the reducing of the cortex and medulla size in the background of a parallel decrease in weight of the thymus, and also increase of the number of mast and dendritic cells.
На сегодняшний день установлено, что к развитию онкологических заболеваний приводят различные факторы риска. Известно, что некоторые опухоли связаны, например, с наследственной предрасположенностью. К этим факторам также относят употребление пищи, содержащей в качестве консервантов нитриты, образ жизни, плохую экологическую обстановку в районе проживания и т.д. Выявлено, что возникновение всех злокачественных опухолей человека в 80% случаев связано с воздействием на организм химических канцерогенов [1].
Сам же механизм формирования злокачественной опухоли включает в себя ряд последовательно чередующихся событий [5]. Согласно данным литературы, в результате воздействия на клетку канцерогенов повреждаются высокоспецифичные участки генома. Повреждения охватывают определенные участки ДНК, а это приводит к тому, что в процесс канцерогенеза вовлекается комплекс механизмов, который контролирует дифференцировку и рост клеток. В результате могут индуцироваться предопухолевые заболевания.
По современным представлениям, большое значение в предотвращении созревания раковых клеток имеет иммунная система, которая представляет собой очень сложную многокомпонентную структуру, включающую ряд органов и чрезвычайно большое число разнообразных иммунокомпетентных клеток [16]. Одну из ведущих ролей в обеспечении противоракового иммунного ответа выполняет тимус, в котором происходит дифференцировка основных популяций Т-лимфоцитов под влиянием клеток микроокружения (дендритные, эпителиальные, миоидные клетки и т.п.) [2]. От морфофункционального состояния тимуса зависят поддержание гомеостаза в организме и обеспечение стабильности его антигенных структур [7].
К сожалению, большинство злокачественных новообразований выявляют, в основном, на поздней стадии заболевания, когда размер опухоли достигает уже более 1 см. Безусловно, на этих стадиях появляются и метастазы, что существенно ухудшает прогноз. Возможно, это связано, прежде всего, с особенностями некоторых новообразований. Так, например, клинически опухоли желудочнокишечного тракта могут проявляться не сразу, долгое время находясь в латент-
ном периоде [4]. В связи с этим своевременность диагностики опухолевых заболеваний имеет решающее значение. В доступной нам литературе имеются лишь единичные работы, посвященные механизму канцерогенеза на фоне развития предопухолевых заболеваний [10].
Исходя из вышесказанного изучение состояния тимуса экспериментальных животных в условиях развития опухоли является актуальным и перспективным и может дать более целостное представление о патогенезе злокачественного роста, что позволит вырабатать в дальнейшем новые подходы при разработке эффективных методов прогнозирования, мониторирования, диагностики и лечения новообразований, особенно на стадиях предопухолевых изменений.
Цель исследования - изучить цитоархитектонику тимуса крыс на фоне развития предопухолевых заболеваний толстой кишки.
Материалы и методы исследования. В работе использованы нелинейные крысы-самцы, содержащиеся в условиях вивария при комнатной температуре и нормальной освещенности на стандартном рационе и питьевом режиме. Изучен тимус 40 крыс в возрасте 3 месяцев массой 180-220 г. Контролем служили интактные крысы той же возрастной группы (n = 20). Опытной группе крыс (n = 20) вводили внутрибрюшинно канцероген из расчета 20 мг/кг 1 раз в неделю в течение 4 недель (суммарная доза составила 80 мг/кг).
Через 30 и 60 суток после последней инъекции от подопытных и интакт-ных животных забирали тимус, взвешивали, затем изготавливали криостат-ные срезы толщиной 10 мкм.
Методы исследования:
1. Люминесцентно-гистохимический метод Фалька - Хилларпа в модификации Е.М. Крохиной - для избирательного выявления серотонина и катехоламинов и метод Кросса, Эвена, Роста - для идентификации гистаминсодержащих структур тимуса.
2. Метод цитоспектрофлуориметрии - для количественной оценки уровней серотонина (СТ), катехоламинов (КА) и гистамина (ГСТ) в структурах тимуса. Измерения производили с помощью насадки ФМЭЛ-1А, установленной на люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ-4 при выходном напряжении 600 В.
