CC BY
96
УДК 616-006.66
Г.Ю. СТРУЧКО, Л.М. МЕРКУЛОВА, ЕВ. МОСКВИЧЕВ,
О.Ю. КОСТРОВА, М.Н. МИХАЙЛОВА, Е.Г. ДРАНДРОВА, МУХАММАД ЗАХИД
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОПУХОЛЕЙ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА НА ФОНЕ ИММУННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ*
Ключевые слова: канцерогенез, иммунодефицит, спленэктомия, толстая кишка, апоптоз.
Установлено, что у крыс на фоне введения канцерогена формируется злокачественная опухоль проксимального отдела толстой кишки, имеющая морфологию аденокарциномы. У крыс, перенесших спленэктомию, помимо рака толстой кишки, отмечается и множественная опухоль дистального отдела пищевода, имеющая морфологию тоскоклеточного рака. Иммуногистохимиче-ское исследование кишки позволило зарегистрировать более высокую экспрессию гена p53 в опухолях у крыс с иммунодефицитом, что указывает на глубокое повреждение механизма апоптоза клеток у животных после спленэктомии и более злокачественный характер новообразований.
G.Yu. STRUCHKO, L.M. MERKULOVA, E.V. MOSKVICHEV, O.Yu. KOSTROVA,
M.N. MIKHAILOVA, E.G. DRANDROVA, MUHAMMAD ZAHID MORPHOLOGICAL AND IMMUNOHISTOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF GASTROINTESTINAL TRACT TUMORS IN SECONDARY IMMUNODEFICIENCY Key words: carcinogenesis, immunodeficiency, splenectomy, colon, apoptosis.
The malignant tumors of the proximal part colon with morphology of adenocarcinoma were revealed in carcinogen-treated rats. In splenectomied rats were also founded multiple gullet tumors with morphology of squamous cell carcinoma. The immunohistochemical studies of colon sections were proved a more high expression of p53 gene in tumors of the rats in secondary immunodeficiency. This finding shows a profound damage of cell apoptosis in the animals after the splenectomy and more malignant character of tumors.
В настоящее время нет сомнений в том, что иммунные механизмы играют в организме важную роль задолго до появления клинически определяемой опухоли и продолжают играть значимую роль и после избавления от нее [5, 6]. Активность опухолевого роста определяется равновесием между противоопухолевыми и пробластомными факторами, способствующими росту опухоли [5, 12].
Сложные механизмы взаимодействия злокачественной опухоли и иммунной системы отражают важнейшую функцию иммунной системы - регулирование процессов регенерации и размножения клеток [4, 13]. Возможно, что специфический иммунитет ответствен не за уничтожение злокачественных клеток, а за регуляцию их роста и развития. Механизмы же неспецифической иммунной защиты, согласно последним данным, могут иметь решающее значение в предотвращении онкологических заболеваний [6, 9].
В качестве основной экспериментальной модели развития вторичного иммунодефицита мы выбрали удаление селезенки (спленэктомию). Удаление селезенки порождает развитие постспленэктомического гипоспленизма, признаками которого являются уменьшение иммунологической резистентности, возможность развития «молниеносных постспленэктомических инфекций», а также увеличение заболеваемости острыми и хроническими вирусными и
* Исследование выполнено по госконтракту № 02.740.11.0708 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.
бактериальными инфекциями [19]. Это связано с развитием иммунных нарушений клеточного и гуморального звена [15, 17].
В последние годы усилия морфологов и онкологов направлены на выявление дополнительных прогностических признаков, которые позволяют выяснить причины различного поведения опухолей в зависимости от исходного иммунного статуса [3, 7]. Важнейшими характеристиками злокачественного роста являются его гистологический вариант, степень дифференцировки и биологическая агрессивность [12]. Оценить биологическую агрессивность первичной опухоли можно, исследуя показатели ее пролиферативной активности, активности апоп-тоза, а также состояния ряда основных регуляторных рецепторов и систем [11, 14]. Для этого обычно исследуются белки-регуляторы клеточного цикла, гены-супрессоры опухолей, белки, регулирующие апоптоз клетки, интерлейкины, цитокины и многие другие регуляторные системы клетки [16, 20].
