CC BY
49
УДК 616-018
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ТИМУСА ПРИ ВВЕДЕНИИ ИММУНОМОДУЛЯТОРА «ПОЛИОКСИДОНИЙ» *
MORPHOFUNCTIONAL STATE OF THYMUS WHEN INJECTING IMMUNOMODULATOR «POLYOXIDONIUM»
Мухаммад Захид, Г. Ю. Стручко, Л. М. Меркулова, Е. В. Москвичев Muhammad Zahid, G. Y. Struchko, L. M. Merkulova, E. V. Moskvichev
ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова», г. Чебоксары
Аннотация. Установлено, что применение полиоксидония вызывает изменение морфофункционального состояния тимуса: во всех изучаемых клетках уровень гистамина снижается, особенно в лимфоцитах коркового и мозгового вещества, содержание серотонина и катехоламинов в люминесцирующих гранулярных клетках увеличивается, отмечается увеличение тучных клеток и диаметра коркового вещества на площади мозгового вещества при неизмененной массе органа.
Abstract. It is established that polyoxidonium causes morphofunctional changes in thymus: in all the cells studied the level of histamine decreases especially in the lymphocytes of cortex and medulla, the level of serotonin and catecholamine in the luminescent granular cells increases, the level of mast cells also increases, the diameter of medulla and cortex increases without changes in the organ weight.
Ключевые слова: тимус, биогенные амины, дендритные клетки, тучные клетки, полиок-сидоний.
Keywords: thymus, biogenic amines, dendritic cells, mast cells, Polyoxidonium.
Актуальность исследуемой проблемы. Иммунная система является уникальным защитным механизмом, обеспечивающим гомеостаз, и при контакте с любым антигеном она не только реагирует в виде специфического иммунного ответа, но и способна вовлекать в этот процесс через гуморальные факторы нервную и эндокринную системы [2]. Ведущая роль в таких взаимодействиях, безусловно, принадлежит тимусу, в котором присутствуют многочисленные клеточные типы, обеспечивающие процессы иммуногенеза. Морфологические перестройки в тимусе, возникающие в ответ на стресс, на различные антигены, носят адаптивный характер и сопровождаются изменением цитоархитектоники, а, следовательно, и микроокружения клеток, что, по-видимому, и является причиной развития иммунодефицитов в этих условиях [7].
Работа выполнена в рамках государственного контракта № 02.740.11.0708 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.
Проблеме взаимодействия структур тимуса посредством цитокинов и биогенных аминов в последнее десятилетие уделяется особое внимание [1], [4]. В связи с этим сформировалась новая дисциплина - нейроиммуноэндокринология, объектом изучения которой являются механизмы, лежащие в основе взаимодействия главных регулирующих систем - нервной, иммунной и эндокринной. Посредниками взаимодействия этих систем являются внутрииммунные регуляторные факторы - гормоны тимуса, биогенные амины [3], [7], иммунорегуляторные факторы: интерлейкины (ИЛ-1, ИЛ-6), фактор некроза опухолей, лимфоцит-активирующий фактор и др. [11].
Как известно, применение препаратов с иммунотропными свойствами обязывает к тщательному контролю их действия на морфофункциональное состояние органов. Поэтому изучение этого вопроса является весьма актуальным и в теоретическом, и в прикладном аспектах. В настоящее время одним из наиболее изучаемых иммуномодуляторов является «Полиоксидоний», который обладает сложным и многогранным действием на иммунную и эндокринную системы, усиливая и клеточный, и гуморальный иммунитет [6], [10]. Однако для признания полиоксидония универсальным препаратом с широким спектром действия не хватает данных о его влиянии на органы иммунитета на клеточном и тканевом уровнях.
Таким образом, всестороннее исследование взаимодействия морфофункционального состояния тимуса на фоне применения иммуномодулятора «Полиоксидоний» является важной и перспективной задачей современной иммуноморфологии, имеющей как фундаментальное, так и прикладное значение.
Цель исследования - изучить морфофункциональное состояние тимуса через 3 недели применения полиоксидония.
Материал и методика исследований. Эксперименты проведены на 130 белых нелинейных крысах-самцах массой 180-220 г. Уход и содержание животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Животные были разделены на 3 группы: 1-я - интактные крысы (п=25); 2-я - контрольная группа животных с внутримышечным введением физиологического раствора по 0,5 мл 2 раза в неделю в течение 3 недель (п=35); 3-я - животные с внутримышечным введением «Полиоксидония» из расчета 0,1 мг/кг 2 раза в неделю в течение 3 недель (доза адекватна лечебной для человека, исходя из соотношения средней массы крысы и человека) (п=70).