3. Для характеристики суммарно направленного действия биогенных аминов вычислялось соотношение (СТ+ГСТ)/КА, свидетельствующее о функциональном состоянии клеток тимуса [8].
4. Метод окраски полихромным толуидиновым синим по Унна - для качественной и количественной характеристики популяции тучных клеток тимуса.
5. Иммуногистохимические методы с использованием моноклональных (МКАТ) и поликлональных (ПКАТ) антител фирмы Santa Cruse (США) [19]: а) МКАТ к CD3 (маркер зрелых Т-лимфоцитов); б) МКАТ к СР1А (маркер кортикальных тимоцитов); в) МКАТ к PCNA (маркер пролиферирующих клеток); г) ПКАТ к белку S-100 (маркер клеток нейроэктодермального происхождения и дендритных клеток); д) МКАТ к тучным клеткам, положительным к триптазе (Тг+).
Материал для исследования фиксировали 10% нейтральным формалином в течение 24 ч, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4 мкм, которые наносили на высокоадгезивные стекла и высушивали при температуре 37°С в течение 18 ч. Восстановление антигенной активности осуществлялось в цитрат-ном буфере рН 6,0 в автоклаве при температуре 96°С в течение 20 мин с последующим остыванием в течение 90 мин. Для выявления иммуногистохимических реакций в работе применялась система визуализации LSAB-2. В качестве внутреннего контроля реакции служила неиммунизированная кроличья сыворотка. Результаты реакции оценивали с применением микроскопа МИКРОМЕД 3 ЛЮМ путем подсчета позитивно окрашенных клеток на 100 клеток в 10 полях зрения, выражая результаты в процентах и единицах в поле зрения.
6. Окраска гематоксилином и эозином с последующей морфометрией коркового и мозгового вещества долек.
7. Морфометрический метод с использованием программы Микро-Анализ для измерения размеров люминесцирующих гранулярных клеток, толщины коркового и площади мозгового вещества долек тимуса.
8. Статистическая обработка полученных цифровых данных проведена с помощью пакета программ Microsoft office (Word и Ехсе1) на компьютере. В работе приводятся следующие показатели: М - средняя арифметическая величина; m - средняя ошибка средней арифметической величины. Статистическую достоверность определяли f-критерием Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение. Нами выявлено, что через 30 суток после окончания введения канцерогена в слизистой оболочке толстой кишки визуально обнаруживаются предраковые изменения: определяются плоские бляшковидные утолщения овальной формы, выступающие над уровнем слизистой на высоту 0,3-1 мм. При окраске измененных участков гематоксилином и эозином отмечаются умеренная гиперхроматия ядер и увеличение ядерноцитоплазматического соотношения.
На этом же сроке исследования дольки тимуса экспериментальных животных имеют значительно меньшие размеры по сравнению с таковыми у интактных крыс, при этом небольшая их часть принимает полулунную или веретенообразную форму. После проведенной морфометрии выявляется достоверное уменьшение толщины коркового и площади мозгового вещества долек. Толщина коркового вещества у них составляет 0,3±0,031 мм, что на 40% меньше, чем у интактных животных. Площадь же мозгового вещества достоверно уменьшается в 2,5 раза и составляет 0,13±0,02 мм2.
Несмотря на выявленные изменения размеров долек, люминесцентная картина тимуса незначительно отличается от таковой у интактных животных: в дольках хорошо визуалирзируется граница между корковым и мозговым веществом, люминесцирующие гранулярные клетки кортико-медуллярной зоны расположены не рядами, а небольшими скоплениями по 2-4 клетки.
Установлено, что уровень моноаминов и гистамина в биоаминсодержащих структурах тимуса изменяется разнонаправленно (таблица). Так, содержание моноаминов в субкапсулярных клетках и тимоцитах коркового вещества превышает норму в 2 раза. Кроме того, следует отметить снижение гистамина на 13% и 25% в субкапсулярных и премедуллярных клетках, соответственно. В тимоцитарной паренхиме коркового вещества тимуса уровень гистамина увеличивается в 3 раза, что придает ткани диффузное желтовато-зеленое свечение. В мозговом веществе и в микроокружении тучных клеток уровень гистамина снижается в 1,6 раза.