Таким образом, изучение перечисленных выше механизмов даст новое, более целостное, концептуальное представление о патогенезе канцерогенеза, что, в дальнейшем, позволит разработать более эффективные методы прогнозирования, мониторирования и лечения злокачественных новообразований.
Цель исследования - изучение канцерогенеза опухолей желудочнокишечного тракта (ЖКТ) у крыс, индуцированных 1,2-диметилгидразином в условиях вторичного иммунодефицита после удаления селезенки.
Материал и методы. Работа выполнена на 60 белых нелинейных крысах-самцах массой 180-220 г. Уход и содержание животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». В процессе эксперимента изучали общее состояние крыс, а также показатели иммунной системы животных.
Животные были разделены на четыре группы. Первая - интактные животные (15 крыс), вторая - животные после удаления селезенки (15 крыс). Крысам первой и второй групп (контрольные животные) вводили изотонический раствор хлорида натрия. Третья группа - животные с внутрибрюшинным введением канцерогена (1,2-диметилгидразин) из расчета 20 мг/кг 1 раз в неделю в течение четырех недель (15 крыс). Четвертая группа - спленэктомированные животные, которым через 30 суток после операции вводили канцероген в вышеуказанной дозе и интервалах (15 крыс). Выведение из эксперимента животных третьей и четвертой групп (опытные животные) проводилось через 90 и 150 суток после окончания курса введения канцерогена путем декапитации.
Объектом исследования служили органы ЖКТ и новообразования. При патоморфологическом исследовании у животных всех групп учитывались частота развития новообразований, их морфологические особенности, локализация.
В работе использовались следующие методы:
1. Для иммуногистохимического исследования были использованы четыре коммерческих моноклональных антитела фирмы 8аПа Сіте, разделенных на группы по функциональной значимости: 1) маркеры пролиферативной активности - РСКЛ, Кі-67; 2) маркер апоптоза - Ьс1-2; 3) супрессор опухолевого роста - р53. Результаты реакций оценивали, подсчитывая количество окрашенных ядер на 100 ядер в трех полях зрения и выражая полученные результаты в процентах.
2. Гистологические срезы опухолевой и прилежащей к ней ткани толщиной 3-4 мкм были окрашены гематоксилином и эозином. На светооптическом микроскопе оценивали степень дифференцировки опухоли, характер изменений эпителия и желез.
3. Морфометрический метод с использованием пакета программ Sigma Scan Pro для определения ядерно-цитоплазматического соотношения и количественных характеристик иммуногистохимических реакций.
Результаты исследования. При изучении пролиферативной активности наиболее популярными в качестве маркера являются антигены Ki-67 и PCNA. Присутствие их во всех фазах митотического цикла позволяет использовать данные белки в качестве универсальных маркеров пролиферации при оценке активности роста злокачественных новообразований [1]. В контрольной группе при исследовании органов ЖКТ единичные клетки базального слоя пищевода,
Рис. 1. Толстая кишка.
Введение канцерогена, 3 месяца. Формирование пролифератов эпителия крипт. Окраска гематоксилин-эозином. Ув.*400
Рис. 2. Пищевод. Введение канцерогена,
3 месяца. Очаговая лейкоплакия с признаками вирусного поражения эпителия в виде гиперкератоза (1), накопления оптически плотных гранул в цитоплазме (2) и появления койлоцитов (3). Окраска гематоксилин-эозином. Ув.х400
железистого эпителия и собственных желез желудка, единичные клетки каемчатого эпителия тонкой кишки и клетки крипт толстой кишки дают позитивную реакцию к этим маркерам в виде окрашивания ядер клеток.
