CC BY
62
ИММУНООНКОЛОГИЯ
ИММУНООНКОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012
УДК 616.348-006.04-092:612.438.014.3]-078.33-092.9
Е. В. Москвичев, Л. М. Меркулова, Г. Ю. Стручко
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АПОПТОЗА И КЛЕТОЧНОЙ
пролиферации в тимусе при экспериментальной опухоли толстой кишки
Кафедра нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией ФГБОУ ВПО Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова, (428015, г чебоксары, Московский пр-т, д. 15)
С помощью иммуногистохимического метода исследован тимус крыс с экспериментальной опухолью толстой кишки. Установлено, что в тимусе крыс экспериментальной группы достоверно изменяется экспрессия маркеров клеточной пролиферации и апоптоза уже на стадии предопухолевых изменений в слизистой оболочке кишки. Изменения в морфологии и молекулярном фенотипе у крыс с сформировавшейся опухолью толстой кишки также имеют достоверные отличия от таковых у животных соответствующего возраста из групп контроля. При этом в тимусе крыс с экспериментальной опухолью наряду с инволютивными изменениями отмечаются признаки усиления клеточной пролиферации и дифференцировки тимоцитов в корковом веществе.
Ключевые слова: инволюция тимуса, апоптоз, клеточная пролиферация, опухолевая иммуносупрессия E.E.Moskvichov, L.M.Merkulova, G.Yu.Struchko
IMMUNOHISTOCHEMICAL CHARACTERISTIC OF APOPTOSIS AND CELL PROLIFERATION IN THE THYMUS IN EXPERIMENTAL TUMORS OF THE COLON
With the help of histochemical method investigated the thymus gland of rats with epithelial tumours of the large intestine it is Established, that in the thymus of rats of experimental group reliably change the expression of markers of cell proliferation and apoptosis already at the stage of precancerous changes in the mucosa of the colon. Changes in the morphology and molecular phenotype in rats with formed tumours of the large intestine are also significant differences from those of the animals of the corresponding age of the control group. While in the thymus of rats with experimental tumor along with involutory changes are showing signs of strengthening of cell proliferation and differentiation thymocyte the cortical substance.
Keywords: involution of thymus, apoptosis, cell proliferation and tumor immunosuppression
Введение. Рост злокачественных новообразований зачастую сопровождается угнетением иммунного ответа, при этом опухоль перестает распознаваться как чужеродная ткань и ускользает от иммунного надзора [5, 10]. Существует несколько механизмов иммуносупрессивного действия опухоли [8]. Один из них реализован на способности опухоли к образованию иммуносупрессивных T-reg-клеток с фенотипом CD3+CD4+CD25+Foxp3 в зоне локального иммунного ответа, которые угнетают местный иммунитет [4]. Известно, что иммуносупрессивные T-reg-клетки могут происходить из зрелых периферических T-хелперов, количество которых значительно возрастает при опухолевом росте [1]. Другой механизм основан на прямом иммуносупрессивном влиянии продуктов метаболизма опухоли и ее биологически активных веществ на иммунные органы, что приводит к снижению продукции иммунокомпетентных клеток либо к выработке дефектных цитотоксических лимфоцитов [7].
Тимус является центральным органом иммуногенеза и подвергается инволютивным изменениям при канцерогенезе [9]. Среди возможных механизмов иммуносупрессивного влияния опухоли на тимус выделяют недостаточное поступление в железу костномозговых предшественников и повышенную миграцию клеток на периферию [2]. В исследованиях B. Adkins и соавт. [3] сделано предположение о том, что злокачественные опухоли могут усиливать апоптоз, а также нарушать созревание и дифференцировку тимоцитов в зре-
Москвичев Евгений Васильевич - канд. мед. наук, доц. каф.; тел. 8(902) 287-81-91, e-mail: [email protected].
лые формы. Однако результаты экспериментальных работ, проведенных авторами, имели минимальную статистическую достоверность. В доступной литературе мы также встретили лишь единичные работы по изучению белков-регуляторов апоптоза в тимусе при канцерогенезе [2].