Интенсивность люминесценции биоаминов в структурах тимуса у интактных крыс и через 30 суток после окончания введения канцерогена, у.е.
Структуры Интактная группа животных 30 суток после инъекций
СТ ГСТ КА СТ ГСТ КА
ПМК 235,6±10,44 280,2±21,0 105,25±5,03 198,01 ±20,4* 210,6±14,1 * 114,45±1,3
СКК 127,4±4,3 144,05±7,3 50,7±0,4 257,6±11,1 ** 125,6±8,9 113,16±4,4**
ТКВ 102,75±2,7 125,7±2,9 36,9±1,4 169,05±6,4** 321,99±32,2** 82,6±3,02**
ТМВ 60,05±1,1 97,65±1,0 24,25±0,8 65,25±1,5 62,1 ±2,03** 47,6±2,63**
ТК 99,85±2,5 223,35±7,9 35,2±0,54 177,6±3,0** 194,5±8,7 74,39±1,7**
М/О ТК 52,15±1,5 154,75±5,3 22,5±0,6 84,83±3,6** 94,5±2,6** 52,56±1,5**
Примечание. * - Р < 0,01; ** - Р < 0,001 при сравнении с интактными значениями. СТ - серотонин, ГСТ - гистамин, КА - катехоламины, ПМК - премедуллярные клетки, СКК - субкапсу-лярные клетки, ТКВ - тимоциты коркового вещества, ТМВ - тимоциты мозгового вещества, ТК -тучные клетки, М/О ТК - микроокружение тучных клеток.
Рис. 1. Тимус. 30 суток после окончания введения канцерогена. Значительное увеличение тучных клеток в соединительнотканных перегородках. Окраска полихромным толуидиновым синим по Унна. МИКРОМЕД 3 ЛЮМ. Ув.х100
Для характеристики суммарно Ч Ш
направленного действия биоген- мю е - • — #■ ж
ных аминов измерялся показатель (СТ+ГСТ)/КА. Данное соотношение во всех исследуемых структурах снижается, особенно резко в тимо-цитах мозгового вещества - в 2,5 раза и в микроокружении тучных клеток - в 2 раза.
В междольковых промежутках при окраске срезов тимуса поли-хромным толуидиновым синим выявляется увеличение тучных клеток в 5 раз по сравнению с аналогом у интактных животных (рис. 1).
Иммуногистохимическая реакция не дает достоверных отличий в количестве клеток по сравнению с аналогичными показателями у ин-тактных крыс.
Через 60 суток после окончания введения канцерогена в слизистой оболочке толстой кишки определяются уплотнения овальной формы до 1-1,5 мм. Слизистая оболочка в зоне утолщений имеет усиленный сосудистый рисунок. При гистологическом исследовании препаратов установлено, что утолщение слизистой обусловлено пролиферацией клеток кишечных крипт, а также увеличением их числа.
При прогрессировании предраковых изменений в толстой кишке в тимусе выявляются еще большие отклонения от нормы. Дольки деформируются, граница коркового и мозгового вещества стерта, увеличивается количество люминесцирующих клеток, которые располагаются хаотично по всей ткани. Премедуллярные клетки крупные, яркие и глыбчатые, диаметром до 20,7±0,2 мкм. В паренхиме тимуса обнаруживаются неяркие «клетки-тени» с угасающим диффузным свечением.
Окраска срезов по методу Унна позволила установить, что, несмотря на снижение общего количества тучных клеток, процентное содержание дегранулированных форм по сравнению с аналогичным показателем на 30-е сутки увеличивается на 23%, а недегранулированные и сла-бодегранулированные формы уменьшаются на 9%.
При иммуногистохимическом исследовании тимуса выявлено более чем двукратное увеличение количе- рис 2. Тимус. 60 суток
ства Б-100+-клеток (рис. 2), в то вре- после окончания введения канцерогена.
мя как количество 003+, 001А+ и Увеличение 3-1°0+-кпеток.