Применение канцерогена существенно изменяет морфологическое строение органов ЖКТ у животных опытных групп (изолированное введение канцерогена и на фоне спленэктомии). Через 3 месяца в эпителии толстой кишки отмечается формирование пролифера-тов эпителия крипт (рис. 1). В под-слизистом слое вокруг пролифера-тов отмечается выраженная воспалительная инфильтрация с образованием лимфоидных узелков. В дистальном отделе пищевода была отмечена очаговая лейкоплакия с признаками вирусного поражения эпителия в виде койлоцитоза и накопления оптически плотных гранул в цитоплазме клеток, аналогичными таковым у человека при инфицировании вирусом папилломы (рис. 2). В эпителии желудка достоверных отличий морфологического строения по сравнению с таковым у животных контрольной группы не выявлено. Иммуноги-стохимическая реакция к маркерам
клеточной пролиферации демонстрирует яркую позитивную реакцию в ядрах желез кишечных крипт. Ю-67 выявляется более чем в 30% клеток, а РСКЛ -более чем в 50%. Пролиферация клеток в эпителии пищевода менее выражена, но достоверно выше, чем у контрольной группы животных.
Через 5 месяцев после окончания курса введения канцерогена у крыс опытных групп формировались от одной до трех макроскопически определяемых опухолей проксимального отдела толстой кишки размером от 0,4 до 0,6 см. Гистологически новообразования имели структуру высокодифференцированной аденокарциномы (рис. 3). Отмечалась глубокая инвазия опухолевых клеток в стенку кишки с переходом на околокишечную клетчатку. У двух крыс (17%) на фоне спленэктомии выявлены метастазы в печень, тогда как у крыс с изолированным введением канцерогена метастазы не определялись. Регионарные лимфатические узлы у животных обеих групп были интактны. У 42% крыс на фоне спленэктомии помимо опухолей толстой кишки отмечалось формирование множественных изъязвлений слизистой оболочки дистального отдела пищевода. При микроскопическом исследовании в них выявлялись признаки лейкоплакии с па-пилломатозом и акантозом, а также дисплазии многослойного плоского неороговевающего эпителия (рис. 4).
У двух животных (17%) изменения соответствовали внутриэпителиаль-ному плоскоклеточному раку с очагами микроинвазии. Маркеры клеточной пролиферации демонстрировали яркую реакцию ядер у 100% клеток к РСКЛ и 56% - к К>67.
Белок р53 является центральным компонентом системы, которая обеспечивает экстренное удаление поврежденных и потенциально опасных для организма клеток. Поэтому инактивация его функции является наиболее универсальным молекулярным изменением в различных опухолях [18]. У контрольной группы животных супрессор опухолевого роста (белок р53) выявляется в виде равномерного окрашивания ядер в единичных клетках базального слоя эпителия и клетках стромы всех отделов ЖКТ крыс. Через 3 месяца после окончания введения канцерогена белок р53 выявляется практически во всех ядрах клеток желез, а также очагово - в эпителии пищевода (до 10% ядер в группе с изолированным введением канцерогена и до
Рис. 3. Толстая кишка. Введение канцерогена, 5 месяцев. Высокодифференцированная аденокарцинома проксимального отдела. Окраска гематоксилин-эозином. Ув.*400
Г
Рис. 4. Пищевод. Введение канцерогена на фоне спленэктомии, 5 месяцев. Изъязвление слизистой оболочки с признаками лейкоплакии. Окраска гематоксилин-эозином. Ув.*400
20% - на фоне спленэктомии). Иммуногистохимическое исследование опухолей толстой кишки через 5 месяцев после введения канцерогена выявляло гиперэкспрессию белка р53 у 74% спленэктомированных крыс и лишь в 42% - у неопери-рованных животных. Антиген р53 был также отмечен в метастазах опухоли. При исследовании слизистой оболочки дистального отдела пищевода в опытной группе на фоне спленэктомии выявлена яркая ядерная реакция в базальном и па-рабазальном слое многослойного плоского эпителия в зоне лейкоплакии, а в участках дисплазии и внутриэпителиальной карциномы - практически по всей высоте эпителия (диффузная реакция у 45% клеток).