Животных умерщвляли путем декапитации по окончании введения препарата. Объектом исследования служил тимус, который брался в одно и то же время суток с 15 до 18 часов.
Были использованы следующие методы исследований:
1. Для избирательного выявления катехоламин- и серотонинсодержащих структур тимуса применялся люминесцентно-гистохимический метод Фалька-Хилларпа.
2. С целью идентификации гистаминсодержащих структур тимуса свежекриостат-ные срезы обрабатывались люминесцентно-гистохимическим методом Кросса, Эвена, Роста.
3. Уровень свечения катехоламинов, серотонина и гистамина в аминсодержащих структурах вилочковой железы оценивался с помощью цитоспектрофлуориметрии. Для этого на люминесцентный микроскоп была установлена насадка ФМЭЛ-1А при выходном напряжении 900 В.
4. Для того, чтобы охарактеризовать суммарно-направленное действие биогенных аминов, нами использовалось следующее соотношение: (СТ+ГСТ)/КА.
5. Для качественной и количественной характеристики тучных клеток тимуса применялся метод окраски полихромным толуидиновым синим по Унна.
6. Окраска гематоксилином-эозином использовалась в качестве общегистологической с последующей морфометрией коркового и мозгового веществ тимуса.
Результаты исследований и их обсуждение. Выявлено, что у интактных животных во внутренней кортикальной зоне выявляются компактно расположенные клетки неправильной формы с гранулами беловато-желтого свечения, названные «премедулляр-ными клетками». Эти клетки располагаются в 1-3 ряда вокруг мозгового вещества долек тимуса. По форме клетки разнообразные: округлые, вытянутые, неправильной формы. Клетки премедуллярного ряда всегда содержат включения чаще беловато-желтой люминесценции. Премедуллярные клетки в своих гранулах содержат серотонин, катехоламины и гистамин.
На периферии долек в субкапсулярной зоне выявляются клетки с более мелкими гранулами зеленовато-желтой люминесценции, названные «субкапсулярные клетки». Микрофлуориметрически в них также выявляются вышеуказанные биогенные амины.
Между премедуллярными и субкапсулярными клетками тимусной дольки располагаются лимфоциты коркового вещества, которые также содержат определенную концентрацию биогенных аминов и обладают слабой люминесценцией. Кнутри от премедулляр-ного ряда клеток локализовано мозговое вещество вилочковой железы. Обработка препаратов параформальдегидом выявляет диффузное темно-зеленоватое свечение лимфоцитарной паренхимы мозгового вещества, которое люминесцирует слабее по сравнению с корковым веществом.
Применение полиоксидония приводит к изменению цитоархитектоники тимуса. Дольки увеличиваются в размерах как за счет диаметра коркового, так и за счет площади мозгового вещества. Премедуллярные клетки окружают мозговое вещество плотным кольцом в 4-5 ряда. Клетки крупные, яркие, желтовато-белой люминесценции. Количество премедуллярных клеток становится 18-20 в поле зрения, что на 50,0-60,0 % превышает норму. В 15,0-20,0 % случаев наблюдается «вклинение» кортико-медуллярного ряда клеток в субкапсулярный. В связи с тем, что размеры субкапсулярных макрофагов увеличиваются, а их люминесценция несколько возрастает, дифференцировка клеток преме-дуллярного и субкапсулярного рядов становится затруднительной.
Использование синтетического иммуномодулятора «Полиоксидоний» вызывает изменения со стороны биоаминной системы тимуса. Уровень биогенных аминов измеряли в клетках кортико-медуллярной и субкапсулярных зон, тучных клетках, а также и в их микроокружении - тимоцитах коркового и мозгового вещества.
У интактных животных преобладающим биогенным амином во всех исследованных структурах является гистамин, особенно в тимоцитах коркового и мозгового вещества, где его уровень в 3-4 раза выше содержания катехоламинов и серотонина в этих же структурах.
В премедуллярных клетках после трехнедельного использования полиоксидония содержание серотонина и катехоламинов увеличивается на 67,0 %, уровень гистамина практически не изменяется. Это приводит к снижению соотношения (СТ+ГСТ)/КА до 5,04 против 6,31 у интактных животных. В то же время в лимфоцитах микроокружения этих клеток - тимоцитах коркового вещества - содержание серотонина и катехоламинов
увеличивается незначительно, а уровень гистамина падает почти в 2 раза, что обуславливает резкое снижение соотношения (СТ+ГСТ)/КА до 3,92. У интактных животных этот индекс составляет 5,7. В тимоцитах мозгового вещества наблюдаются аналогичные изменения, однако соотношение (СТ+ГСТ)/КА уменьшается.