РОМА+-клеток не отличается от та- Иммуногистохимическая реакция
на белок Б-100.
кового у интактной группы животных. МИКРОМЕД 3 ЛЮМ. Ув.х100
Выводы. Таким образом, наши исследования показали, что на фоне пред-рака толстой кишки выявляются морфофункциональные изменения в тимусе. Наблюдается уменьшение размеров коркового и мозгового вещества долек, массы органа, жировое его перерождение, увеличение тучных и дендритных клеток, дисбаланс уровня биогенных аминов. По нашему мнению, подобные изменения свидетельствуют о развитии 1-й и 2-й фаз акцидентальной трансформации тимуса [3, 14].
Механизмы развития острой атрофии тимуса на фоне формирования опухоли окончательно до сих пор не выявлены. Одним из основных механизмов является недостаточное поступление клеток-предшественников в тимус, которые сохраняются в костном мозге в достаточном количестве и функционально полноценны. Это может быть следствием миграции их в опухоль [18. Р. 1886]. Известно, что рост злокачественной опухоли может зависеть и от клеточных, и от гуморальных факторов тимуса [6].
На наш взгляд, основная причина развития трансформации органа связана с дисфункцией взаимодействия в системе надпочечники-гипофиз-тимус. Посредниками между эндокринной и иммунной системами в этом случае являются дендритные клетки, которые способны выделять интерлейкины и гормоны, а также биогенные амины [8]. ИЛ-1 и ИЛ-2 достигают гипоталамуса и, наряду с катехоламинами, стимулируют в нем синтез кортикотропин-рилизинг-фактора.
Можно предположить, что выявленное нами повышение количества дендритных клеток свидетельствует о том, что тимус начинает реагировать на введение канцерогена при формировании предопухолевых изменений в толстой кишке. Установлено, что основной функцией дендритных клеток являются поглощение и процессинг доступных им антигенов [11]. По данным литературы, эти клетки представляют на своей поверхности собственные антигенные пептиды организма в комплексе с белками МНС (главный комплекс гистосовместимости I и II классов) и, тем самым, выполняют важную роль в механизмах центральной Т-клеточной ареактивности [13].
По нашему мнению, в развитии акцидентальной трансформации тимуса не последнее место занимают и тучные клетки. Установлено, что плотность распределения тучных клеток увеличивается с прогрессией злокачественного новообразования [16]. Мы предполагаем, что это связано со способностью тучных клеток экспрессировать триптазу, которая обладает выраженными ангиогенными свойствами [15]. К тому же, согласно данным литературы, тучные клетки тимуса участвуют в замещении паренхимы органа соединительной тканью посредством выделения медиаторов и синтеза ими коллагена [12. С. 105].
Итак, опираясь на полученные нами экспериментальные данные, можно сделать вывод, что появление предопухолевых заболеваний толстой кишки приводит к развитию инволюции тимуса. Ключевая роль в этих процессах принадлежит дендритным и тучным клеткам.
Литература
1. Белицкий Г.А. Химический канцерогенез // Вопросы онкологии. 2008. Т. 50, № 6. С. 166-168.
2. Беловешкин А.Г., Стельмах И.А, Студеникина Т.М. Субпопуляции нейроэндокринных клеток мозгового вещества тимуса человека // Молодой ученый. 2013. № 4. С. 627-631.
3. Васендин Д.В, Мичурина С.В., Ищенко И.Ю. Морфологические изменения в тимусе в «катаболической» фазе после воздействия экспериментальной гипертермии // Сибирский медицинский журнал. 2011. Т. 101, № 2. С. 33-35.
4. Егоренков В.В. Профилактика рака желудка и толстой кишки // Практическая онкология. 2011. Т. 12, № 2. С. 70-75.
5. Камышников В.С. Онкомаркеры: методы определения, референтные значения, интерпретация тестов. М.: МЕДпресс-информ, 2011. 128 с.
6. Киселева Е.П. Механизмы инволюции тимуса при опухолевом росте // Успехи современной биологии. 2004. Т. 124(6). С. 102-114.