Целью исследования стало изучение клеточной пролиферации и дифференцировки тимоцитов, а также экспрессии белков-регуляторов апоптоза в тимусе крыс с экспериментальной опухолью толстой кишки.
Материалы и методы. Работа выполнена на 50 белых нелинейных крысах-самцах массой 180-220 г Уход и содержание животных проводили в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных". Крыс разделили на 3 группы. 1-й группе (30 крыс) внутрибрюшинно вводили 1,2-диметилгидразин из расчета 20 мг на 1 кг массы 1 раз в неделю в течение 5 нед в соответствии с экспериментальной моделью [6]. 2-й группе (группа контроля - 10 крыс) вводили изотонический раствор хлорида натрия. Изменения в опытной и контрольной группах сравнивали с таковыми у интактных животных 3-й группы (10 крыс) соответствующего возраста. Выведение животных из эксперимента проводили через 30, 90 и 150 сут после окончания курса введения канцерогена путем декапитации. Одновременно выводили и контрольных животных соответствующего возраста. Объектом исследования служил тимус. В работе использовали следующие методы:
1) иммуногистохимический метод с применением четырех коммерческих моноклональных антител (МКАТ) фирм "Santa Craze" (США) и "Novocastra" (Великобритания): а) МКАТ к кластеру дифференцировки лимфоцитов 3-го типа (CD3); б) МКАТ к белку-регулятору апоптоза
- 303 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2012
Рис. 1. Тимус интактной крысы 9 мес. Экспрессия CD3 в тимоцитах коркового вещества.
Здесь и на рис. 2: 1 - тимоциты, дающие мембранную реакцию с CD3; 2 -незрелые тимоциты; иммуногистохимическая реакция с CD3; ув. 400.
Рис. 2. Тимус крысы через 5 мес после введения канцерогена. Увеличение количества клеток, экспрессирующих CD3 в корковом веществе.
p53; в) МКАТ к антиапоптотическому белку bcl2; г) МКАТ к маркеру клеточной пролиферации Ki-67; материал для исследования иммуногистохимическими методами фиксировали 10% нейтральным забуференным формалином в течение 24 ч, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4 мкм; срезы наносили на высокоадгезивные стекла и высушивали при температуре 37°С в течение 18 ч; демаскировку и иммуногистохимическую окраску проводили на автостейнере Leica Bond Max (Германия); контролем иммуногистохимической реакции служила неиммунизированная кроличья сыворотка; результат реакции оценивали с применением микроскопа Leica DM4000B (Германия) путем подсчета позитивно окрашенных клеток на 100 клеток в 10 полях зрения, выражая результаты в процентах и единицах в поле зрения;
2) окраску гематоксилином и эозином для оценки общегистологической картины и проведения морфометрических измерений;
3) компьютерную морфометрию с использованием лицензионных программ Leica application suite 3.6.0 (Германия) и Микроанализ (Россия);
4) статистическую обработку с помощью лицензионного
Рис. 3. Тимус интактной крысы 9 мес. Экспрессия Ki-67 в ядрах клеток коркового вещества. Здесь и на рис. 4 иммуногистохимическая реакция к Ki-67; ув. 400.
Рис. 4. Тимус крысы через 5 мес после введения канцерогена. Увеличение количества клеток, экспрессирующих Ki-67 в корковом веществе.
пакета программ MS Office 2003, достоверность определяли /-критерием Стьюдента.
Результаты. Заключение. Обработка препаратов тимуса молодых интактных крыс 4 мес антителами (АТ) к CD3 выявляет многочисленные зрелые тимоциты, которые занимают 14,13% поля зрения коркового и 56,9% мозгового вещества. При окраске препаратов АТ к bcl2 обнаружили единичные клетки, расположенные в мозговом веществе и на границе мозгового и коркового вещества. Их количество не превышает 2,72 ± 0,18 в поле зрения. Результаты исследования экспрессии p53 демонстрируют позитивную реакцию в единичных клетках коркового и мозгового вещества. При обработке препаратов тимуса маркером клеточной пролиферации Ki-67 выявили многочисленные пролиферирующие клетки в корковом и мозговом веществе. Установили, что положительную реакцию с Ki-67 дают 9,42% клеток мозгового и 34,8% клеток коркового вещества.