В клетках субкапсулярного ряда уровень серотонина возрастает почти на 20,0 %. Это придает им беловатую люминесценцию, что и отмечалось нами при визуализации. Содержание катехоламинов снижается на 15,0 %, а гистамина - в 1,6 раза. Такое перераспределение биогенных аминов в макрофагах субкапсулярной зоны, вероятнее всего, является ответной реакцией на значительные изменения в клетках премедуллярного ряда и тимоцитах коркового вещества. Поэтому соотношение (СТ+ГСТ)/КА в субкапсулярных клетках практически не изменяется: 5,95 против 6,45 у интактных крыс.
Количество тучных клеток при люминесцентной микроскопии заметно увеличивается, причем в основном за счет молодых недегранулированных форм. При цитоспек-трофлуориметрии количество серотонина в них повышается на 37,0 %, катехоламинов -на 11,0 %, а уровень гистамина снижается на 22,0 %. Соотношение (СТ+ГСТ)/КА отличается от нормы незначительно: 6,12 и 6,62 соответственно. В то же время в лимфоцитах микроокружения тучных клеток на фоне незначительного увеличения серотонина (на 21,0 %) уровень гистамина снижается более значительно (на 41,0 %), что приводит к наглядному уменьшению соотношения (СТ+ГСТ)/КА: 4,85 против 5,83 у интактных животных.
Исследование морфологии тучных клеток с помощью окраски полихромным толуидиновым синим показало, что в норме преобладают дегранулированные Т-2 и Т-3 формы клеток (79,2 %) с Р1- и р2-метахромазией. После введения полиоксидония отмечается увеличение количества тучных клеток. В 33,2 % случаев - это недегранули-рованные Т-0 и Т-1 формы клеток с ргметахромазией. Соответственно дегранулирован-ные Т-2 и Т-3 формы занимают 62,6 %, что на 16,6 % меньше, чем у интактных крыс.
Окраска срезов тимуса гемотоксилином-эозином и проведение морфометрии долек выявили следующее: толщина коркового вещества после применения полиоксидония увеличивается на 19,0 %, а площадь мозгового вещества возрастает на 36,0 %. При этом масса тимуса практически не отличается от нормы и контрольной группы.
Таким образом, нами установлено, что применение синтетического иммуномодулятора «Полиоксидоний» в течение трех недель приводит к видимым изменениям цитоархитектоники тимусной дольки. В наших предыдущих исследованиях выявлено, что среди люминесцирующих гранулярных клеток внутренней кортикальной зоны 75,0 % - это дендритные клетки, дающие положительную реакцию на СБ23 и белок 8-100. После применения полиоксидония значительно возрастает экспрессия СБ68-положительных макрофагов, количество которых увеличивается в 2,2 раза по сравнению с контрольной группой животных. Среди биоаминсодержащих клеток этой зоны выявляются крупные АПУД- и тучные клетки, количество которых также растет параллельно с увеличением в них уровня биогенных аминов [9]. Среди люминесцирующих гранулярных клеток суб-капсулярной зоны визуализируются макрофаги, дендритные и АПУД-клетки, однако подавляющая часть этих клеток - дендритные, а среди внутримозговых - макрофаги.
С помощью люминесцентно-гистохимических методов выявлено, что у интакт-ных животных во всех исследуемых структурах преобладающим биогенным амином является гистамин, особенно в тимоцитах коркового и мозгового вещества, где его уровень в 3-4 раза выше содержания катехоламинов и серотонина. После использова-
ния полиоксидония практически во всех структурах уровень гистамина снижается, особенно выражено - в тимоцитах. При этом содержание серотонина и катехоламинов изменяется по-разному: в люминесцирующих гранулярных клетках - повышается, в лимфоцитах коркового и мозгового вещества - почти не изменяется. Выявленный дисбаланс биогенных аминов приводит к достоверному уменьшению соотношения (СТ+ГСТ)/КА во всех структурах, особенно в тимоцитах. Известно, что снижение данного соотношения в клетках иммунной системы приводит к стимуляции их физиологической активности [8].
Из литературы известно, что клетками-мишенями для полиоксидония являются, прежде всего, факторы естественной резистентности: макрофаги, моноциты, нейтрофи-лы и КК-клетки - факторы ранней защиты организма от инфекции [5]. Макрофаги осуществляют связь с клетками иммунной системы за счет выработки трех основных цито-кинов - ИЛ-1, фактора некроза опухоли (ФНО) и ИЛ-6 [10].