7. Ковешников В.Г., Бибик ЕЮ. Функциональная морфология органов иммунной системы. Луганск: Виртуальная реальность, 2007. 172 с.
8. Кострова О.Ю. Акцидентальная инволюция тимуса крыс на фоне развития аденокарциномы толстой кишки, вызванной введением канцерогена в различной дозировке // Фундаментальные исследования. 2013. № 3. С. 321-324.
9. Леплина О.Ю. Характеристика интерферон-альфа-индуцированных дендритных клеток и их терапевтический потенциал в лечении онкологических и инфекционных заболеваний: авто-реф. ... докт. мед. наук. Новосибирск, 2011. 39 с.
10. Москвичев Е.В., Меркулова Л.М., Стручко Г.Ю. Иммуногистохимическая характеристика апоптоза и клеточной пролиферации в тимусе при экспериментальной опухоли толстой кишки // Иммунология. 2012. Т. 33, № 6. С. 303-305.
11. Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Физиология клеток врожденной иммунной системы: дендритные клетки // Иммунология. 2006. № 6. С. 368-378.
12. Рева И.В., Сингур О.А., Зеленков П.А., Игнатьев С.В. Апоптоз и его роль в репаратив-ной регенерации эпителиальных клеток // Морфология. 2006. № 4.
13. Роль дендритных клеток во взаимодействии врожденного и адаптивного иммунитета / Б.Б. Бижигитова, С.В. Кожанова, А.А. Шортанбаев и др. // Вестник Казахского национального медицинского университета. 2011. № 3. С. 99-104.
14. Турицына Е.Г. Морфологические и этиологические аспекты акцидентальной инволюции тимуса птиц // Аграрный вестник Урала. 2009. № 12(66). С. 74-76.
15. Тучные клетки тимуса на фоне развития аденокарциномы толстой кишки / О.Ю. Кострова, Л.М. Меркулова, Г.Ю. Стручко, М.Н. Михайлова и др. [Электронный ресурс] // Современ-
ные проблемы науки и образования. 2013. № 2. URL: www.science-education.ru/108-8714.
16. Чернушенко Е.Ф. Диагностика вторичных иммунодефицитных состояний // Искусство лечения. 2006. № 2(28). С. 5-12.
17. Crivellato E., Nico В., Ribatti D. Mast cell contribution to tumor angiogenesis: a clinical aa-proach // Eur. Cytokine Netw. 2009. Vol. 20(4). P. 197-206.
18. Accidental involution of thymus / D. Lyden, R. Hattor, S. Dias et al. // Nature med. 2001. Vol. 7, № 11.
19. Dabbs D.J. Diagnostics immunohistochemistry. Edinburg: Churchill Livingston, 2002. 637 р.
КОСТРОВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА - кандидат медицинских наук, ассистент кафедры функциональной и лабораторной диагностики, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары ^кЫг@уа^ех.ги).
KOSTROVA OLGA - oandidate of medical sciences, assistant of Functional and Laboratory Diagnostic Chair, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
СТРУЧКО ГЛЕБ ЮРЬЕВИЧ - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой функциональной и лабораторной диагностики, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (glebstr@mail.ru).
STRUCHKO GLEB - doctor of medical sciences, professor, head of Functional and Laboratory Diagnostic Chair, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
МЕРКУЛОВА ЛАРИСА МИХАЙЛОВНА - доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (merkulova192@mail.ru).
MERKULOVA LARISA - doctor of medical sciences, professor, head of Normal and Topographic Anatomy Chair, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
МИХАЙЛОВА МАРИНА НИКОЛАЕВНА - кандидат медицинских наук, доцент кафедры нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (mar3007@mail.ru).
MIKHAYLOVA MARINA - oandidate of medical sciences, аssociate рrofessor of Normal and Topographic Anatomy Chair, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
МОСКВИЧЕВ ЕВГЕНИЙ ВАСИЛЬЕВИЧ - кандидат медицинских наук, доцент кафедры нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (moskvichev@rambler.ru).
MOSKVICHEV EVGENII - aandidate of medical sciences, аssociate рrofessor of Normal and Topographic Anatomy Chair, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