Через 1 мес после окончания введения канцерогена в слизистой оболочке толстой кишки крыс формируются очаговые пролифераты крипт без признаков клеточной атипии. При окраске тимуса АТ к CD3 отмечали положительную реакцию в многочисленных клетках коркового и мозгового вещества, количество которых достоверно не отличается от такового у
- 304 -
ИММУНООНКОЛОГИЯ
интактных и контрольных животных соответствующего возраста. При обработке препаратов тимуса АТ к белкам-регуляторам апоптоза bcl2 и p53 отметили немногочисленные клетки, локализованные в корковом и мозговом веществе, количество которых также достоверно не отличается от значений у интактных и контрольных животных. При исследовании маркера клеточной пролиферации не наблюдали достоверных отличий в количестве пролиферирующих клеток по сравнению с аналогичным показателем у интактных животных соответствующего возраста и крыс, которым вводили физиологический раствор.
Через 3 мес после окончания введения канцерогена в пролифератах кишечных крипт на фоне локальной иммунной реакции прослеживаются явления клеточной дисплазии. Окраска препаратов тимуса крыс экспериментальной группы АТ к CD3 демонстрирует достоверное снижение количества клеток, экспрессирующих этот антиген, в корковом веществе по сравнению с таковым у интактных и контрольных животных, тогда как в мозговом веществе достоверные изменения отсутствовали. Обработка препаратов тимуса АТ к антиапоп-тотическому белку bcl2 демонстрирует более чем 3-кратное повышение экспрессии этого антигена в клетках коркового и мозгового вещества по сравнению с аналогичным показателем у интактных и контрольных животных соответствующего возраста. При определении содержания белка p53 не выявили достоверных отличий в его экспрессии в группах экспериментальных и контрольных животных. При исследовании маркера клеточной пролиферации Ki-67 отметили небольшое, но достоверное повышение экспрессии этого антигена в структурах коркового вещества до 46,4%, тогда как экспрессия Ki-67 в структурах мозгового вещества достоверно не изменялась.
Через 5 мес после окончания введения канцерогена в толстой кишке формируются одна, реже две злокачественные опухоли, имеющие морфологию дифференцированной аденокарциномы. В тимусе крыс экспериментальной группы на этом сроке определяются признаки инволюции в виде уменьшения площади дольки и мозгового вещества, а также толщины коркового вещества. Снижение морфометрических характеристик сопровождается уменьшением относительной массы железы, а также замещением тимической паренхимы жировой тканью. При обработке препаратов тимуса АТ к CD3 выявили достоверное увеличение количества зрелых тимоцитов в корковом веществе по сравнению с таковым у интактных крыс и животных из группы контроля, при этом изменения в количестве этих клеток в мозговом веществе достоверно не отличаются от таковых в других группах (рис. 1, 2).
Мы считаем, что увеличение количества зрелых форм тимоцитов в корковом веществе может быть обусловлено как нарушением поступления незрелых костномозговых предшественников вследствие токсического влияния опухоли, так и увеличением количества дифференцированных форм [2]. Окраска тимуса АТ к маркеру клеточной пролиферации Ki-67 выявляет достоверное повышение уровня пролиферирующих клеток в корковом и мозговом веществе по сравнению с аналогичным показателем у интактных крыс соответствующего возраста, а также животных, которым вводили физиологический раствор (рис. 3, 4).
Результаты исследования белка-ингибитора апоптоза bcl2 в структурах тимуса демонстрируют более чем 2-кратное повышение его экспрессии в структурах коркового и мозгового вещества у экспериментальных крыс по сравнению с таковым у интактных и контрольных животных соответствующего возраста. Обработка препаратов тимуса АТ к p53 демонстрирует небольшое, но достоверное снижение экспрессии этого белка в структурах коркового вещества тимуса по сравнению с аналогичным показателем у интактных и контрольных животных.