В заключение можно сказать, что введение полиоксидония первоначально приводит к активации клеточного звена иммунной системы - макрофагов, дендритных и тучных клеток, что мы и наблюдаем в наших экспериментах. Увеличение количества дендритных клеток в кортико-медуллярной и субкапсулярной зонах тимусной дольки приводит к дисбалансу биогенных аминов и цитокинов, направленному на активацию, созревание, пролиферацию и выброс Т-лимфоцитов в периферический кровоток. Именно поэтому мы и наблюдаем в этот период увеличение СБ3- и СБ5+-клеток более чем на 15,0 % по сравнению с контрольной группой животных. Повышение количества клеточных элементов в паренхиме и строме тимуса сопровождается увеличением диаметра коркового вещества на 19,0 % и площади мозгового вещества на 36,0 %.
Ускорение процессов дифференцировки и созревания тимоцитов должно привести к увеличению количества Т-лимфоцитов, приобретших рецепторы к собственным антигенам. В этом случае для сдерживания аутоиммунной агрессии наравне с активацией Т-лимфоцитов должна активизироваться и цензорная функция тимуса.
Известно, что полиоксидоний обладает свойством усиливать выработку макрофагами ИЛ-1 и ФНО. Увеличение ФНО способствует индукции гибели клеток в процессе апоптоза через экспрессию СБ30 на лимфоцитах. Благодаря этому факту мы и наблюдаем достоверное увеличение СБ30+-клеток, особенно во внутренней кортикальной зоне. Кроме того, повышенный уровень ИЛ-1 приводит к росту кортизола в крови, а это в свою очередь - к гибели кортизол-чувствительных Т-лимфоцитов и привлечению новых пулов макрофагов в эту зону. Еще одним доказательством усиленной клеточной гибели является повышение экспрессии антигена СБ45ЯО, что и наблюдается в наших экспериментах [9].
Резюме. Результаты исследований позволяют сделать вывод о том, что полиокси-доний оказывает стимулирующее влияние на все звенья иммунной системы, включая первичный орган иммуногенеза - тимус. Основными его мишенями являются клетки макрофагально-моноцитарной системы, дендритные клетки, натуральные киллеры, которые через цитокины и биогенные амины влияют на клеточный и гуморальный иммунитет.
ЛИТЕРАТУРА
1. Диндяев, С. В. Биогенные амины крови и перитонеальной жидкости крыс в процессе полового цикла / С. В. Диндяев, С. Ю Виноградов // Естествознание и гуманизм : сб. науч. трудов. - Томск, 2009. -Т. 2. Вып. 4. - С. 86-93.
2. Кондашевская, М. В. Взаимодействие нервной, иммунной и эндокринной систем при повышенной психической нагрузке, индивидуальные особенности реагирования этих систем у крыс линии Вистар / М. В. Кондашевская, О. В. Макарова, Л. П. Михайлова, А. М. Яблонская, М. Е. Диатроптов // Бюллетень сибирской медицины. - Новосибирск, 2008. - С. 45-50.
3. Кветной, И. М. Нейроиммуноэндокринология тимуса / И. М. Кветной, А. А. Яриллин,
B. О. Полякова. - СПб. : ДЕАН, 2005. - 157 с.
4. Коновалов, С. С. Профилактическая нейроиммуноэндокринология / С. С. Коновалов, А. И. Иль-ницкий, К. И. Прощаев, И. М. Кветной. - СПб. : Прайм-Еврознак, 2008. - 346 с.
5. Пинегин, Б. В. Иммуномодулятор полиоксидоний: механизмы действия и аспекты клинического применения / Б. В. Пинегин, А. В. Некрасов, Р. М. Хаитов // Цитокины и воспаление. - 2004. - № 3. -
C. 37-42.
6. Пинегин, Б. В. Полиоксидоний: новые данные о клиническом применении / Б. В. Пинегин, А. В. Некрасов // Аллергология и иммунология. - 2006. - № 3. - С. 434.
7. Сибилева, Е. Н. Синдром увеличения вилочковой железы у детей раннего возраста / Е. Н. Сибилева // Педиатрия и неонатология. - 2008. - С. 36-47.
8. Стручко, Г. Ю. Морфофункциональное исследование тимуса и иммунобиохимических показателей крови после спленэктомии и иммунокоррекции : автореф. дис. ... д-ра мед. наук : 03.00.25 / Г. Ю. Стручко. - Саранск, 2003. - 23 с.
9. Стручко, Г. Ю. Иммуногистохимическое исследование структур тимуса после применения поли-оксидония / Г. Ю. Стручко, Мухаммад Захид, Л. М. Меркулова, Е. В. Москвичев // Клиническая и экспериментальная медицина : сборник научных трудов. - Чебоксары, 2010. - С. 140-143.
10. Хаитов, Р. М. Иммунология / Р. М. Хаитов. - М. : Изд-во «Медицина», 2006. - 320 с.
11. Amanda, L. Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy / L. Amanda, G. Sempowski // J. Leukoc Biol. - 2008. - Vol. 84 (4). - P. 915-923.