Белок Ьс1-2 в настоящее время считают одним из основных ингибиторов апоптоза, который может способствовать прогрессированию опухоли [2]. У ин-тактных животных белок Ьс1-2 выявляется лишь в единичных клетках эпителия тонкой и толстой кишки. У контрольных животных после спленэктомии его экспрессия выше на 10-15%. Через 3 месяца после введения канцерогена выявляе-мость белка Ьс1-2 составляет не более 10% в клетках пролифератов кишечных крипт и в немногочисленных клетках базального слоя эпителия пищевода. Через 5 месяцев иммуногистохимическая реакция к Ьс1-2 в опухолях была негативна, а в участках лейкоплакии и дисплазии слизистой оболочки дистального отдела пищевода была отмечена цитоплазматическая реакция в базальном слое клеток.
Обсуждение полученных данных. Как показали наши исследования, злокачественные новообразования развиваются у крыс как после изолированного применения канцерогена, так и на фоне спленэктомии, однако в последней группе канцерогенез протекает иначе. Это проявляется в развитии мультицентриче-ского рака различного гистогенеза, более агрессивным морфологическим фенотипом опухолей и ранним появлением отдаленных метастазов.
Иммуногистохимическое изучение участков тонкой и толстой кишки с опухолевым ростом у крыс с изолированным введением канцерогена выявило положительную реакцию к маркерам клеточной пролиферации. Если через 3 месяца лишь 30 и 50% ядер желез пролифератов давали соответственно положительную реакцию на белок Ю-67 и РСКЛ, то через 5 месяцев - уже у 42 и 76% ядер клеток выявлялась позитивная реакция. В опытной группе животных на фоне спленэктомии эта реакция составила 56 и 100%, соответственно.
Таким образом, наши данные согласуются с результатами Н.А. Горбань (2008), которая обнаружила прямую зависимость уровня К1-67 и РСКЛ с агрессивностью роста опухоли. Кроме того, нами установлена четкая связь между пролиферативной активностью и степенью дифференцировки опухоли, но слабая зависимость уровня К1-67 и РСКЛ с выявлением отдаленных метастазов.
Как известно, клеточное постоянство любого органа регулируется генетическими программами, одна из которых определяет интенсивность клеточного деления, другая - клеточную гибель (апоптоз). В настоящее время принято считать, что гены, участвующие в регуляции роста и развития опухолей (онкогены и гены-супрессоры опухолей), играют регулирующую роль в индукции апоптоза. К ним относятся белок Ьс1-2, который ингибирует апоптоз, вызванный гормонами и цитокинами, и приводит тем самым к удлинению жизни клетки [10, 21]. Сюда же относят белок р53, который в норме активирует апоптоз, но при мутации (что обнаружено в некоторых опухолях) повышает выживаемость клеток [8, 12].
Также установлено, что коэкспрессия мутантного белка р5З и ингибитора апоптоза bcl-2, а также маркеров пролиферативной активности Ki-67 и PCNA является значимым прогностическим фактором при раке. Гиперэкспрессия белка р53 и высокий уровень Ki-67 имеют потенциально неблагоприятный прогноз, связанный с высоким риском развития рецидивов, низкой выживаемостью, а также наличием метастазов [8]. Именно это и наблюдается в нашем эксперименте у крыс с введением канцерогена на фоне спленэктомии.
Опухолевый рост сопровождается реакцией со стороны иммунной системы [б]. Иммунный статус зависит как от типа опухоли, стадии процесса, так и от индивидуальных особенностей организма. Недостаточность иммунной системы, в свою очередь, может привести в развитию опухоли [19]. Удаление селезенки приводит к стойкому снижению CD3 и CD4, фактора некроза опухоли, ИЛ-1 и 2, а-интерферона, дисбалансу в гуморальном звене иммунитета [15, 17]. В связи с этим не развивается адекватный иммунный ответ, направленный на уничтожение опухолевой ткани за счет работы компонентов противоопухолевой защиты (как клеточных, так и гуморальных). Кроме того, в связи с развитием постспленэктомического гипоспленизма и значительным дисбалансом иммунной и эндокринной системы развивающаяся опухоль быстро ускользает от иммунного надзора за счет факторов иммунорезистентности опухоли (выделение растворимых опухолевых антигенов, приобретение устойчивости к апоп-тозу клеток за счет потери рецептора к фактору некроза опухоли, продукция в большом количестве ИЛ-б и ИЛ-Ю).