Мы установили, что развивающаяся злокачественная опухоль толстой кишки у крыс оказывает существенное влияние
на морфологию тимуса, при этом достоверные изменения в железе регистрируются уже на этапе предопухолевых изменений слизистой оболочки кишки через 3 мес после введения канцерогена. Это проявляется в повышении экспрессии антиапоптотического белка bcl2, а также в повышении экспрессии Ki-67 в корковом веществе тимуса. Мы считаем, что подобное усиление клеточной пролиферации следует рассматривать как иммунную реакцию организма на канцерогенез. Предопухолевые изменения в толстой кишке также сопровождаются достоверным снижением количества зрелых кортикальных тимоцитов, что в свою очередь может быть обусловлено как усиленным поступлением в тимус незрелых костномозговых предшественников с фенотипом CD3-, так и миграцией зрелых клеток в зону локального иммунного ответа в слизистой оболочке толстой кишки.
Сформировавшаяся опухоль толстой кишки оказывает еще более существенное влияние на морфологию и молекулярный фенотип тимуса, при этом в железе наряду с морфологическими изменениями, характерными для инволюции, отмечаются признаки усиления дифференцировки тимоцитов. Это проявляется достоверным повышением экспрессии маркеров клеточной пролиферации, увеличением количества кортикальных тимоцитов, экспрессирующих CD3, а также значительным повышением экспрессии антиапоптотиче-ского белка bcl2 в структурах мозгового вещества на фоне снижения экспрессии его антагониста - белка p53 в корковом веществе железы. Таким образом, при экспериментальной опухоли толстой кишки в тимусе на фоне изменений, характерных для инволюции, регистрируются признаки усиления пролиферации и дифференцировки тимоцитов в зрелые формы, что, по-видимому, обусловлено формированием опухолевой иммунной толерантности [1, 5].
Работа выполнена в рамках гос. контракта № 02.740.11.0708 ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 гг.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барышников Ю. А. Взаимодействие опухоли и иммунной системы // Практ. онкол. - 2003. - Т. 4, № 3. - С. 127-130.
2. Киселева Е. П. Механизмы инволюции тимуса при опухолевом росте // Успехи соврем. биол. - 2004. - Т. 124, №3 . - С. 589-601.
3. Adkins B., Charyulu V., Sun Qi-Ling et al. Early block in maturation is associated with thymic involution in mammary tumorbearing mice // J. Immunol. - 2000. - Vol. 164. - P. 5635-5640.
4. Clarke S. L., Betts G. J., Plant A. et al. CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells suppress anti-tumor immune responses in patients with colorectal cancer // PLoS One. - 2006. - Vol. 1, N 27. - P. 129.
5. Costello R T., Gastaut J. A., Olive D. Mechanisms of tumor escape from immunologic response // Rev. Med. Interne. - 1999. - Vol. 20, N 7. - P. 579-588.
6. Gilbert J. M. Experimental colorectal cancer as a model of human disease // Ann. Roy. Coll. Surg. Engl. - 1987. - Vol. 69, N 2. - P. 48-53.
7. Joyce E. O., Gabrilovich D. I., Sempowski G. D. et al. VEGF inhibits T-cell development and may contribute to tumor-induced immune suppression // Blood. - 2003. - Vol. 101, N 12. - P. 4878-4886.
8. Kavanaugh D. Y., Carbone D. P. Immunologic dysfunction in cancer // Hematol. Oncol. Clin. N. Am. - 1996. - Vol. 10, N 4. -P. 927-951.
9. LopezD. M., Charyulu V., AdkinsB. Influence of breast cancer on thymic function in mice // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. -2002. - Vol. 7, N 2. - P. 191-199.
10. Whiteside T. L. The role of immune cells in the tumor microenvironment // Cancer Treat. Res. - 2006. - Vol. 130. - P. 103-124.
Поступила 19.02.12
- 305 -