Мы полагаем, что выявленные после спленэктомии агрессивность роста опухоли, развитие синхронного рака разных отделов ЖКТ и ранние отдаленные метастазы могут быть связаны с появлением в крови проопухолевых факторов (блокирующих антител, циркулирующих иммунных комплексов, про-стагландинов Е2, ИЛ-Ю, ИЛ-12, у-интерферона и других).
Литература
1. Абелев Г.И. Дифференцировочные антигены в опухолях - зависимость от механизмов канцерогенеза и прогрессии // Молекулярная биология. 2GG3. Т. 37, № 1. С. 4-11.
2. Абросимов А.Ю., Лушников Е.Ф. Гибель клетки (апоптоз). М.: Медицина, 2GG1. 192 с.
3. Алексеенко О.Н., Храновская Н.К., Болгова Л.Г., Гриневич Ю.А. Цитоморфологические особенности дендритных клеток // Цитология и генетика. 2GG6. Т. 4G, N° 1. С. бб-б9.
4. БабаеваА.Г. Регенерация и система иммуногенеза. М.: Медицина, 1985. 165 с.
5. Балицкая О.В., БилынскийБ.Г., ВинницкаяА.Б. Справочник по онкологии. М.: Медицина, 2GG9. 56G с.
6. БережнаяН.М., Чехун В.Ф. Иммунология злокачественного роста. М.: Медицина, 2GG5. 79G с.
7. Бурлака А.П., Сидорик Е.П. Активные формы оксида азота при опухолевом процессе. Киев: Наук. думка, 2GG6. 228 с.
8. Горбань Н.А. Клинико-морфологическая и иммуногистохимическая характеристика и прогностические критерии плоскоклеточного рака гортани: автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2GG8. 25 с.
9. ДолгихВ.Т. Опухолевый рост. М.: Медицинская книга, 2GG1. 79 с.
1G. ДубиковА.И. Роль апоптоза и оксида азота в патогенезе ревматоидного артрита: автореф. дис. ... докт. мед. наук. М., 2GG5. 45 с.
11. Енгай Д.А. Иммунологическая характеристика Pgp17G - позитивного рака молочной железы: автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2GG8. 33 с.
12. Завалишина Л.Э. Молекулярно-биологические факторы инвазивного роста и метастазирования рака при морфологическом исследовании: автореф. дис. ... докт. биол. наук. М., 2GG6. 45 с.
13. ЗемсковВ.М., ЗемсковАМ., ЗолодеевВ.И. Особенности коррекции иммунологических расстройств при различных патологических состояниях // Успехи современной биологии. 1994. Т. 114. С. 44G-445.
14. Ким Е.А. Прогностическое значение исследования маркеров ангиогенеза у больных первичным раком молочной железы: автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2GG9. 25 с.
15. Павловский М.П., Чуклин С.Н., Орел Г.Л. Влияние спленэктомии на иммунологическую реактивность // Хирургия. 1986. № 6. С. 136-141.
16. Петрищев Н.Н., Васина Л.В., Луговая А.В. Содержание растворимых маркеров апоптоза и циркулирующих аннексин V-связанных апоптотических клеток в крови больных острым коронарным синдромом // Вестник Санкт-Петербургского университета. 2008. Вып. 1. С. 14-23.
17. Стручко Г.Ю. Морфофункциональное исследование тимуса и иммунобиохимических показателей крови после спленэктомии и иммунокоррекции: автореф. дис. ... докт. мед. наук. Саранск, 2003. 23 с.
18. Тюляндин СА., Моисеенко ВМ. Практическая онкология. Избранные лекции. М.: Медицина, 2004. 784 с.
19. Усеинов Э.Б., Исаев А.Ф., Киселевский М.В., Алимов А.Н. Проблема послеоперационных гнойносептических осложнений при травме живота с повреждением селезенки в свете иммунных нарушений // Хирургия. Журнал имени Н.И. Пирогова. 2006. № 2. С. 38-43.
20. Harada-ShibaM, KinoshitaM. Oxidized low density lipoprotein induces apoptosis in cultured human umbilical vein endothelial cells by common and unique mechanisms // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 9681-9687.
21. Hughes P., Bouillet P., Strasser A. Role of Bim and other Bsl-2 family members in autoimmune and degenerative diseases // Curr. Dir. Autoimmun. 2006. Vol. 9. P. 74-94.
СТРУЧКО ГЛЕБ ЮРЬЕВИЧ. См. с. 383.
МЕРКУЛОВА ЛАРИСА МИХАЙЛОВНА. См. с. 383.
МОСКВИЧЕВ ЕВГЕНИЙ ВАСИЛЬЕВИЧ. См. с. 383.
КОСТРОВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА. См. с. 383.
МИХАЙЛОВА МАРИНА НИКОЛАЕВНА. См. с. 383.
ДРАНДРОВА ЕЛЕНА ГЕННАДЬЕВНА. См. с. 383.
МУХАММАД ЗАХИД - клинический ординатор кафедры функциональной и лабораторной диагностики, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары.
MUHAMMAD ZAHID - medical residents of Functional and Laboratory Diagnostic Department, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
УДК 546.23+546.47+546.74: 616.342-002.44-092(470.344) Л.В. ТАРАСОВА, ТЕ. СТЕПАШИНА
ОСОБЕННОСТИ СОДЕРЖАНИЯ СЕЛЕНА, ЦИНКА И МАРГАНЦА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ У ЗДОРОВЫХ ЖИТЕЛЕЙ ЧУВАШИИ И ПАЦИЕНТОВ С ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ЖЕЛУДКА И ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ
Ключевые слова: язвенная болезнь, хронический гастрит, селен, цинк, марганец.
Проанализировано содержание селена (Se), цинка (Zn), марганца (Mn) в сыворотке крови практически здоровых жителей Чувашии, а также пациентов с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ЯБДК) и хроническим гастритом (ХГ). Обследовано 290 человек, из которых 90 — пациенты с обострением ЯБДК, 100 — с ХГ; контрольная группа — 100 практически здоровых жителей г. Чебоксары и Аликовского района республики. Выявлена недостаточная обеспеченность Se у 69,2% практически здоровых людей (среднее значение равно 0,11±0,003 мкг/г). Уровень Zn в сыворотке крови жителей Чувашии ниже оптимальных значений (0,85-1,5 мкг/г по А.П. Авцыну) обнаружен у 67,7% обследованных. У больных с ЯБДК и ХГ по сравнению с контрольной группой отмечено увеличение содержания Se, Zn и Mn.
L.V. TARASOVA, T.E. STEPASHINA CHARACTERISTICS OF SELENIUM, ZINK, MAGNESE CONCENTRATIONS IN BLOOD SERUM OF HEALTHY PEOPLE OF THE CHUVASH REPUBLIC AND PATIENTS WITH GASTER AND DUODECADACTYLON INFLAMMATORY DISEASES Key words: ulcer, chronic gastritis, selenium, zinc, manganese.
We aimed to analyze blood serum selenium (Se), zinc (Zn), manganese (Mn) concentrations of practically healthy people of the Chuvash Republic and patients with duodenal ulcer and chronic gastritis.
290 people were studied, of whom 90 had an acute condition of duodenal ulcer and 100 had chronic gastritis; the control group included 100 practically healthy inhabitants of Cheboksary and Alikovskiy District of the Chuvash Republic. In the course of the investigation it was revealed that 69,2°% ofpractically healthy people had Se deficiency (the mean value is 0,11±0,003 ^g/g). Blood serum Zn concentration of 67,7% of the examined inhabitants was below normal (0,85-1,5 ug/g according to A.P. Avt-syn). The Se, Zn and Mn concentrations rise was marked for the patients with duodenal ulcer and chronic gastritis as compared with the control group.
Согласно современным представлениям, ключевая роль в патогенезе многих заболеваний органов пищеварения отводится микроэлементному дисбалан-
